微生物消毒劑抗性機理*

張可玟 胡 泓 陳 剛

（1）中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100；2）中國海洋大學(xué)海洋生命科學(xué)學(xué)院，青島 266003）

消毒劑是一類可用于物體表面以及空氣、水等傳播介質(zhì)中抑制或殺死微生物的化學(xué)物質(zhì)，科學(xué)合理使用消毒劑能有效切斷病原微生物傳播途徑［1］。消毒劑不僅應(yīng)用在醫(yī)療、衛(wèi)生防疫方面［2?3］，同時也廣泛應(yīng)用于食品加工［4?5］、水處理［6］、環(huán)境［7］、工業(yè)［8］、農(nóng)牧漁業(yè)［9?10］等各行業(yè)，在維護公共衛(wèi)生、保障食品安全、保護生態(tài)健康等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近來，嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 引起的全球新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）疫情大流行［2］，消毒劑的使用量激增，消毒劑使用不規(guī)范的現(xiàn)象頻發(fā)［11］。雖然目前有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與微生物對抗生素的抗性類似，長期不合理使用消毒劑，也會造成微生物對消毒劑產(chǎn)生抗性［12?13］，但抗性基因這種新型基因污染物的產(chǎn)生機制和傳播風(fēng)險仍亟待闡釋和解決。本文對微生物消毒劑抗性機制、抗性基因的產(chǎn)生及傳播等相關(guān)研究進行了闡述和歸納，為進一步研究提供參考。

1 消毒劑種類

根據(jù)消毒劑的化學(xué)成分，常用的消毒劑主要可分為以下幾大類，即含氯消毒劑、過氧化物類消毒劑、醛類消毒劑、醇類消毒劑、酚類消毒劑、含碘消毒劑、環(huán)氧乙烷、雙胍類消毒劑、季銨鹽類消毒劑、重金屬鹽類消毒劑等。消毒劑的作用機制包括多種物理作用和化學(xué)反應(yīng)，不同消毒劑有不同的使用范圍。常見的消毒劑種類、具體舉例、作用機制和主要應(yīng)用詳見表1。

Table 1 Types，action mechanism and main applications of disinfectants［2，14］表1 消毒劑的種類及其作用機制和主要應(yīng)用［2，14］

根據(jù)殺菌水平，消毒劑可分為高效消毒劑、中效消毒劑和低效消毒劑，對不同微生物的殺滅作用也有差異［14］。例如次氯酸鹽和酒精是針對COVID?19 防控的常用高效消毒劑，而氯己定、苯扎氯銨對冠狀病毒殺滅效果較差［15］。消毒劑的消毒效果與有效成分相關(guān)，另外pH、溫度、鹽度、有機物等環(huán)境條件都會影響消毒劑的使用效果［16］。使用消毒劑時，應(yīng)根據(jù)消毒劑種類合理選擇使用方式，根據(jù)清潔和污染程度配制有效成分濃度、控制消毒作用時間［14］。

2 微生物對消毒劑的抗性機制

微生物對消毒劑的抗性是指微生物個體或種群，在標(biāo)準(zhǔn)化的定量殺滅試驗中，表現(xiàn)出比標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株和群體明顯更低的微生物減少量［17］。一般可采用最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定、定性懸液試驗、定量懸液試驗和載體試驗等方法評價消毒劑的殺菌效果［18］。如果清潔方式不規(guī)范、濃度或劑量不足、處理時間不夠或長期使用一種消毒劑，會給微生物創(chuàng)造良好的適應(yīng)條件［19］。另外，消毒劑由于長期或過量使用，經(jīng)稀釋殘留進入環(huán)境，可能對環(huán)境微生物生態(tài)多樣性產(chǎn)生影響。微生物會通過表型適應(yīng)、基因突變和水平基因轉(zhuǎn)移等方式提高對消毒劑的耐受性或產(chǎn)生抗性基因。例如，Kampf［20］發(fā)現(xiàn)在低濃度苯扎氯銨暴露下，多種微生物適應(yīng)后MIC值增加4 倍，鼠傷寒沙門氏菌達3 000 mg/L、銅綠假單胞菌達2 500 mg/L、腸桿菌屬達1 500 mg/L、大腸桿菌屬達1 000 mg/L，并且這種抗性能夠穩(wěn)定遺傳［20］。一些消毒劑的副產(chǎn)物也會誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生抗性，比如具有誘變活性的二溴乙酸、二氯乙腈、溴酸鉀和3?氯?4?（二氯甲基）?5?羥基?2（5H）?呋喃酮（MX）等典型消毒副產(chǎn)物可誘導(dǎo)抗生素抗性，甚至產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象［6］。

