靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)研究進(jìn)展*

張曉元 張艷艷 孫曉康 張林軍 陳 勉 劉 飛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，多糖類藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101）

蛋白激酶、離子通道、受體等人體蛋白是當(dāng)前藥物開(kāi)發(fā)最常用的藥物靶標(biāo)。截至2015 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的1 578 種藥物分子靶點(diǎn)中667 種為人源蛋白，占總藥物靶點(diǎn)的75%以上［1］。隨著人類基因組成功測(cè)序及不斷深度解析，構(gòu)成人類基因組的蛋白質(zhì)編碼基因的實(shí)際數(shù)目確定為2萬(wàn)多［2］，存在大量潛在藥物靶點(diǎn)。傳統(tǒng)靶點(diǎn)確認(rèn)及干預(yù)策略包括使用小分子拮抗劑與靶蛋白特定位點(diǎn)結(jié)合來(lái)阻斷或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，然而，細(xì)胞內(nèi)超80%蛋白質(zhì)如骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和非酶蛋白等尚未發(fā)現(xiàn)有效小分子拮抗劑［3］。同時(shí)，該種“占位驅(qū)動(dòng)（occupancy driven）”作用模式需持續(xù)占據(jù)靶蛋白活性位點(diǎn)，要求小分子拮抗劑具有高親和力、長(zhǎng)半衰期且一般使用量較大以滿足靶點(diǎn)飽和，導(dǎo)致毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥；或采用DNA敲除、CRISPR?Cas9及RNA干擾（RNAi）等從DNA和/或mRNA水平上影響基因表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞總蛋白質(zhì)水平降低，通常需幾小時(shí)甚至幾天才能形成效果，細(xì)胞有足夠的時(shí)間建立代償機(jī)制或者產(chǎn)生繼發(fā)效應(yīng)。另外，翻譯前水平間接調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)存在調(diào)控不可逆性、成藥性差、易脫靶等共性問(wèn)題，仍需進(jìn)一步完善。

人體細(xì)胞內(nèi)數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)正不間斷進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、傳導(dǎo)、催化、合成等功能，同時(shí)胞內(nèi)受損蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白、外來(lái)蛋白等即時(shí)降解為小分子氨基酸再利用和維持細(xì)胞自我平衡。蛋白質(zhì)的合成和降解一直處于動(dòng)態(tài)平衡中，受復(fù)雜機(jī)制監(jiān)控，具有重要生理意義，一旦發(fā)生異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解大都采用泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin?proteasome system，UPS）和自噬（autophagy）系統(tǒng)兩個(gè)途徑［4］。近年來(lái)，科研人員基于上述途徑開(kāi)發(fā)出許多直接靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)，探究了蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中如何發(fā)揮作用。區(qū)別于傳統(tǒng)“占位驅(qū)動(dòng)”，基于“事件驅(qū)動(dòng)（event driven）”作用模式的靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)，直接靶向并催化目標(biāo)蛋白質(zhì)降解，無(wú)需與靶向蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間和高強(qiáng)度結(jié)合，低濃度化合物即可達(dá)到靶蛋白高效降解，具有高活性、高選擇性、靶向“不可成藥”靶點(diǎn)等諸多優(yōu)勢(shì)。本文詳細(xì)介紹了基于UPS、自噬及內(nèi)體?溶酶體等途徑的蛋白質(zhì)降解技術(shù)最新方法、作用機(jī)制等，以期為蛋白質(zhì)靶點(diǎn)快速高效篩選及靶向性藥物開(kāi)發(fā)提供理論與技術(shù)支持。

1 基于UPS蛋白質(zhì)降解技術(shù)

UPS 是細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)降解的主要途徑，由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin?activating enzyme，E1）、泛素綴合酶（ubiquitin?conjugating enzyme，E2）、泛素?蛋白質(zhì)連接酶（ubiquitin?protein ligase，E3）、蛋白酶體及其底物蛋白等構(gòu)成。

其中，泛素是一種由76個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，可在E1、E2、E3 三類酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化下，特異與底物蛋白形成牢固的共價(jià)鍵進(jìn)行多聚泛素化修飾，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63 位的修飾，其中K48多聚泛素修飾蛋白質(zhì)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體識(shí)別并進(jìn)行降解（圖1），泛素鏈被蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）去除并循環(huán)利用，而蛋白質(zhì)底物則被折疊和降解。在此基礎(chǔ)上，科研工作者開(kāi)發(fā)了deGradFP、PROTAC、Molecular glue、dTAG、AID、Trim?Away等系列蛋白質(zhì)降解技術(shù)。

