基于Cytb基因的滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質資源保護區(qū)3種鲌魚的遺傳多樣性分析

李大命 劉洋 唐晟凱 劉燕山 蔡永久 谷先坤 殷稼雯 蔣琦辰 張彤晴

(1 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點實驗室，江蘇南京 210017；2 南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇南京 210046； 3 中國科學院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，江蘇南京 210008)

翹嘴鲌(Culteralburnus)、達氏鲌(Culterdabryi)、蒙古鲌(Cultermongolicus)均隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鯉科( Cyprinidae)，鲌亞科(Culterinae)，鲌屬(Culter)[1]。鲌魚在我國分布廣泛，是內(nèi)陸水域中重要的經(jīng)濟魚類，在很多湖泊及水庫中的漁獲量較大[2-4]。鲌魚肉質細嫩、味道鮮美，富含多種氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值[5]。作為湖泊和水庫生態(tài)系統(tǒng)中主要的頂級消費者，鲌魚的種群變動對于魚類及其他生物群落都具有重要影響，在水生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)價值[6-7]。近年來，由于過度捕撈、棲息地改變、水質污染等人為因素影響，鲌魚天然資源急劇衰退，并呈現(xiàn)出低齡化、小型化的趨勢，保護鲌魚種質資源刻不容緩[8-10]。

國家級水產(chǎn)種質資源保護區(qū)是為了實現(xiàn)水產(chǎn)種質資源及其生存環(huán)境的保護和合理利用，依法予以特殊保護和管理的水產(chǎn)種質資源主要生長繁殖區(qū)域。滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質資源保護區(qū)位于江蘇省常州市武進區(qū)西南處滆湖水域的北端，保護區(qū)面積為1 520 hm2，其中核心區(qū)面積509 hm2，實驗區(qū)面積1 011 hm2，保護期為全年，主要保護對象為翹嘴鲌、蒙古鲌及達氏鲌。多年來，受氣候變化、過度捕撈、環(huán)境污染、工程建設等因素的影響，水產(chǎn)種質資源保護區(qū)的保護對象生存受到巨大威脅，同時，對其遺傳狀況也缺乏了解[11]。

遺傳多樣性是評價物種資源狀況的1個重要指標，也是物種適應周圍環(huán)境變化、維持生存和進化的基礎，研究物種的遺傳多樣性對于評估物種資源現(xiàn)狀、制定野生種群保護策略以及合理利用種質資源等方面具有重要意義[12-13]。魚類的線粒體基因組是1種雙鏈DNA分子，具有分子小、結構簡單、編碼效率高、母系遺傳、重組率低、進化速率快等特點，已成為群體遺傳學和系統(tǒng)學研究的重要分子標記[14-15]。細胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因長度適宜，進化速度適中，有通用引物便于擴增，因而是研究魚類遺傳變異的良好的分子標記[16-18]。本研究采用Cytb基因序列，首次對滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質資源保護區(qū)主要保護對象的遺傳多樣性和遺傳結構進行了研究，研究結果一方面用于評估保護區(qū)對象的種質資源現(xiàn)狀，另一方面可為魚類種質資源的科學保護及合理利用提供基礎資料及參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 魚類樣品采集和處理

2019年7月至11月和2020年5月、9月，在滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質資源保護區(qū)開展?jié)O業(yè)資源調(diào)查。利用3層刺網(wǎng)采集魚類樣本，刺網(wǎng)網(wǎng)長125 m，網(wǎng)高1.5 m，網(wǎng)目長度為2～14 cm。魚類種類鑒定依據(jù)《江蘇魚類志》[2]，共采集翹嘴鲌25尾，蒙古鲌18尾，達氏鲌50尾?，F(xiàn)場剪取樣本的肌肉組織，置于無水乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

采用TakaraBio公司的廣譜性基因組試劑盒提取魚類肌肉組織的基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA完整性，并利用紫外分光光度計測定DNA濃度。

利用通用引物L14724和H15915[19]擴增Cytb基因序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增體系為50 μL，其中Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，剩余體積用超純水補足。PCR程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，將條帶清晰的擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析