根據(jù)目前研究，微生物消毒劑抗性機制基本可分為形成生物膜、降低細(xì)胞膜通透性、借助外排泵系統(tǒng)、產(chǎn)生相關(guān)特異性酶、改變靶點等幾種策略（圖1）。在一定環(huán)境和選擇壓力下，消毒劑抗性微生物的抗性基因可通過垂直和水平轉(zhuǎn)移迅速傳播，一方面會降低消毒劑的消毒效率；另一方面，這種基因污染物可能對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在實際環(huán)境中，微生物可能會利用多種策略抵抗消毒劑作用。

Fig.1 The schematic diagram of disinfectant resistance mechanism圖1 消毒劑抗性機理示意圖

2.1 形成生物膜

微生物可通過生物膜的形成產(chǎn)生消毒劑抗性。生物膜是微生物及其分泌物積累形成的聚集體，主要由多糖包被分泌物和胞外聚合物組成。生物膜最早發(fā)現(xiàn)于17世紀(jì)，Van Leeuwenhoek通過改進的顯微鏡觀察到牙齒上的菌斑，而相關(guān)理論直到1978年才發(fā)展起來［21］。生物膜是相關(guān)細(xì)胞群落被封閉在含有開放通道的聚合物基質(zhì)中形成的復(fù)雜表面，細(xì)胞通常不可逆轉(zhuǎn)地附著在載體界面或彼此之間，嵌在胞外高分子物質(zhì)基質(zhì)中，其生長速度和基因轉(zhuǎn)錄等方面可以隨生物膜外部環(huán)境改變而有相應(yīng)的變化［21］。

消毒劑處理可刺激某些微生物形成生物膜。單核細(xì)胞增生李斯特菌在過氧乙酸處理后，容易形成靜態(tài)和連續(xù)流動生物膜，并對氯苯扎和過氧乙酸消毒劑的抗性增高，分析發(fā)現(xiàn)消毒劑處理促使與形成生物膜和抗性相關(guān)的熱激響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子hrcA和分子伴侶dnaK表達增加［22］。在對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的研究中，經(jīng)乙醇和異丙醇消毒劑處理時比未經(jīng)處理的對照組呈現(xiàn)出更高的生物膜水平，且消毒劑濃度越高，生物膜的形成率越高［23］。另一研究用乙醇處理金黃色葡萄球菌后，與生物膜形成相關(guān)的基因icaA和icaD轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，這些基因的表達有助于細(xì)胞間多糖黏附素生成而形成生物膜，同時分析還發(fā)現(xiàn)一些與抗生素抗性相關(guān)的基因表達也增高了［24］。

研究表明，生物膜強弱與抗性高低呈正相關(guān)。含氯消毒劑常用于水處理工藝，反滲透膜中的嗜酸桿菌、沙單胞菌和假單胞菌等耐氯細(xì)菌能通過建立穩(wěn)定的生物膜抵抗氯氣的威脅，導(dǎo)致含氯消毒劑處理的反滲透膜生物污染加重，進一步通過宏基因組學(xué)關(guān)聯(lián)分析顯示，消毒劑抗性與生物膜菌群的群體感應(yīng)基因、胞外多糖合成基因和氨基酸合成基因表達高度關(guān)聯(lián)［25］。Ribic等［8］在對常規(guī)消毒處理的超凈間內(nèi)微生物進行生物膜、消毒劑抗性及相關(guān)基因的調(diào)查中，采用實時定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，95%的葡萄球菌具有生物膜相關(guān)基因icaA、aap、bhp，它們是對季銨鹽消毒劑產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ)；而剛果紅瓊脂法檢測出40%的菌株形成生物膜，結(jié)晶紫染色法確定16%的菌株形成強生物膜。分析表明，形成強生物膜有助于菌株增加對氯化雙癸基二甲基銨（DDAC）的抗性。