Fig.1 The process of protein ubiquitination and degradation圖1 蛋白質(zhì)泛素化降解的過(guò)程

1.1 deGradFP（degrade green fluorescent protein）

deGradFP技術(shù)由Caussinus等發(fā)明［5?6］，所采用的E3 為SCF 復(fù)合體（Skp1?Cul1?F?box 蛋白），由S?phase kinase associated protein 1（Skp1）、Cullin 1（Cul1）、Ring?Box 1（Rbx1）/regulator of cullins 1（Roc1）和F?box 四個(gè)亞基組成。其中Skp1、Cul1和Rbx1/Roc1 組成一般性骨架，F(xiàn)?box 蛋白具有底物識(shí)別特性，決定SCF 復(fù)合物底物特異性。deGradFP技術(shù)依賴于融合到F?box結(jié)構(gòu)域的綠色熒光蛋白GFP 單結(jié)構(gòu)域抗體片段（vhhGFP4），此融合蛋白可結(jié)合綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白Venus、黃色熒光蛋白YFP 或增強(qiáng)黃色熒光蛋白EYFP 標(biāo)記的功能蛋白，并直接介導(dǎo)K48 多聚泛素化修飾，最終被蛋白酶體降解（圖2a）。熒光蛋白標(biāo)記最大優(yōu)點(diǎn)在于可快捷方便監(jiān)控靶向蛋白質(zhì)降解水平。Caussinus 團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)在果蠅體內(nèi)靶向組蛋白H2A 變體（His2AV）降解實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)表達(dá)28 min 后靶向蛋白質(zhì)水平開(kāi)始下降，151 min后殘留不足10%，顯示出優(yōu)異降解效率。Shin等［7］將vhhGFP4 與E3 復(fù)合物的銜接蛋白SPOP 融合開(kāi)發(fā)出新升級(jí)系統(tǒng)，引導(dǎo)更高效的核蛋白降解。deGradFP 技術(shù)已成功在煙草［8］、果蠅［6］、斑馬魚(yú)［9］和動(dòng)物細(xì)胞系［10］中獲得成功應(yīng)用。

1.2 蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTAC）

PROTAC是一種兩頭含有不同配體的雜合雙功能化合物，分別為可結(jié)合E3 的配體和可與細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)靶蛋白結(jié)合的配體，兩配體間通過(guò)Linker 相連，形成“三體”聚合物——靶蛋白配體?Linker?E3配體［11］。其作用機(jī)制為靶蛋白配體將靶蛋白招募到E3 附近，實(shí)現(xiàn)靶蛋白泛素化標(biāo)記，最后啟動(dòng)細(xì)胞泛素化水解過(guò)程被蛋白酶體降解，而PROTAC不被降解，可循環(huán)使用（圖2b）。Raymond Deshaies和Craig Crews教授團(tuán)隊(duì)［11］于2001年發(fā)明PROTAC 技術(shù)。早期PROTAC 技術(shù)以多肽為配體，生物相容性高、細(xì)胞毒性低，但分子質(zhì)量較高，細(xì)胞通透性及化學(xué)穩(wěn)定性差，嚴(yán)重影響其成藥性。故后續(xù)研究重點(diǎn)集中在開(kāi)發(fā)小分子PROTAC 上，2008 年Crews 團(tuán)隊(duì)利用咪唑啉衍生物Nutlin 與E3鼠雙微體2（MDM2）高親和力特點(diǎn)，創(chuàng)造性與靶向雄激素受體（AR）的小分子SARM 相連，設(shè)計(jì)出用于降解AR的首個(gè)完全小分子形式PROTAC?1，在HeLa 細(xì)胞中10 μmol/L PROTAC?1 處理7 h 后，雄激素受體水平明顯下降，證明了透膜小分子化PROTAC 開(kāi)發(fā)的可行性，但誘導(dǎo)AR 降解的PROTAC?1 濃度較高（微摩爾級(jí)別）。經(jīng)近20 年研究，更多的可用于小分子PROTAC 設(shè)計(jì)的E3 被發(fā)現(xiàn)，包括Von Hippel?Lindau（VHL）［12］、Cereblon（CRBN）［13］、凋亡蛋白抑制蛋白（IAPs）［14］、MDM2［15］和DCAF16［16］等。已有報(bào)道，靶蛋白包括核受體（ER、AR、RAR）、蛋白激酶（AKT、RIPK2、CDK9、BTK、TBK1、BCR?ABL、CDK2/4/6/9、RIPK2、ALK、CK2、PI3K、ERK1/2）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（BRD4、Sirt2、TRIM24、HDAC6）、調(diào)節(jié)蛋白（ERRα、FKBP12、TACC3）、神經(jīng)退行性相關(guān)蛋白（Huntingtin、Tau、α?synuclein）、胞外代謝酶（MetAP?2、DHODH）、表觀遺傳相關(guān)蛋白（PCAF/GCN5）等30 余種蛋白質(zhì)及其突變體成功利用PROTAC 技術(shù)進(jìn)行降解［17?23］，涉及疾病包括腫瘤、類風(fēng)濕、神經(jīng)退行性疾病等，誘導(dǎo)降解PROTAC 濃度也不斷降低，如BET 有效降解劑QCA570 在白血病細(xì)胞MV4?11中半數(shù)抑制濃度IC50低至8.3 pmol/L［24］，展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景。

