紅小豆中總黃酮含量的不確定度評估

蔡玉紅，張之鑫，宋志峰，魏春雁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室（長春），吉林長春130033）

紅小豆（Phaseolus angularis Adzukibean），別名赤小豆、紅豆、小豆，屬于豆科一年生草本植物，原產(chǎn)于我國喜馬拉雅山一帶，屬于高營養(yǎng)的雜糧，在我國各地廣泛種植，有悠久的栽培歷史[1]。隨著檢測水平的提高，醫(yī)學(xué)研究的深入，紅小豆在增進(jìn)人們健康、體現(xiàn)“藥食同源”的功能方面越來越為人們所了解。紅小豆中的黃酮具有抗氧化功能，能夠很好的消除人體內(nèi)的氧自由基，可以有效的阻止細(xì)胞的衰老[2]。查閱文獻(xiàn)得知，植物中總黃酮含量測定的方法有色譜法、紫外分光光度法[3]、分光光度法等[4]，常用的黃酮提取方法主要有超聲波輔助提取法、乙醇浸提法、微波加熱提取法[5]等，不同的測定和提取方法對黃酮含量測量結(jié)果有一定的影響。目前國際通用的檢測報告要包含不確定度的評估，不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[6-8]。本文采用紫外分光光度法測定紅小豆中黃酮含量，并對測量結(jié)果不確定度分量逐一評估，探討了不確定度貢獻(xiàn)率較高的分量產(chǎn)生原因，提出改進(jìn)意見，降低合成不確定度總量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅小豆：市售；沒有產(chǎn)地標(biāo)簽。

蘆丁對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%，中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、石油醚等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

T6新世紀(jì)紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT124S電子天平：中國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；索氏提取器：上海那艾精密儀器有限公司；單標(biāo)吸管、容量瓶：天津市天波玻璃儀器有限公司（A級）。

1.2 試樣制備與測定

1）待測樣品紅小豆真空干燥恒重后，用高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)研磨，通過40目篩，密封干燥備用。

2）準(zhǔn)確稱取樣品3.0 g于索式提取器中（同時做8次重復(fù)），加入50mL石油醚溶液浸泡回流后[9-10]，倒出石油醚溶液，加入濃度70%乙醇溶液50mL浸泡回流，將合并提取液移入100mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容。用5mL移液管吸取4mL該溶液于25mL容量瓶中，依次加入70%乙醇溶液5mL、5%NaNO2溶液5mL、10%Al（NO3）3溶液3mL、8%NaOH溶液5mL，搖勻，最后用70%乙醇溶液定容至刻度。靜置10min后在紫外分光光度計于510 nm波長處，測量試液的吸光度。代入回歸方程計算，得出紅小豆中總黃酮類化合物（以蘆丁計）的含量（mg/mL）[11]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品6.5mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，既得0.064 5mg/mL系列蘆丁儲備液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線繪制

用10mL單線刻度吸管，分別吸取儲備液0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL 于 25 mL 容 量 瓶 中 ，同1.2.2依次加入反應(yīng)溶液搖勻定容，得到0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。與待測液相同條件下，以70%乙醇溶液做參比，測量蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，建立回歸方程[12]。

2 不確定度分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

試樣中黃酮元素含量計算公式

式中：X為試樣中黃酮的含量，mg/g；C為待測溶液中蘆丁的濃度，mg/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣取樣量，g；f為溶液稀釋倍數(shù)，25/4。

2.2 不確定度的來源

按照試驗(yàn)過程逐步篩選可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響的不確定度主要因素見圖1，包括，（1）制備待測液引入的不確定度，包括天平、量具和環(huán)境條件；（2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度，包括購買的標(biāo)準(zhǔn)溶液、配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液所用量具及實(shí)驗(yàn)員的熟練程度；（3）測定結(jié)果工作曲線擬合時引入的不確定度；（4）重復(fù)測定及儀器精密度引入的不確定度；（5）標(biāo)物添加回收引入的不確定度；（6）操作人員的熟練程度和其他可能引入不確定度的因素均包含在擴(kuò)展不確定度中。

圖1 不確定度來源與分析Fig.1 The sourceof uncertainty and analysis

2.3 不確定度分量評定

2.3.1待測液制備過程引入的不確定度urel（X制）

待測液制備過程包括試樣的稱量、提取和顯色定容3個步驟，期間使用了（0.1mg）天平、5mL移液管、25mL和100mL容量瓶。

2.3.1.1 試樣稱量引入的不確定度urel（X1）

萬分之一天平的示值不確定度，天平的計量證書指出，稱量誤差為±0.2mg，按矩形分布計算，則示值不確定度；稱量變動性（即稱量重復(fù)性）引入的不確定度

稱量帶來的不確定度為0.115 5mg

稱量帶來的相對不確定度

2.3.1.2 試樣提取、顯色、稀釋定容引入的不確定度urel（X2）

1）根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[13]規(guī)定計算，試樣提取、顯色、稀釋定容所用到的容量器具引入的不確定度見表1。