形成生物膜能顯著提高微生物消毒劑抗性。首先，生物膜的胞外多糖和蛋白質(zhì)等聚合基質(zhì)結(jié)構(gòu)可形成阻力，延遲消毒劑等物質(zhì)的生物膜基質(zhì)滲透。與游離細(xì)胞相比，生物膜降低了消毒劑對黏附在載體上的大腸桿菌的可及性［26］，對消毒劑的敏感性降至游離細(xì)胞的1%～4%而表現(xiàn)出抗性的提高［27?29］。生物膜的結(jié)構(gòu)成分可以與一些消毒劑發(fā)生反應(yīng)或催化氧化還原過程，使消毒劑部分消耗，一些氧化類消毒劑的功效會受多糖、蛋白質(zhì)和核酸等生物膜基質(zhì)成分影響而降低殺菌效果［30?31］。

另外，有些微生物可通過降低生物膜內(nèi)細(xì)胞生長速度的策略來抵抗消毒劑的作用而增加抗性。生物膜內(nèi)細(xì)胞的生長速度明顯慢于游離微生物細(xì)胞，這種較低的代謝水平使一些消毒劑難以發(fā)揮作用［21］。Legner等［32］利用恒化器模型測定生物膜生長速率，發(fā)現(xiàn)生物膜的形成越強，微生物生長速度越慢，消毒劑的吸收率與滅活率也越低。另一項研究也發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞在生物膜中生長緩慢，同時表現(xiàn)出對頭孢三胺的高抗性［33］。

此外，生物膜中的革蘭氏陰性菌可通過合成調(diào)節(jié)因子對環(huán)境壓力作出反應(yīng)。惡臭假單胞菌的胞外功能σ 因子ECF?10 有助于生物膜形成和藥物外排［34］，新月柄桿菌的胞外功能σ 因子σF 調(diào)控重金屬的應(yīng)激反應(yīng)［35］，銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌可誘導(dǎo)磷酸鹽降解、脂質(zhì)生物合成和多胺生物合成的調(diào)節(jié)因子，有助于提高生物膜的抵抗力和恢復(fù)力，產(chǎn)生對戊二醛的抗性［36］。

一些研究發(fā)現(xiàn)，某些種類的病原性微生物能耐受一定劑量的消毒劑而存活，且傳染性和致病性提高，可能是長期低水平的消毒處理與微生物的生物膜產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)［19］。一方面，生物膜的細(xì)胞和胞外聚合物是一個復(fù)雜而緊湊的多層結(jié)構(gòu)，一系列物理化學(xué)作用會引發(fā)運輸限制，使消毒劑很難穿透并到達內(nèi)層，進而影響消毒功效［37］；而另一方面，病原性微生物生物膜的形成，可能更利于病原菌分泌內(nèi)毒素、分散至宿主體內(nèi)、增強對宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力，這種消毒劑刺激促進生物膜的形成為病原菌提供侵染所需的生態(tài)位，可能導(dǎo)致其更易引發(fā)疾病，應(yīng)該引起關(guān)注［21］。

2.2 降低細(xì)胞膜通透性

細(xì)胞膜是限制物質(zhì)進入細(xì)胞的屏障，一些微生物可通過降低細(xì)胞膜通透性的策略，減少或阻止消毒劑進入微生物細(xì)胞內(nèi)，提高對消毒劑的抗性。該類微生物的消毒劑抗性主要取決于細(xì)胞外膜［38?39］。具有選擇透過性的以磷脂雙分子層為骨架的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組分中，蛋白質(zhì)、磷脂、脂多糖及脂肪酸的結(jié)構(gòu)和組成改變都可能改變細(xì)胞膜通透性，進而會影響消毒劑的殺菌效果［16］。