浙江大學(xué)侯廷軍教授團(tuán)隊(duì)［25］建立了集PROTAC 結(jié)構(gòu)信息和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)于一體的開(kāi)放式WEB 訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)PROTAC?DB（http://cadd.zju.edu.cn/protacdb）。截至2021 年4 月17 日，該數(shù)據(jù)庫(kù)囊括了2 258 個(gè)PROTAC、275 個(gè)彈頭（靶向目標(biāo)蛋白質(zhì)的小分子）、65 個(gè)E3 配體和1 099 個(gè)Linker，并詳細(xì)提供其化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性和理化性質(zhì)，以及PROTAC的降解能力、結(jié)合親和力和細(xì)胞活性。盡管已有豐富的PROTAC?DB元件數(shù)據(jù)庫(kù)信息，但PROTAC的發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化及理性設(shè)計(jì)仍十分困難，一直是研究重點(diǎn)之一。研究表明，當(dāng)前PROTAC 蛋白降解的開(kāi)發(fā)瓶頸是Linker長(zhǎng)度構(gòu)效關(guān)系（SAR），Linker 長(zhǎng)度和化學(xué)成分會(huì)影響PROTAC 的結(jié)構(gòu)剛性、疏水性和溶解性等［26］。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)深入研究，Linker 長(zhǎng)度SAR 及PROTAC設(shè)計(jì)已由經(jīng)驗(yàn)性轉(zhuǎn)向理性設(shè)計(jì)：一方面通過(guò)X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行RosettaDock 模擬、分子動(dòng)力學(xué)模擬等設(shè)計(jì)新的有效的PROTACs［27?29］，其 中，Ciulli 教授團(tuán)隊(duì)［27］于2017 年首次報(bào)道了PROTAC分子MZ1與VHL和靶蛋白受體Brd4BD2形成的穩(wěn)定三元復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的理性PROTAC 藥物分子設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)；另一方面利用計(jì)算軟件輔助理性設(shè)計(jì)，如Drummond 等［30?31］利用MOE 軟件開(kāi)發(fā)出一系列生成和分析PROTAC 三元復(fù)合物協(xié)議、Zaidman等［32］開(kāi)發(fā)PROsettaC軟件，Bai等［33］開(kāi)發(fā)基于Rosetta 的三元復(fù)合物建模協(xié)議等，最大限度地減少合成和生物評(píng)估分子的數(shù)量來(lái)提高篩選通量。

最近，科研人員針對(duì)PROTAC 進(jìn)行系列創(chuàng)造策略來(lái)升級(jí)改造，包括開(kāi)發(fā)出光可控PROTACs，如 pc?PROTACs［34］、photoPROTACs［35］、PHOTACs［36］、opto?PROTAC［37］等，可通過(guò)紫外線或可見(jiàn)光照射控制PROTAC 在特定組織中靶向降解目標(biāo)蛋白質(zhì)，避免可能出現(xiàn)的全身毒副作用；開(kāi)發(fā)出可智能激活的靶向吲哚胺2,3?雙加氧酶（IDO）的半導(dǎo)體聚合物納米 PROTAC（semiconducting polymer nano?PROTAC，SPNpro），結(jié)合光學(xué)療法和蛋白降解抗癌雙重力量，在腫瘤中特異性激活PROTAC 來(lái)高效抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，克服了當(dāng)前PROTAC 分子潛在的脫靶副作用［38］；開(kāi)發(fā)出homo?PROTACs，實(shí)現(xiàn)E3 分子雙向多聚泛素化，介導(dǎo)E3自降解［39?40］。