利用BioEdit 7.0軟件[20]讀取序列，進行編輯和比對，并輔以人工校正。利用DnaSP 5.0軟件[21]分析序列的變異位點、簡約信息位點、單一信息位點，計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性(haplotype diversity,h)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)以及平均核苷酸差異數(shù)(K)。使用MEGA 6.0軟件[22]計算序列的堿基組成、種群內(nèi)及種群間的遺傳距離，以鯉為外類群，選用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建鲌魚的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Arlequin 3.11軟件[23]進行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，并開展核苷酸不配對分布檢測，進行種群動態(tài)分析。

2 結果

2.1 線粒體Cytb基因序列堿基組成

經(jīng)分析和比對，獲得3種鲌魚的線粒體Cytb基因全序列，其全長為1 141 bp，所有序列均無堿基插入或缺失。3種鲌魚的堿基組成相似，種類之間差異很小。3種鲌魚堿基A、T、C、G的平均含量分別為28.9%、27.5%、28.8%和14.8%，A+T的含量(56.4%)高于G+C的含量(43.6%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。A+T含量的排列順序由高到低依次為達氏鲌(56.8%)、蒙古鲌(56.4%)和翹嘴鲌(56.0%)(見表1)。

表1 3種鲌魚線粒體Cytb基因序列的堿基組成

2.2 遺傳多樣性和單倍型組成

翹嘴鲌的線粒體Cytb基因序列有16個變異位點，其中9個單一信息位點，7個簡約信息位點，單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.907和0.002 4；蒙古鲌Cytb基因序列有8個變異位點，全部是簡約信息位點，其單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.863和0.002 4；達氏鲌Cytb基因序列有10個變異位點，其中3個單一信息位點，7個簡約信息位點，其單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.573和0.001 2(見表2)。單倍型多樣性(h)從高到低依次為翹嘴鲌、蒙古鲌和達氏鲌，核苷酸多樣性(π)從高到低依次為蒙古鲌、翹嘴鲌和達氏鲌。

表2 3種鲌魚線粒體Cytb基因的遺傳多樣性參數(shù)

翹嘴鲌群體由14種單倍型(QH1～QH14)組成，單倍型QH2的數(shù)量最多，有10個樣本，QH4和QH8各有2個樣本，其余單倍型各有1個樣本；蒙古鲌群體由6種單倍型(MH1～MH6)組成，單倍型MH1的數(shù)量最多，有10個個體，單倍型MH2、MH3和MH4各有2個個體，單倍型MH5和MH6各有1個個體；達氏鲌群體由7種單倍型(DH1～DH7)組成，單倍型DH1的數(shù)量最多，有31個個體，單倍型DH6有11個個體，單倍型DH3、DH5和DH7各有2個個體，其余單倍型各有1個個體(見表2)。

2.3 遺傳距離

3種鲌魚的種內(nèi)遺傳距離顯示(見表3)，達氏鲌、翹嘴鲌和蒙古鲌群體內(nèi)的平均遺傳距離分別為0.001、0.002和0.002。3種鲌魚群體間的遺傳距離為0.053～0.072，其中翹嘴鲌和蒙古鲌間的遺傳距離最大，翹嘴鲌和達氏鲌間的遺傳距離最小。

表3 3種鲌魚的群體內(nèi)(對角線)及群體間(下三角)遺傳距離

以鯉為外類群，基于鄰接法(NJ)構建3種鲌魚的單倍型系統(tǒng)進化樹(見圖1)。結果顯示，3種鲌魚均形成獨立的進化分支，分支置信限水平均為100%，鯉單獨聚為一支，說明Cytb基因是區(qū)分和鑒別3種鲌魚的有效分子標記。

圖1 基于鄰接法的3種鲌魚系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 種群進化歷史

對3種鲌魚進行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，結果顯示(見表4)，中性檢驗的D值和Fs值均為負值，且翹嘴鲌Fs值統(tǒng)計檢驗結果具有顯著性(P<0.05)，說明3種鲌魚在進化過程中偏離了中性選擇。另外，3種鲌魚的歧點分布圖(見圖2)呈較明顯的單峰型，結合中性檢驗結果，表明3種鲌魚在歷史上經(jīng)歷了種群擴張。