膜蛋白在參與維持細(xì)胞膜完整性和選擇透過性方面起到重要作用。在消毒劑作用下，其變化可促進微生物存活并增強消毒劑耐受性［38，40］。一方面，增加與細(xì)胞膜穩(wěn)定性和完整性相關(guān)的膜蛋白、脂蛋白、結(jié)合蛋白等可減少消毒劑的破壞。在戊二醛誘導(dǎo)下，熒光假單胞菌secA、secB、secE、secG、secY、yaiC、yidC、lspA等基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，Sec 易位酶的增加有利于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)穩(wěn)定運轉(zhuǎn)；groEL/groES和dnaK的提高可增加伴侶蛋白GroES/GroEL表達，確保蛋白質(zhì)適當(dāng)折疊來維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性；編碼Tol?Pal 系統(tǒng)的folQ、tolA上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平，維持細(xì)胞外膜完整性，從而保障細(xì)胞膜的選擇透過性，阻止消毒劑進入［41］。在含氯消毒劑作用下，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)、細(xì)胞膜破壞、細(xì)胞疏水性等分析發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌細(xì)胞膜損傷較輕、膜蛋白疏水性較高，從而產(chǎn)生耐氯性［42］。另一方面，一些膜蛋白功能的缺陷可以降低微生物對消毒劑的敏感性。長期消毒可能導(dǎo)致恥垢分枝桿菌和龜分枝桿菌Msp孔蛋白活性缺陷，對戊二醛和鄰苯二甲醛的敏感性降低［43?44］。Chiu 等［45?46］發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌Imp/OstA蛋白的破壞會降低細(xì)胞膜通透性，使其對有機消毒劑的敏感性下降。Machado 等［38］采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究銅綠假單胞菌對苯扎溴銨氯化物的適應(yīng)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)抗性作用源于孔蛋白OprF和OprG、脂蛋白OprL 和OprI的表達減少，無法正常維持細(xì)胞形狀和細(xì)胞膜流動性，這種功能缺陷會減少細(xì)胞與外界物質(zhì)交換的通道，可能同時存在適應(yīng)性和獲得性兩種抗性。

磷脂、脂多糖等結(jié)構(gòu)和組成也可降低細(xì)胞膜通透性，阻擋消毒劑入侵。疏水性消毒劑可由外膜蛋白清除，而親水性消毒劑可通過膜孔蛋白擴散方式進入微生物細(xì)胞膜，但會被脂多糖和磷脂層截留，尤其不易侵入外膜具有不對稱脂多糖結(jié)構(gòu)的革蘭氏陰性菌［1］。此外，在鼠傷寒桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，內(nèi)膜蛋白YejM 依賴鎂離子而具有磷酸酶活性，可以調(diào)節(jié)外膜中甘油磷脂（PL）和脂多糖（LPS）的平衡，從而改變外膜通透性來抵抗消毒劑［47］。

2.3 外排泵系統(tǒng)

與限制消毒劑進入細(xì)胞不同，一些抗性微生物面對消毒劑的威脅時，通過外排泵外排策略快速、有效地減少細(xì)胞內(nèi)的消毒劑劑量，從而實現(xiàn)抗性［48］。外排泵是存在于微生物細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)，可分為多個膜蛋白家族，包括主要促進因子超家族（MFS）、多藥及有毒化合物排出家族（MATE）、小多藥耐藥家族（SMR）、以質(zhì)子動力為轉(zhuǎn)運底物的抗性?結(jié)瘤?細(xì)胞分裂超家族（RND）和利用ATP 結(jié)合能和水解來運輸?shù)孜锏腁TP 結(jié)合盒超家族（ABC）［49］。研究腸桿菌選擇性TolC 非依賴外排泵時，還發(fā)現(xiàn)陽離子擴散促進因子家族（CDF）和蛋白質(zhì)細(xì)菌抗菌復(fù)合外流家族（PACE）［50］。外排泵系統(tǒng)的類型十分復(fù)雜，表2 列舉了不同家族的結(jié)構(gòu)特征和具體種類。

Table 2 Characteristics and types of efflux pump system family［49-53］表2 外排泵系統(tǒng)家族特征及種類［49-53］

外排泵通常由多個系統(tǒng)協(xié)同工作，其過度表達可以單獨或與其他抗性機制共同作用抵抗消毒劑，避免損傷［1］。根據(jù)底物特異性和DNA序列同源性，依賴于質(zhì)子動力的轉(zhuǎn)運蛋白分為qacA/B和qacC編碼的兩個家族［54］。常規(guī)消毒條件下，一些工業(yè)潔凈室的表面葡萄球菌具有對二癸基二甲基氯化銨的耐藥性，其中超過95%檢測出同時具有qacA/B和qacC［8］。對于單獨或組合攜帶norA、qacA和qacC的金黃色葡萄球菌菌株，研究發(fā)現(xiàn)攜帶多個外排泵的菌株抗性更強，預(yù)先暴露于苯扎氯銨的菌株會對氯己定有更高的耐受性［55］。