1.3 分子膠（molecular glue）

與PROTAC 雜合雙功能小分子化合物不同，分子膠為單價(jià)小分子（通常分子質(zhì)量<500 u），通過(guò)修飾重塑E3表面，誘導(dǎo)或增強(qiáng)E3和靶蛋白之間的相互作用，來(lái)實(shí)現(xiàn)識(shí)別并促進(jìn)泛素化以降解靶蛋白（圖2c）。目前較成熟的分子膠主要有兩大類：一類為免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDs）沙利度胺（Thalidomide）及其衍生物來(lái)那度胺（Lenalidomide）、泊馬度胺（Pomalidomide）等，可與E3 CRBN 結(jié)合，招募含鋅指（ZF）結(jié)構(gòu)域因子的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行泛素化并被蛋白酶體降解，而IMiDs本身對(duì)降解轉(zhuǎn)錄因子沒(méi)有可測(cè)量的結(jié)合親和力。已報(bào)道降解靶點(diǎn)包括Ikaros 家族鋅指蛋白1（IKZF1）、鋅指蛋白3（IKZF3）、鋅指蛋白91（ZFP91）、酪蛋白激酶1α（CK1α）及翻譯終止因子GSPT1 等；另一類為芳基磺酰胺類，如吲地磺胺（Indisulam）、他西舒蘭（Tasisulam）等可與E3 DCAF15 結(jié)合，招募剪接因子RNA 結(jié)合基序蛋白39（RBM39）進(jìn)行泛素化并降解。上述兩類分子膠的發(fā)現(xiàn)均具有偶然性，目前可用于靶向降解蛋白質(zhì)的分子膠尚缺乏合理的篩選和設(shè)計(jì)策略，限制了其發(fā)現(xiàn)的效率和適用性。2020 年Mayor?Ruiz 等［41］創(chuàng)新利用表型化學(xué)篩選法（phenotypic chemical screening）篩選新分子膠降解劑，發(fā)現(xiàn)一種新的RBM39 分子膠降解劑dCeMM1，驗(yàn)證了該方法可行性。Benjamin Ebert團(tuán)隊(duì)［42］則通過(guò)系統(tǒng)挖掘數(shù)據(jù)庫(kù)及CRISPR?Cas9篩選技術(shù)，關(guān)聯(lián)分析578種腫瘤細(xì)胞系中499個(gè)E3組分的mRNA水平與4 518個(gè)臨床和臨床前小分子的藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)一種新分子膠細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK 抑制劑CR8，CR8通過(guò)DDB1直接與CDK12?cyclin K結(jié)合，并誘導(dǎo)與Cul4?Rbx1?DDB1 形成復(fù)合物，不依賴任何DCAF底物受體，使cyclin K發(fā)生泛素化并被蛋白酶體系統(tǒng)降解，進(jìn)一步對(duì)CR8 結(jié)構(gòu)特性分析發(fā)現(xiàn)CR8 分子膠的活性主要依賴于暴露在激酶表面的2?吡啶部分，揭示合理修飾結(jié)合靶標(biāo)的小分子的表面暴露區(qū)域可用于開(kāi)發(fā)特定蛋白質(zhì)靶標(biāo)的分子膠降解劑。

1.4 dTAG（degradation TAG）

Nabet等［43］開(kāi)發(fā)的快速、廣譜dTAG蛋白降解技術(shù)，由內(nèi)源性E3、透膜性好dTAG 合成小分子、外源變異非天然蛋白FKBP12F36V與需降解的目標(biāo)蛋白融合體三部分組成。雙功能的dTAG?13等dTAG化合物可高效選擇性地將FKBP12F36V融合的靶蛋白募集到E3 CRBN 附近，形成一個(gè)三元復(fù)合體，并引導(dǎo)靶蛋白K48多聚泛素化和蛋白酶體的降解（圖2d）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，dTAG 降解技術(shù)可快速選擇性降解與FKBP12F36V融合嵌合體，如ENL、MELK、BRD4、EZH2、HDAC1、KRAS、MYC、PLK1、SLC蛋白等［44］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，該技術(shù)被成功用來(lái)降解小鼠模型IE2蛋白亞型，闡明其在人巨細(xì)胞病毒（HCMV）晚期感染中作用［45］；Nabet等［46］2020 年開(kāi)發(fā)第二代dTAGv?1 分子，可選擇性與VHL E3 復(fù)合體結(jié)合（圖2d），解決了影響一代dTAG?13誘導(dǎo)靶蛋白有效性的背景特異性和蛋白特異性問(wèn)題。小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)表征發(fā)現(xiàn)，與dTAG?13相比，dTAGv?1半衰期更長(zhǎng)、暴露量更大、蛋白降解持續(xù)時(shí)間也更長(zhǎng)［46］。