表4 3種鲌魚的中性檢驗結果

圖2 3種鲌魚Cytb基因序列錯配堿基分布

3 討論

3.1 3種鲌魚的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，也是評價生物種質資源狀況及制定種質資源保護措施的重要依據(jù)。通常選用單倍型多樣性(h)及核苷酸多樣性(π)兩個參數(shù)用于評價群體的遺傳多樣性水平，h和π值越大，表示群體的遺傳多樣性越豐富[24-25]。本研究結果顯示，滆湖鲌類保護區(qū)3種鲌魚的單倍型多樣性為0.573～0.907，核苷酸多樣性0.001 2～0.002 4，其中翹嘴鲌和蒙古鲌的遺傳多樣性水平較高，達氏鲌的遺傳多樣性水平較低，說明保護區(qū)內(nèi)3種鲌魚的遺傳多樣性存在較大差異。同樣，其他水域不同種類的鲌魚群體遺傳多樣也有明顯差異[26-28]。基于COI序列的三峽庫區(qū)翹嘴鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0～0.990 5和0～0.014 1，蒙古鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.866 7～1.0和0.002 2～0.002 4，達氏鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0～1和0～0.071 5[26]；基于COI序列的長江中下游5個達氏鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.412 3(0～0.600)和0.001 1(0～0.001 5)[27]，5個蒙古鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.664(0～0.800)和0.002(0～0.003)[28]。根據(jù)Grant和Bowrn[29]提出的魚類遺傳多樣性大小標準，即單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別以0.5和0.005為界值，本研究中3種鲌魚的遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式，這種遺傳多樣性模式是魚類受瓶頸效應后種群數(shù)量迅速擴張導致的。由于核苷酸多樣性所需的時間比積累單倍型所需的時間漫長，因而形成高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。另外，這種遺傳多樣性模式暗示，3種鲌魚群體在進化歷史上經(jīng)歷過群體擴張事件。3種鲌魚的中性檢驗結果顯示，Tajima’sD值和Fu’sFs值均為負值，且翹嘴鲌統(tǒng)計檢驗結果具有顯著性，同時，3種鲌魚的歧點分布圖呈現(xiàn)較明顯的單峰型，表明3種鲌魚在進化歷史上經(jīng)歷過種群擴張過程[30-32]，與其遺傳多樣性模式相對應。

3.2 3種鲌魚的遺傳結構

研究表明，基于mtDNA序列的魚類種內(nèi)遺傳變異在10%以內(nèi)[33]。Hebert等[34]基于COI序列對動物間的遺傳變異進行研究，結果表明，種內(nèi)遺傳距離大多在2%以下，種間遺傳距離比種內(nèi)遺傳距離大10倍以上。本研究結果顯示，3種鲌魚的種內(nèi)遺傳距離在0～0.006，種內(nèi)遺傳變異遠小于2%，表明3種鲌魚的種內(nèi)遺傳變異較小。這是因為保護區(qū)面積相對較小，沒有地理隔離限制，3個群體的種內(nèi)個體間具有廣泛的基因交流。從群體的遺傳組成來看，群體的遺傳結構趨于單一化，單個單倍型占群體的比例較高。比如，翹嘴鲌由14種單倍型組成，單倍型QH2有10個，占比為40.0%；蒙古鲌由6種單倍型組成，單倍型MH1有10個，占比為55.6%；達氏鲌由7種單倍型組成，單倍型DH1的數(shù)量為31個，占比高達62.0%?？赡苁且驗?種鲌魚的有效群體數(shù)量較小，導致遺傳結構受遺傳漂變的影響較大，因而形成單一化的遺傳結構模式[35]。

3.3 種質資源管理和保護建議

鲌魚具有重要的經(jīng)濟價值、營養(yǎng)價值和生態(tài)價值，但近年來，其種群資源量急劇下降，并呈現(xiàn)出小型化、低齡化的趨勢。本研究結果顯示，保護區(qū)3種鲌魚的單倍型多樣性較高，而核苷酸多樣性較低，遺傳結構趨于單一化。結合滆湖生態(tài)環(huán)境和鲌魚的生物學特征，需要采取針對性措施恢復鲌魚資源，提高鲌魚群體的遺傳多樣性水平。建議：(1)開展鲌魚增殖放流，增加魚類種群數(shù)量，優(yōu)化魚類遺傳結構；(2) 控制滆湖環(huán)境污染，治理藍藻水華，改善魚類棲息環(huán)境；(3)建設人工魚巢，構建水域生態(tài)牧場，增加鲌魚產(chǎn)卵和孵化的基質和空間；(4)嚴格漁業(yè)執(zhí)法，嚴厲打擊非法捕撈行為，保護魚類繁殖和生長。