隨著研究深入，確定的外排泵相關(guān)基因也逐漸完善，基因檢測等分子手段常用于抗性機制的研究。Moretro 等［4］發(fā)現(xiàn)，qacH和bcrABC賦予單核細(xì)胞增生李斯特菌對季銨鹽消毒劑的抗性，是編碼外排泵系統(tǒng)的決定因子。Meier 等［56］在瑞士和芬蘭的大多數(shù)苯扎氯銨抗性單核細(xì)胞增生李斯特菌中檢測到qacH，部分檢測到bcrABC。Labreck 等［55］通過對抗性金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)暴露于苯扎氯銨可以顯著誘導(dǎo)qacA和norA的表達，從而增加氯己定耐受性。Hassan等［52］發(fā)現(xiàn)編碼外排系統(tǒng)相關(guān)蛋白AceI的基因可有效誘導(dǎo)鮑曼不動桿菌對氯己定的抗性，采用基因合成方法進行密碼子優(yōu)化，克隆至大腸桿菌的表達系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)包括AceI及其同系物在內(nèi)的24 個BTP 結(jié)構(gòu)域蛋白中，有87.5%用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測到表達，75%促成了大腸桿菌對一種或多種抗菌藥物的抗性。

利血平等外排泵抑制劑可以抑制耐藥細(xì)菌對藥物的外排，從而恢復(fù)其對抗生素的敏感性，可以用來確定抗性機制。Jiang等［5］研究零售食品中單核細(xì)胞增生菌由外排泵介導(dǎo)的對苯扎氯銨的抗性時，用利血平發(fā)現(xiàn)存在質(zhì)粒基因bcrABC介導(dǎo)和染色體介導(dǎo)的外排泵。Meier 等［56］針對14 株缺乏已知抗性基因的單核細(xì)胞增生李斯特菌，加入利血平分析細(xì)菌抗性，確定了其中10 株的耐藥性部分或完全依賴外排泵。

2.4 抗性相關(guān)特異性酶

微生物面對消毒劑的威脅，可通過特異性酶的作用減輕或消除傷害。一方面可能產(chǎn)生針對消毒劑的特異性降解酶，將消毒劑清除；另一方面可能產(chǎn)生具有特定功能的酶，調(diào)節(jié)自身，增強對消毒劑的耐受性。一些分子伴侶、調(diào)節(jié)蛋白、輔酶因子等也在其中起到重要作用。

一些種類的消毒劑具有強氧化性，可直接或間接通過活性氧或自由基破壞微生物細(xì)胞膜脂系統(tǒng)，使蛋白質(zhì)和核酸變性來殺死細(xì)胞，而微生物細(xì)胞的氧化還原系統(tǒng)可產(chǎn)生與之對抗的特異性酶而產(chǎn)生抗性。比如，在含氯消毒劑作用下，銅綠假單胞菌編碼烷基氫過氧化物酶AhpD 的rcsA高度表達［57］，假單胞菌的抗氧化酶、β 內(nèi)酰胺酶表達顯著上調(diào)［7］，分枝桿菌的超氧化物歧化酶（SOD）活性提高［42］，引發(fā)的代謝變化有利于降解次氯酸鹽消毒劑。對過氧化氫的抗性與過氧化氫酶?過氧化物酶有關(guān)，這種酶同時具有過氧化物酶活性和過氧化氫酶活性，能夠用外部還原劑還原過氧化氫或使其歧化為水和氧，其中KatG 在中性溶液中具有高催化活性［58］。低濃度過氧化氫處理釀酒酵母可促進過氧化氫酶活性的增加［59］，銅綠假單胞菌生物膜對氧化劑的抗性也與細(xì)胞外基質(zhì)中的過氧化氫酶等保護酶有關(guān)［26］，調(diào)節(jié)蛋白Yap1在此應(yīng)激效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［60］。Seaver等［61］通過測定總過氧化氫酶活性、過氧化氫酶活性和β?半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶突變體具有快速清除過氧化氫的能力，進一步分析發(fā)現(xiàn)保護作用是由烷基過氧化氫還原酶Ahp提供的。