1.5 AID（auxin-inducible degron system）

植物生長(zhǎng)激素（auxin）可誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)蛋白酶體降解抑制生長(zhǎng)素/吲哚乙酸（AUX/IAA）蛋白家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子，激活編碼AUX/IAA 家族蛋白基因表達(dá)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。AID系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)正是基于將植物生長(zhǎng)素依賴性降解途徑移植至其他真核物種中，由E3 SCF 復(fù)合體、靶蛋白和植物激素三個(gè)基本單位組成。TIR1 是一種特殊F?box 蛋白，可選擇性識(shí)別AID 標(biāo)簽序列（來(lái)源于AUX/IAA）標(biāo)記內(nèi)源靶蛋白（圖2e）。該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于包括酵母、果蠅、秀麗隱桿線蟲(chóng)及源于雞、小鼠、倉(cāng)鼠、猴子和人類的細(xì)胞系中［47?48］。當(dāng)IAA生長(zhǎng)素被供應(yīng)時(shí)，TIR1 蛋白的激活可誘導(dǎo)靶蛋白快速耗竭，半衰期為10～20 min，大多數(shù)靶蛋白3 h可降解至不可檢測(cè)水平［49］，并可通過(guò)去除生長(zhǎng)素來(lái)逆轉(zhuǎn)［47］。近年來(lái)，AID 技術(shù)也進(jìn)行不斷改進(jìn)，比如用合成生長(zhǎng)素1?萘乙酸（NAA）替代吲哚乙酸（IAA）避免GFP激發(fā)時(shí)IAA的光破壞形成有毒衍生物和生長(zhǎng)缺陷［50］；建立基于CRISPR?Cas9 基因編輯技術(shù)的AID標(biāo)簽與靶基因融合表達(dá)技術(shù)，并開(kāi)發(fā)最小化7 ku AID 標(biāo)簽（m?AID），方便融合蛋白形成［51］；開(kāi)發(fā)雙順?lè)醋右惑w化質(zhì)粒，可同時(shí)表達(dá)TIR1 和AID 標(biāo)簽融合靶蛋白，減少基因操作［52］。

1.6 Trim-Away

Trim?Away技術(shù)是2017年Melina Schuh團(tuán)隊(duì)基于Leo James發(fā)現(xiàn)的Trim21蛋白而發(fā)明的一種在細(xì)胞內(nèi)快速降解特定蛋白的新技術(shù)［53］。E3 Trim21與抗體Fc 區(qū)域具有很強(qiáng)親和力，且在多種細(xì)胞類型和組織中廣泛表達(dá)，可引入外源Trim21 用作抗體受體與針對(duì)靶蛋白的抗體Fc 段結(jié)合，招募UPS 體系來(lái)降解與抗體結(jié)合的靶蛋白（圖2f）。Schuh 等證實(shí)應(yīng)用Trim?Away技術(shù)可以降解哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠與人原代細(xì)胞中不同目標(biāo)靶蛋白，及降解定位于不同細(xì)胞區(qū)域靶蛋白。并且通過(guò)設(shè)計(jì)特異性抗體，也可用于選擇性降解翻譯后修飾蛋白、剪切或突變的蛋白質(zhì)變體，而保留未修飾的/野生型蛋白。比如，在NIH 3T3 細(xì)胞內(nèi)成功將綠色熒光蛋白降解，半衰期僅為16 min。對(duì)細(xì)胞質(zhì)中定位于質(zhì)膜或囊泡樣結(jié)構(gòu)的膜錨定GFP、定位于染色質(zhì)的組蛋白H2B?GFP、積累于細(xì)胞核內(nèi)的核定位NLS?GFP 等均實(shí)現(xiàn)快速降解，半衰期分別為21 min、9 min、9 min。在NIH 3T3 和卵母細(xì)胞中，HTT 蛋白的致病突變體（3B5H10）被迅速降解，而正常的野生型HTT 蛋白不受影響。唐開(kāi)福教授等［54］證實(shí)Trim?Away技術(shù)可用來(lái)研究斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育初期幾小時(shí)的蛋白質(zhì)功能，相比斑馬魚(yú)最為常見(jiàn)的基因敲降技術(shù)反義嗎啉環(huán)寡核苷酸（morpholino）需數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天，Trim?Away技術(shù)僅10 min即可剔除目標(biāo)蛋白，因此可用來(lái)研究母源性蛋白在胚胎發(fā)育早期（比如受精后2～3 h）的功能。

