牦牛源富硒鼠李糖乳桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)

孫建春，吳征王，鄒雨婷，石 斌，吳慶俠，董海龍，田發(fā)益

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，拉薩 850013；2.渠縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，四川 達(dá)州 635200；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850004；4.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

硒（Selenium，Se）是生命必需的一種微量元素，是硒代半胱氨酸和含硒酶如過氧化物酶的必需組分，在抗癌、抗氧化等方面發(fā)揮重要作用［1］。硒是許多酶活性中心的必需組分，具有抗氧化、保護(hù)心血管和心肌健康、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫等作用［2，3］。1973年世界衛(wèi)生組織（WHO）確認(rèn)，硒是人體必需的微量元素，缺硒會(huì)導(dǎo)致心腦血管病、高血壓綜合征、肝病、糖尿病、胃腸道病、哮喘、癌癥等40余種并發(fā)癥［4］。世界衛(wèi)生組織公布的資料表明，全球有40多個(gè)國(guó)家屬于低硒或缺硒地區(qū)。中國(guó)是國(guó)際公認(rèn)的“缺硒大國(guó)”之一，有72%的縣（市）低硒或缺硒，其中30%為嚴(yán)重缺硒地區(qū)，7億多人口存在不同程度的硒攝入不足［5］。補(bǔ)硒的來源主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒，而無機(jī)硒的毒性比有機(jī)硒的毒性大，同時(shí)有機(jī)硒的安全性更高，不易發(fā)生硒中毒，也易被機(jī)體吸收，所以特別受青睞［6］。本研究通過對(duì)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）富硒條件的探索，尋找出最適宜鼠李糖乳桿菌富硒的條件，為生產(chǎn)牦牛源富硒乳酸菌的產(chǎn)品提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（西藏農(nóng)牧學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存），乳酸桿菌選擇性肉湯（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180615），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV6600型紫外可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；移液槍及槍頭（凝科辦公用品專營(yíng)店）；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LRH-150型生化培養(yǎng)箱（江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司）；HDL-4型臺(tái)式離心機(jī)（常州市鴻科儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 富硒鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng) 將鼠李糖乳桿菌從-80℃的冰箱中取出，復(fù)蘇，傳至第3代。采用正交設(shè)計(jì)軟件（正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案（表1）。將亞硒酸鈉配制為高濃度溶液以便后續(xù)加入到乳酸桿菌選擇性肉湯中，加入亞硒酸鈉最終濃度為6、8、10、12μg/mL［7］。使用復(fù)蘇后的乳酸桿菌在超凈工作臺(tái)中按照1%（w/v）接種量接種至乳酸桿菌選擇性肉湯中，按照不同的培養(yǎng)溫度（36、37、38、39℃）、不同的加入亞硒酸鈉時(shí)間（4、6、8、10 h），再加入不同濃度的亞硒酸鈉溶液，恒溫培養(yǎng)24 h，每組重復(fù)3次取平均值。

表1 鼠李糖乳桿菌富硒正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取6μg/mL的亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別加入到100 mL的燒杯中，加去離子水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2 Na溶液1 mL，搖勻，并用1∶1的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，各加入0.5%DAB溶液4 mL，搖勻，置于暗處30～50 min，再用5%NaOH調(diào)節(jié)pH至6～7，置于分液漏斗中，加入6 mL甲苯振搖2 min，靜置分層，棄去水層，收集甲苯層于比色皿中，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌中富硒量的測(cè)定 將鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，棄上清液，使用去離子水清洗3次，將附著于菌體表面的硒洗去，最終放置在65℃的烘箱中烘至恒重，烘干后的重量減去加入菌體之前的重量即為菌體的重量［9］。將烘干稱重后的乳酸桿菌轉(zhuǎn)移至帶刻度的試管中，加入硝酸-高氯酸溶液（體積比為5∶1）0.6 mL，放置過夜。然后將試管置于100℃水浴鍋中加熱4 h。當(dāng)試管內(nèi)黃褐色氣體排盡后，取出冷卻，加入30%過氧化氫溶液2 mL，繼續(xù)置于沸水浴中消化，至消化液呈無色或淡黃色即達(dá)終點(diǎn)。取出試管冷卻后，用去離子水定容至10 mL，同時(shí)做空白對(duì)照［10］。以空白對(duì)照調(diào)零，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1）富硒率的計(jì)算。

2）富硒量的計(jì)算。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

使用配制的亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度，以亞硒酸鈉中硒含量為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，硒含量在0.457～2.283μg/mL時(shí)，吸光度與硒含量成良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.124 6x-0.011 9（R2=0.998 6）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 鼠李糖乳桿菌富硒量分析