還有一些特異性降解酶或轉(zhuǎn)化酶可增加微生物對多種消毒劑的抗性。比如，甲醛脫氫酶可催化醛的歧化反應(yīng)，大多依賴谷胱甘肽和輔酶發(fā)揮降解作用，可以協(xié)助惡臭假單胞菌降解甲醛、乙醛、丙醛等醛類消毒劑［62］。有機汞裂解酶基因merB和汞離子還原酶基因merA由質(zhì)粒/轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)，可編碼降解無機和有機汞化合物的水解酶和還原酶，其過度表達可使微生物產(chǎn)生汞抗性［63］。依賴fad的十四烷基三甲基銨單加氧酶（TTABMO）能夠通過生理途徑氧化季銨鹽化合物，催化十四烷基三甲基溴化銨的分解，從而增加惡臭假單胞菌（ATCC 12633）對季銨鹽類消毒劑的抗性［64］。

此外，一些微生物會產(chǎn)生特異性酶改變自身特性，間接抵抗消毒劑入侵。一些革蘭氏陰性桿菌的特異性磷酸酶YejM 具有依賴于鎂離子和活性位點完整性的磷酸酶活性，可以調(diào)節(jié)外膜的物質(zhì)組成來誘導(dǎo)抗性［47］。熒光假單胞菌在戊二醛刺激下，可提高蛋白酶ClpB1、HslU的合成，保證受損蛋白質(zhì)的去除，而且菌株能量生產(chǎn)系統(tǒng)會加強，氧化磷酸化相關(guān)的NADH/泛醌氧化還原酶、琥珀酸/泛醌氧化還原酶、泛醌/鐵細(xì)胞色素c 氧化還原酶、氧/鐵細(xì)胞色素c氧化還原酶和ATP合成酶上調(diào)，三羧酸（TCA）循環(huán)相關(guān)的丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰輔酶A連接酶、琥珀酸脫氫酶、富馬酸脫氫酶和鐵氧還蛋白也上調(diào)，能夠增加ATP生成，保障能量供給，增強抵抗消毒劑的能力［41］。

2.5 改變消毒劑作用靶點

微生物可以通過在結(jié)合位點或結(jié)合位點附近進行突變或酶修飾，使靶點發(fā)生物理改變，從而減少與消毒劑的結(jié)合。一般來說，消毒劑比抗生素具有更廣泛的活性，因為抗生素在細(xì)胞內(nèi)往往具有特定靶點，而消毒劑通常具有多個靶點［5，17］。因此，改變靶點的抗性機制通常存在于抗生素抗性機制中，在消毒劑的抗性機制中則較為少見。

三氯生是一種能夠緩慢、可逆、緊密結(jié)合大腸桿菌fabI的抑制劑。Sivaraman等［65］研究發(fā)現(xiàn)，由fab編碼的對三氯生的抗性屬于靶點變更，通過誘發(fā)突變和氫鍵檢測等手段，確定三氯生對突變體G93V、M159T 和F203L 的親和力顯著降低。Skovgaard 等［66］用DNA 序列分析驗證了此機制，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)菌株攜帶編碼烯醇?；d體蛋白還原酶亞型fabI的突變基因，可以增加三氯生的靶點fabI表達，減少三氯生?NAD+?fabI三元復(fù)合物的產(chǎn)生。

3 消毒劑抗性相關(guān)基因的獲得與傳播風(fēng)險

抗性微生物及抗性基因的產(chǎn)生和傳播給環(huán)境保護、種養(yǎng)殖業(yè)、食品安全、衛(wèi)生防疫以及醫(yī)院抗感染治療帶來巨大的困難和挑戰(zhàn)。微生物的消毒劑抗性可分為固有抗性和獲得抗性（acquired resistance），其中獲得抗性包括自身突變和外源獲得兩種途徑。