2）試樣提取用100mL的容量瓶定容，顯色、稀釋使用了5mL移液管和25mL容量瓶，該過程引入的相對不確定度計算如下：

表1 測定過程中容量器具引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab le1 The relative standard uncertainty from glasscontainer during the determ ination

最終，待測液制備過程產(chǎn)生的不確定度為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel（X標(biāo)）

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度包括購買的有證黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液及由此稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中引入的不確定度。

2.3.2.1 購買的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel（ρ1）

蘆丁的純度為99.2%，按均勻分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2.2 配制0.064 5mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液引入的不確定度urel（ρ2）

1）稱量6.5mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2）配制儲備液使用100mL容量瓶1次，引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2.3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ρ3）

配制系列濃度溶液用時分別使用10 mL吸管、25mL容量瓶各6次，由于在工作曲線的測量時平行測定3次，并設(shè)計了8次樣品重復(fù)，在此，不再重復(fù)評定。

則標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度urel（X擬）

參照標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度評定方法[14]，對本文標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)測定3次，取平均值，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度檢測結(jié)果及計算見表2。用最小二乘法進(jìn)行擬合，建立直線方程y=10.65x+0.005；R2=0.999。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度－吸光度結(jié)果及計算Table2 The resultsand calculation of Standard solution concentration－fluorescence intensity

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度為：

2.3.4 重復(fù)性[14-16]、儀器精密度（穩(wěn)定性）引入的不確定度urel（X重）

本方法從樣品制備，提取顯色反應(yīng)步驟復(fù)雜繁瑣，各環(huán)節(jié)的不確定度不易評定，可以通過樣品重復(fù)性和儀器平行性測定，綜合評定過程引入的不確定度分量。

準(zhǔn)確稱取3.0 g紅小豆樣品8份，同1.2.2方法提取制備待測液，每份待測液分取3次于紫外分光光度計上測定，樣品重復(fù)性測定結(jié)果見表3。

表3 樣品重復(fù)測定（總黃酮）結(jié)果Table3 Determ ination resultsof sam ple

被測溶液吸光度平均值：0.034，代入公式，試樣中

樣品重復(fù)性引入的不確定度：

樣品重復(fù)性引入的相對不確定度：

樣品中總黃酮的平均含量：7.08mg/g。RSD：1.326%；標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.093 88mg/g。

2.3.5方法回收率引入的不確定度urel（X回）

實(shí)驗(yàn)中有黃酮提取不完全、顯色干擾及量具轉(zhuǎn)移損失等因素，需要測定方法的回收率[17]。根據(jù)樣品測定結(jié)果等量添加對照品，按（1.2.2）制備待測液于紫外分光光度計上測定，計算結(jié)果回收率為96%～100%。

方法回收率引入的不確定度：

2.4 試樣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

已知試樣含量7.08mg/g，所以，試樣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 擴(kuò)展不確定度

2.6 檢測結(jié)果

2.7 不確定度分量影響比較

各不確定度分量的評定和比較，結(jié)果見圖2。

圖2 不確定度分量貢獻(xiàn)比較Fig.2 Comparison of contribution rate to theuncertainty component

3 討論

1）試驗(yàn)采用Bottom-Up不確定度評定方法，方法精確，但計算繁瑣也容易引起分量遺漏或重疊，要求評定人員仔細(xì)認(rèn)真，既不遺漏也不重復(fù)。2）采用紫外分光光度法測定總黃酮含量時，以70%乙醇作為溶劑提取，提取完全簡便。3）黃酮屬于有機(jī)大分子成分，測定過程中，提取、顯色及比色對測量結(jié)果影響較大，所以要通過評定準(zhǔn)確度引入測量不確定度的量，判斷測量方法、測量條件是否合適。4）由圖2可知，最小二乘法擬和曲線引入的不確定度最高，可能是配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍較寬，實(shí)驗(yàn)中考慮初步判斷黃酮含量之后，再用濃度接近，范圍較窄的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。5）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制和回收率引入的不確定度較高，對合成不確定度有一定的貢獻(xiàn)，熟練的試驗(yàn)員改用精度較高的移液器可適量降低不確定度，樣品制備引入的不確定度對測量結(jié)果影響不大，可以忽略。

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收稿日期：2017-02-08