Fig.2 Protein degradation technology based on UPS圖2 基于UPS蛋白質(zhì)降解技術(shù)

2 基于自噬途徑（autophagy）蛋白質(zhì)降解技術(shù)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)部將受生理和病理因素影響而受損、變性、老化或失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或核酸等生物大分子進(jìn)行分解代謝，是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在相關(guān)基因調(diào)控下，在被降解物附近形成小的脂質(zhì)體樣雙膜結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)化的LC3 蛋白附著脂質(zhì)雙層膜上，形成吞噬載體；吞噬載體膨脹吞噬帶降解蛋白質(zhì)或細(xì)胞器形成囊泡狀的自噬體（autophagosome），隨后與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體（autolysosome），由溶酶體內(nèi)水解酶降解包裹內(nèi)容物，生成的氨基酸、脂肪酸等被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝和能量的更新，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)?；谧允赏緩?，科研工作者開(kāi)發(fā)出自噬靶向嵌合體（autophagy targeting chimera，AUTAC）、自噬栓系復(fù)合物（autophagosome tethering compound，ATTEC）蛋白降解技術(shù)。

2.1 AUTAC

真核細(xì)胞在受鏈球菌入侵后，鏈球菌蛋白會(huì)被K63多聚泛素化引起自噬降解。研究表明，S?鳥(niǎo)苷酸化修飾是K63多聚泛素化修飾的前置步驟，推測(cè)S?鳥(niǎo)苷酸化修飾很有可能是一種特異性的自噬信號(hào)?；诖?，2019年日本Hirokazu Arimoto研究團(tuán)隊(duì)［55］開(kāi)發(fā)AUTAC 技術(shù)。AUTAC 的設(shè)計(jì)與PROTAC相似，采用的是“兩端靶向小分子+中間Linker”的模式，一端為特異性識(shí)別靶蛋白的配體，一端為模仿S?鳥(niǎo)苷酸修飾的降解標(biāo)簽（即鳥(niǎo)嘌呤衍生物）。AUTAC也通過(guò)E3泛素化發(fā)揮作用，與引起蛋白酶體降解的K48多聚泛素化不同，其泛素化修飾是被選擇性的自噬途徑識(shí)別的K63多聚泛素化（圖3a）。該研究團(tuán)隊(duì)已設(shè)計(jì)出系列靶向MetAP2、FKBP12、BET、TSPO 等蛋白質(zhì)的AUTAC 分子，并成功進(jìn)行降解。同時(shí)，還通過(guò)靶向定位于線粒體表面的TSPO 蛋白（mitochondrial translocator protein），成功引起線粒體膜蛋白TSPO的K63多聚泛素化修飾和破損線粒體降解。

2.2 ATTEC

ATTEC 技術(shù)是復(fù)旦大學(xué)魯伯塤教授于2019 年發(fā)明［56］。與PROTAC 和AUTAC 不同，ATTEC 分子不依賴泛素化，不需要Linker介入，通過(guò)直接結(jié)合靶向蛋白和關(guān)鍵的脂質(zhì)化自噬小體蛋白LC3（圖3b），將靶蛋白與自噬小體捆綁在一起，從而引起自噬降解。魯伯塤教授團(tuán)隊(duì)從3 375個(gè)小分子化合物庫(kù)中成功篩選到2 個(gè)小分子10O5、8F20，可同時(shí)結(jié)合LC3 及突變HTT 蛋白，但不與野生型HTT蛋白結(jié)合，同時(shí)進(jìn)行構(gòu)型合理優(yōu)化，又成功合成2個(gè)新小分子化合物AN1 和AN2。在細(xì)胞水平和亨廷頓病（HD）果蠅、小鼠動(dòng)物模型上已成功驗(yàn)證了ATTEC的降解效果和療效。該團(tuán)隊(duì)2021年新升級(jí)LD?ATTEC 還具有降解包括自噬識(shí)別的非蛋白質(zhì)生物大分子，如DNA/RNA分子、受損的細(xì)胞器等不同類型的靶標(biāo)的巨大潛力［57］，但ATTEC能否影響全身自噬還有待進(jìn)一步闡明，以避免功能蛋白和細(xì)胞器的非特異性降解。

Fig.3 Protein degradation technology based on autophagy pathway圖3 基于自噬途徑蛋白質(zhì)降解技術(shù)

3 基于內(nèi)體-溶酶體途徑（endosomelysome pathway）蛋白質(zhì)降解技術(shù)