微生物在自然生長及傳代過程中會不斷發(fā)生各種基因突變，在理化因素作用下可能更容易發(fā)生突變，但這些自發(fā)和誘變產(chǎn)生消毒劑抗性的頻率很低。研究發(fā)現(xiàn)，低于致死濃度的消毒劑或其消毒副產(chǎn)物可能誘導(dǎo)抗性基因的產(chǎn)生，并使獲得抗性相關(guān)基因的微生物得以富集。例如，三氯生可誘發(fā)大腸桿菌產(chǎn)生多種抗性響應(yīng)策略，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致fabI、frdD、marR、acrR和soxR等抗性相關(guān)基因的突變［67］。當(dāng)銅綠假單胞菌暴露于亞致死濃度的過氧乙酸時，可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞保護過程的相關(guān)基因而產(chǎn)生抗性［68］。金黃色葡萄球菌抗性菌株產(chǎn)生norA、norB、norC、mepA、mdeA、qacA/B等外排泵基因并過量表達［69］。Ortiz 等［70］用微生物全基因組測序（WGS）和電子多位點序列分型分析（MLST）確定了單核細(xì)胞增生菌的兩個主要抗性類型是prfA突變株S1（ST 31 型）及含抗性轉(zhuǎn)座子Tn6188 的菌株（ST 121型）。

微生物消毒劑性抗基因的獲得和轉(zhuǎn)移可由染色體介導(dǎo)，也可由質(zhì)粒介導(dǎo)。一般來說，染色體介導(dǎo)的抗性基因主要通過傳代過程垂直傳播或者同種間傳播，而質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性更容易引發(fā)抗性基因在不同種屬間的水平轉(zhuǎn)移而增加抗性及抗性基因的傳播風(fēng)險（圖2）。

3.1 染色體介導(dǎo)的消毒劑抗性

微生物染色體基因突變，以及染色體的缺失、插入和取代等染色體變異，都可能使微生物產(chǎn)生對消毒劑的抗性。在季銨鹽類消毒劑的壓力或誘導(dǎo)下，染色體編碼的基因突變可能會觸發(fā)控制外排泵表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)、導(dǎo)致外排泵過度表達、提高泵的外排效率等，使適應(yīng)微生物對季銨鹽類消毒劑和外排泵其他底物的耐受性增加2～8 倍［71］?；钚匝酰≧OS）介導(dǎo)的marR、rob、sdiA、cytR和crp的染色體突變等抗性關(guān)鍵決定因素，會導(dǎo)致編碼AcrAB?TolC 泵等多藥流出泵系統(tǒng)的基因調(diào)控發(fā)生變化，可能提高大腸桿菌對環(huán)己烷等一些高疏水性有機消毒劑的耐受性［72?73］。與之類似，過氧化氫能誘導(dǎo)recA控制的抗性，降低大腸桿菌WP2 細(xì)胞中醛類消毒劑的殺傷作用，產(chǎn)生交叉適應(yīng)性反應(yīng)［74］。另有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌基因組中的relA、marC、proQ、yfgO和rraA與氨基酸生物合成途徑、鐵離子穩(wěn)態(tài)和能量代謝相關(guān)，5種突變能增加對丙二醇的抗性［75］。單核細(xì)胞增生菌也具有染色體介導(dǎo)的外排泵，造成其對苯扎氯銨的抗性，可用外排泵抑制劑利血平證明［5］。

此外，可移動遺傳元件（mobile genetic elements，MGE）是微生物獲得和傳播消毒劑抗性的重要載體，包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列、細(xì)菌噬菌體和其他整合性接合元件（ICE）等［76］。MGE可能引起一系列遺傳學(xué)效應(yīng)，包括引起插入突變、染色體畸變、產(chǎn)生新的基因變異、調(diào)節(jié)基因活動等［77］。比如，Petty 等［78］在對一種全球擴散的多重耐藥性尿路病原體大腸桿菌分型ST131的研究發(fā)現(xiàn)，其每個亞系相關(guān)的大多數(shù)單核苷酸變異是MGE 相鄰區(qū)域的重組所致，證明了MGE 和重組在這一抗性病原體進化中的作用。銅綠假單胞菌有巨大的細(xì)菌基因組，并能夠通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得大量基因，Botelho 等［76］認(rèn)為MGE是其產(chǎn)生抗性的重要驅(qū)動因素，微生物獲得并適應(yīng)MGE，在共同進化過程中還可能發(fā)生一些補償性突變。ICE可攜帶編碼多種表型的基因，包括對重金屬的抗性［79?80］和降解芳香化合物的能力［81］等，可能整合至微生物的染色體，賦予其相應(yīng)的抗性。