從表2可知，硒轉(zhuǎn)化率最高的組為1-3組，其硒轉(zhuǎn)化率為85.04%，鼠李糖乳桿菌菌體富硒量高達(dá)5 648.004μg/g，但2-3組的硒轉(zhuǎn)化率為74.72%，菌體富硒量高達(dá)5 901.243μg/g。當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，硒轉(zhuǎn)化率都比較低，最大硒轉(zhuǎn)化率只有36.80%。當(dāng)溫度為37℃時(shí)，硒轉(zhuǎn)化率明顯比36℃培養(yǎng)時(shí)高很多，最低為47.81%、最高為62.95%，并且隨著亞硒酸鈉濃度的升高，其硒轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)，說明亞硒酸鈉對(duì)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)溫度為38℃時(shí)，其硒轉(zhuǎn)化率普遍較高，最高為85.04%，最低為50.34%，并且也是隨著亞硒酸鈉濃度的升高，硒轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度為38℃時(shí)，10μg/mL亞硒酸鈉菌液比12μg/mL亞硒酸鈉菌液更有利于轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉，其原因是加入亞硒酸鈉的時(shí)間不同，12μg/mL的亞硒酸鈉加入時(shí)間為第6 h，但10μg/mL的亞硒酸鈉加入時(shí)間為第4 h。這種現(xiàn)象從側(cè)面反映出高濃度亞硒酸鈉對(duì)鼠李糖乳桿菌轉(zhuǎn)化硒有抑制作用，加入亞硒酸鈉的時(shí)間最好為鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，其硒轉(zhuǎn)化率也較低，最高為40.22%、最低為36.73%，但鼠李糖乳桿菌的量并沒有減少；培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)不會(huì)受到抑制，但會(huì)抑制其轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉。當(dāng)亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時(shí)，培養(yǎng)出來的菌體全部變?yōu)榧t色，原因是亞硒酸鈉濃度太高，亞硒酸鈉表面有析出的硒單質(zhì)。單質(zhì)硒的形成機(jī)制可能是谷胱甘肽GSH介導(dǎo)的還原模式，GSH與SeO32-生成GS-Se-SG，GS-Se-SG在GSH還原酶的作用下生成GS-Se-，GS-Se-不穩(wěn)定，最終分解成Se和GSH［11，12］。

表2 鼠李糖乳桿菌富硒量

3 小結(jié)與討論

鼠李糖乳桿菌富硒作用最佳條件：38℃恒溫培養(yǎng)、加入亞硒酸鈉的時(shí)間為第10 h、最佳亞硒酸鈉濃度為8μg/mL。徐穎等［7］研究發(fā)現(xiàn)，最佳亞硒酸鈉濃度為10μg/mL，加硒時(shí)間為第6 h，培養(yǎng)溫度為38℃，與本研究結(jié)果有差異，原因可能由于試驗(yàn)的濃度梯度設(shè)置的太大導(dǎo)致的。徐穎等［7］研究硒轉(zhuǎn)化率高達(dá)85.5%，但其硒含量為197.47μg/g，本研究的硒轉(zhuǎn)化率為74.72%時(shí)，富硒量高達(dá)5 901.243μg/g。徐穎等［7］的研究硒轉(zhuǎn)化率非常高，但其硒含量卻非常低，原因可能是將菌體烘干時(shí)未烘干至恒重，也有可能是因?yàn)榧尤雭單徕c之前乳酸桿菌生長(zhǎng)過快，其加硒時(shí)間在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期之后。曾議霆等［9］研究發(fā)現(xiàn)，最佳亞硒酸鈉濃度為6μg/mL、加硒時(shí)間為第6 h，硒轉(zhuǎn)化率達(dá)27.00%，富硒量為425.79μg/g。其硒轉(zhuǎn)化率與富硒量都比較低，原因可能是其培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)的溫度為36℃。本研究發(fā)現(xiàn)36℃與39℃培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌對(duì)亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化都比較低。朱何東等［13］研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌的富硒條件：37℃恒溫培養(yǎng)，亞硒酸鈉添加量為46μg/mL，培養(yǎng)36 h，富硒能力為56.52%，其乳酸桿菌的種類與本研究的乳酸桿菌種類不同，布氏乳桿菌相對(duì)鼠李糖乳桿菌更能適應(yīng)高濃度的亞硒酸鈉，但富硒能力相對(duì)較低。宋照軍［14］研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌（LA）富硒能力較強(qiáng)，其富硒的條件：選用番茄汁液體培養(yǎng)基，亞硒酸鈉添加量為18μg/mL，37℃培養(yǎng)24 h，富硒能力為62.22%。嗜酸乳桿菌（LA）對(duì)硒的適應(yīng)力也較強(qiáng)，富硒能力相對(duì)較高，為62.22%。亞硒酸鈉濃度過高會(huì)抑制鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)，并且會(huì)在鼠李糖乳桿菌表面析出硒單質(zhì)，對(duì)于鼠李糖乳桿菌中的有機(jī)硒以何種形式存在有待進(jìn)一步研究。