人參皂苷Rg3調(diào)控Dickkopf相關(guān)蛋白3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

胡珊珊， 王少文， 蔣 磊

(安徽省第二人民醫(yī)院， 安徽 合肥 230000)

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、預(yù)后差以及病死率高等特點(diǎn)。最新研究顯示,我國(guó)肝癌患者的發(fā)病人數(shù)每年超過(guò)30萬(wàn)，嚴(yán)重的危害患者生命健康[1]。既往研究證實(shí),手術(shù)切除仍然是治療早期肝癌的最佳方式，但是由于肝癌患者早期臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，導(dǎo)致多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為中晚期，85%以上的患者無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除治療[2]。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物對(duì)于肝癌治療一直是研究的熱點(diǎn)。人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3，G-Rg3)是人參皂苷中有效的抗腫瘤活性成分之一，能夠抑制肺癌、胃癌、肝癌等細(xì)胞增殖，對(duì)患者具有良好的治療作用[3,4]。但是目前有關(guān)G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制尚不完全清楚。Dickkopf相關(guān)蛋白3(Dickkopf-related protein3，DKK3)是屬于Dickkopf家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者癌組織中DKK3表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)DKK3能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡[5]。以上研究表明，DKK3在肝癌患者疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但是有關(guān)DKK3在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控機(jī)制以及藥物干預(yù)研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2，觀察G-Rg3能否通過(guò)調(diào)控DDK3表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以期為G-Rg3臨床治療肝癌提供新的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑:人肝癌細(xì)胞系HepG2(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；人參皂苷Rg3(上海鈺博生物科技有限公司，批號(hào)：14197-60-5)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：4030ES20)；噻唑蘭(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT)檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C0009S)；細(xì)胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、牛血清白蛋白(Bovine albumin，BSA)粉末、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影液檢測(cè)試劑盒、羊抗兔IgG抗體(批號(hào)：A0239)、羊抗鼠IgG抗體(批號(hào)：A0192)、DKK3抗體(批號(hào)：ab36898)、Wnt抗體(批號(hào)：ab8805)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(批號(hào)：ab38449)、β-actin抗體(批號(hào)：AF5001)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2儀器:TWK-FST32型細(xì)胞勻漿儀(武漢泰普拓公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；1658033型電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3肝癌細(xì)胞培養(yǎng)與分組:HepG2細(xì)胞采用10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的杜爾貝科的改良鷹培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)，待生長(zhǎng)融合度達(dá)80～90%時(shí)，傾去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS)潤(rùn)洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3 min至細(xì)胞呈現(xiàn)卵圓形，10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行傳代處理。實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組(Control)、人參皂苷Rg3組(G-Rg3)、人參皂苷Rg3+Dickkopf相關(guān)蛋白3無(wú)關(guān)片段組(G-Rg3+DKK3-NC)以及人參皂苷Rg3+Dickkopf相關(guān)蛋白siRNA組(G-Rg3+DKK3-siRNA)。其中G-Rg3組細(xì)胞給予G-Rg3(40mg/L)干預(yù)48h；G-Rg3+DKK3-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK3-NC 24h后，G-Rg3干預(yù)48h；G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK3-siRNA后，G-Rg3干預(yù)48h；Control組細(xì)胞正常培養(yǎng)。

1.4MTT法測(cè)定肝癌細(xì)胞活力:將消化后的HepG2細(xì)胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相關(guān)處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，G-Rg3干預(yù)處理48h，每孔加入MTT溶液10μL(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去細(xì)胞上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)震蕩10min，酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為570nm檢測(cè)各孔的吸光度值，以光密度(optical density，OD)值反應(yīng)細(xì)胞的增殖活力。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡:細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK3-NC或是DKK3-siRNA 24h后，G-Rg3干預(yù)處理48h，收集各組細(xì)胞，PBS潤(rùn)洗3遍，離心后傾去細(xì)胞液，細(xì)胞重懸并將濃度調(diào)整為1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，在488 nm處，分別激發(fā)525 nm和620 nm帶孔濾波器，檢測(cè)FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)熒光，從而得到4組肝癌細(xì)胞的凋亡情況。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)DKK3、Wnt和β-catenin表達(dá):收集各組細(xì)胞；4℃條件下裂解30 min，期間每隔5 min震蕩1次；BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)抗體DKK3(1∶1000)、Wnt抗體(1∶1000)、β-catenin抗體(1∶1000)以及β-actin抗體(1∶2000)，4℃過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)的羊抗兔IgG抗體或者羊抗鼠IgG抗體(1∶5000)1～2h；搖床搖晃并加TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。DKK3、Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結(jié) 果

2.1G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響:MTT檢測(cè)顯示，與Control組相比，G-Rg3組細(xì)胞活力明顯從0.65±0.14下降至0.41±0.12(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞活力明顯從0.41±0.12升高至0.58±0.10(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.2G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與Control組相比，G-Rg3組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯從(5.6±1.3)%升高至(44.3±7.5)%(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯從(44.3±7.5)%降低至(15.2±6.3)%(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

2.3G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞DKK3表達(dá)的影響:與Control組相比，G-Rg3組細(xì)胞DKK3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯從1.00±0.10升高至2.35±0.28(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞DKK3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯從2.35±0.28降低至1.14±0.15(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞DKK3表達(dá)的影響

2.4G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞Wnt、β-catenin表達(dá)的影響:與Control組相比，G-Rg3組細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯從1.00±0.09和1.0±0.14分別降低至0.35±0.06和0.38±0.05(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯從0.35±0.06和0.38±0.05分別升高至0.91±0.14和0.75±0.23(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞Wnt、β-catenin表達(dá)的影響

3 討 論

G-Rg3是從紅參中提取的四環(huán)三萜皂苷活性單體。既往研究顯示，G-Rg3能夠通過(guò)抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。但是目前有關(guān)G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究擬采用體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2，探究G-Rg3對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

本研究首先觀察G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。MTT與流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，G-Rg3組HepG2細(xì)胞增殖顯著降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，表明G-Rg3能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，與以往研究結(jié)果一致。DDK3表達(dá)與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，DKK3能夠充當(dāng)抑制劑作用，發(fā)揮抗腫瘤活性[7]。為此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，G-Rg3可能是通過(guò)促進(jìn)DKK3表達(dá)，從而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，與Control組相比，G-Rg3組肝癌細(xì)胞增殖顯著降低，凋亡顯著升高。本研究結(jié)果再一次證實(shí)，DKK3表達(dá)與G-Rg3抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，DKK3表達(dá)下調(diào)是子宮內(nèi)膜宮頸癌預(yù)后的不良標(biāo)志[8]，那么DKK3是否是G-Rg3抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的關(guān)鍵蛋白呢？本研究通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK3 siRNA進(jìn)一步觀察G-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用。Western blot結(jié)果顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞DKK3表達(dá)顯著降低，DKK3 NC組無(wú)顯著變化，表明轉(zhuǎn)染DKK3 siRNA成功。MTT檢測(cè)顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞增殖顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低。以上研究表明，G-Rg3能夠通過(guò)促進(jìn)DKK3表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的重要途徑，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。DKK3作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，被認(rèn)為是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制因子[10]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中DKK3表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)DKK3能夠抑制Wnt/β-catenin活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)控DKK3觀察G-Rg3對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與Control組相比，G-Rg3組細(xì)胞Wnt、β-catenin表達(dá)均顯著降低。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細(xì)胞Wnt、β-catenin表達(dá)均顯著增加。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。

綜上所述，G-Rg3能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與促進(jìn)DKK3表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。