UPS系統(tǒng)與自噬途徑的作用靶點(diǎn)均集中于胞內(nèi)蛋白，對(duì)分泌蛋白和細(xì)胞膜蛋白無(wú)效。通常，胞外蛋白及細(xì)胞膜蛋白的降解由細(xì)胞表面溶酶體靶向受體（LTRs）家族通過(guò)內(nèi)體?溶酶體途徑來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。在溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境下，60余種酸性水解酶如酶蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶和磷酸酶等共同作用將外源蛋白降解成肽段。

斯坦福大學(xué)Carolyn R.Bertozzi教授團(tuán)隊(duì)［58］于2020 年開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)出LYTAC（lysosome?targeting chimaeras，溶酶體靶向嵌合體）技術(shù)，溶酶體靶向嵌合體LYTACs具有兩個(gè)結(jié)合域：寡聚糖肽基團(tuán)（oligoglycopeptide group）和可與靶蛋白結(jié)合的抗體或小分子，兩者通過(guò)Linker連接?？贵w或小分子可與胞外或者跨膜的目標(biāo)靶蛋白結(jié)合，寡聚糖肽基團(tuán)被細(xì)胞表面跨膜陽(yáng)離子?非依賴甘露糖?6?磷酸受體（CI?M6PR，又稱IGF2R）識(shí)別結(jié)合后，形成CI?M6PR?LYTAC?靶蛋白復(fù)合物，可被細(xì)胞膜內(nèi)吞形成運(yùn)輸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，在溶酶體低pH 下，CI?M6PR 自身由高爾基體再次轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜循環(huán)利用，而靶向蛋白則被溶酶體內(nèi)多種蛋白酶降解（圖4）。利用LYTAC 技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)膜蛋白如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、程序性死亡配體1（PD?L1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）以及分泌蛋白載脂蛋白E4（APOE4）的降解［58］。

Fig.4 Protein degradation mechanism of LYTAC圖4 LYTAC 蛋白質(zhì)降解機(jī)制

4 靶向蛋白質(zhì)技術(shù)應(yīng)用與藥物開(kāi)發(fā)

繼2009 年Nurix Therapeutics 成立后，Arvinas（2013 年，PROTAC 發(fā)明人成立）、C4 Therapeutics（2015年）、Kymera Therapeutics（2015年）等公司相繼成立，致力于探索小分子蛋白降解劑開(kāi)發(fā)和治療研究。不同靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)均具有自己的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)（表1），其中PROTACs研究的最為深入和詳細(xì)，研究領(lǐng)域主要集中在腫瘤疾病，但在神經(jīng)退行性疾病、炎癥和免疫學(xué)領(lǐng)域也有所突破。

2019年，首個(gè)靶向AR的PROTAC口服小分子ARV?110進(jìn)入臨床試驗(yàn)，標(biāo)志著PROTAC技術(shù)邁出了成藥性關(guān)鍵一步，成為該領(lǐng)域的里程碑事件。目前，已有9 種PROTACs 正進(jìn)行臨床試驗(yàn)［59］（表2），主要針對(duì)腫瘤適應(yīng)證。根據(jù)公司官網(wǎng)管線介紹，Kymera 公司KT?413 和KT?333、Nurix 公司NX?5948 將于2021 年進(jìn)入I期臨床，Cullgen 公司CG001419、C4 Therapeutics 公司CFT8634 將于2021 年提交新藥臨床試驗(yàn)申請(qǐng)［59］。我國(guó)四川海思科制藥有限公司研發(fā)的I類創(chuàng)新化學(xué)藥——口服PROTAC小分子抗腫瘤藥物HSK29116藥品臨床試驗(yàn)申請(qǐng)獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局受理（臨床登記號(hào)CTR20210774）。HSK29116 能誘導(dǎo)BTK 泛素化標(biāo)記，通過(guò)蛋白酶體途徑將其降解，從而阻斷BCR 信號(hào)通路的傳遞，抑制B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，起到雙重抗腫瘤作用。蘇州開(kāi)拓藥業(yè)股份有限公司外用雄激素受體（AR）降解劑GT20029（凝膠/酊）于2021 年4 月正式獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的臨床試驗(yàn)通知書(shū)，2021年7月獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的臨床試驗(yàn)許可，成為全球首個(gè)進(jìn)入臨床階段的外用PROTAC 藥物，用于雄激素性脫發(fā)和痤瘡的治療。

Table 1 Comparison of different protein degradation technologies表1 不同蛋白質(zhì)降解技術(shù)對(duì)比

Table 2 Part of PROTAC has entered the clinic表2 部分已進(jìn)入臨床的PROTAC

雖然FDA 已批準(zhǔn)ARV?110 等PROTACs 進(jìn)入臨床研究，但目前仍缺乏PROTAC 在動(dòng)物層面的臨床前研究，尤其是大動(dòng)物上的評(píng)價(jià)。清華大學(xué)饒燏課題組等［60］首次通過(guò)化學(xué)設(shè)計(jì)PROTACs，構(gòu)建系統(tǒng)性敲除模型，成功實(shí)現(xiàn)小鼠、大鼠、豬和恒河猴全身體內(nèi)FKBP12蛋白的快速可逆的敲低，其中小鼠及大鼠體內(nèi)FKBP12 蛋白僅用1 d，恒河猴體內(nèi)FKBP12 蛋白僅用3 d 即可高效率全身敲低（甚或敲除），首次驗(yàn)證PROTACs可采用口服給藥途徑保持高效蛋白質(zhì)降解功能，且發(fā)現(xiàn)停止給予PROTACs，動(dòng)物體內(nèi)FKBP12蛋白可逐漸恢復(fù)，這有利于建立動(dòng)物模型自身對(duì)照，更為準(zhǔn)確研究蛋白質(zhì)功能。將此方法應(yīng)用于BTK 蛋白全身敲低，也獲得顯著效果，充分證實(shí)該技術(shù)可行性。該工作實(shí)現(xiàn)了PROTAC 技術(shù)從小鼠、豬到恒河猴的系統(tǒng)探索，填補(bǔ)了PROTAC 技術(shù)臨床前研究的空白，為其應(yīng)用于臨床治療人類疾病提供了指導(dǎo)，奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。饒燏課題組［61］于2020年又進(jìn)一步首次在小鼠體內(nèi)揭示PROTAC 對(duì)FAK 蛋白非激酶結(jié)構(gòu)域的調(diào)控，并系統(tǒng)評(píng)價(jià)了FAK 靶向的PROTAC 分子在動(dòng)物水平的生物學(xué)功能，研究表明，PROTACs可用于開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶活功能的研究，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)小分子抑制劑只作用于蛋白酶活功能的缺陷。

5 結(jié)論與展望

靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)具有無(wú)需結(jié)合到靶蛋白的活性位點(diǎn)/口袋、高靶點(diǎn)選擇性、低暴露量即可發(fā)揮有效作用等優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)確認(rèn)及填補(bǔ)靶向“不可成藥”蛋白的空白方面，展示出極大應(yīng)用前景。但新技術(shù)的出現(xiàn)，尚存在諸多不足與挑戰(zhàn)，例如，人體內(nèi)存在有600 余種E3，然而可用于PROTAC設(shè)計(jì)的E3尚不到10種，拓展可用靶向蛋白質(zhì)降解的E3或開(kāi)發(fā)不依賴E3的降解方式是面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)之一；靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)的特異性和潛在的非目標(biāo)效應(yīng)亟需確證；靶向蛋白質(zhì)降解也存在耐藥性問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)降低E3的活性及提高E3其他底物的水平等多個(gè)途徑產(chǎn)生對(duì)蛋白質(zhì)降解劑產(chǎn)生耐藥；成藥性評(píng)價(jià)體系缺乏也急需面對(duì)，比如，PROTAC可循環(huán)催化，實(shí)現(xiàn)徹底地降解靶向蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)方法無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估PROTAC的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，以及是否存在潛在的嚴(yán)重毒性。

靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)靶向降解胞外、細(xì)胞膜上和胞內(nèi)等不同定位的游離蛋白質(zhì)?；谌苊阁wLYTAC、AUTAC 和ATTEC 降解途徑甚至可靶向降解一些蛋白質(zhì)聚集物、編碼致病蛋白的遺傳物質(zhì)以及清除致病細(xì)菌和病毒等。隨著蛋白質(zhì)降解技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，如Snipers［62?63］、ENDTACs［64］等新技術(shù)出現(xiàn)，極大擴(kuò)展靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)的目標(biāo)范圍和潛在應(yīng)用，加上多項(xiàng)臨床試驗(yàn)積極結(jié)果也證實(shí)靶向蛋白質(zhì)降解藥物巨大開(kāi)發(fā)潛能，靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)已被視為未來(lái)人類新藥開(kāi)發(fā)最重要的方向之一。持續(xù)優(yōu)化現(xiàn)有降解技術(shù)，探索更安全、高效、精準(zhǔn)、可控的新型靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)，為藥物設(shè)計(jì)和疾病的靶向治療提供新的思路，成為當(dāng)前研究的主要方向。