3.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的消毒劑抗性

質(zhì)粒是微生物染色體外能夠自主復(fù)制的另一重要遺傳物質(zhì)，通常呈環(huán)狀閉合的雙鏈DNA。根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)和轉(zhuǎn)移特點，質(zhì)粒可分為接合型和非接合型兩類，其中接合型質(zhì)粒帶有轉(zhuǎn)移基因。接合性質(zhì)粒和ICE 具有接合轉(zhuǎn)移位點oriT、松弛酶（Mob）、IV 型伴侶蛋白（T4CP）和IV 型分泌系統(tǒng)（T4SS）4個轉(zhuǎn)移功能區(qū)，具有滾環(huán)復(fù)制和接合轉(zhuǎn)移等典型單鏈DNA自行轉(zhuǎn)移特性［82］。微生物對消毒劑抗性可能由質(zhì)粒介導(dǎo)，質(zhì)粒中消毒劑抗性基因的存在與菌體MIC 敏感性的降低呈相關(guān)性［83］。例如，Littlejohn 等［84］早在1991 年就通過測定2.4 kb 質(zhì)粒的pSK89全序列，在金黃色葡萄球菌消毒劑抗性株中發(fā)現(xiàn)外排泵基因qacC/qacD。Sasatsu 等［85］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對溴化乙錠等消毒劑的抗性與質(zhì)粒中與qacC、qacD同源的ebr有關(guān)，測序發(fā)現(xiàn)高抗性菌株的質(zhì)粒pTZ22 攜帶的抗性基因ebr加倍，外排泵效率提高了1倍，進一步將此質(zhì)粒的抗性基因插入到pUC19 并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，大腸桿菌對戊二醛的抗性提高，MIC 由對照菌株的100 mg/L提高到1 600 mg/L。Leelaporn 等［86］通過DNA?DNA 雜交分析和表型耐藥性研究，檢測凝固酶陰性葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的多藥外排基因qacA和qacC都位于質(zhì)粒上，qacA位于>10 kb的質(zhì)粒上，qacC主要位于2～3 kb的質(zhì)粒上。

獲得性抗性基因常借助質(zhì)粒和ICE 等MGE，通過接合轉(zhuǎn)移等方式在微生物間水平轉(zhuǎn)移。SMR家族的季銨鹽類消毒劑專用多藥外排泵基因包括emrE、sugE、qacE、qacΔE、qacF、qacG、qacH、qacI、qacJ和qacZ等外排決定基因，這些外排蛋白基因主要位于轉(zhuǎn)座子、ICE、質(zhì)粒和整合子等流動遺傳元件中，可以在同一或不同屬的微生物之間水平轉(zhuǎn)移［71］。比如，在肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)的qacA、qacΔE、qacE、acrA與對戊二醛等消毒劑的抗性有關(guān)，可以使細(xì)菌對乙醇的MIC 增長為無抗性基因菌株的16 倍，存在于質(zhì)粒且能夠整合至染色體［87］。多數(shù)可移動質(zhì)粒是通過表達Mob 利用接合元件匹配孔的，Mob 作用于質(zhì)粒的同源oriT［88］。為深度解讀海量可移動基因組數(shù)據(jù)，Li等［89］開發(fā)了生物信息學(xué)軟件oriTfinder，用于快速識別質(zhì)粒和ICE 序列中的oriT、Mob、T4CP 和T4SS 等接合轉(zhuǎn)移功能模塊，構(gòu)建并提出接合轉(zhuǎn)移、非自主轉(zhuǎn)移和不可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒等歸類方法，可用于分析細(xì)菌全基因組序列及批量分析。此類技術(shù)的發(fā)展和完善將有助于微生物消毒劑抗性基因研究的深入，明確抗性基因的轉(zhuǎn)移方式和路徑。

3.3 獲得抗性和抗性基因的水平傳播

微生物對消毒劑的抗性基因常借助MGE 在微生物間水平轉(zhuǎn)移［90］，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合轉(zhuǎn)移等方式廣泛傳播并增加抗性［91?94］。一些研究證實，消毒劑能夠促進質(zhì)粒攜帶的抗性基因在不同微生物間轉(zhuǎn)移，而一些抗性基因不易被一般消毒方法除去，這將加劇全球使用消毒劑可能存在的風(fēng)險［12］。Luprano 等［95］發(fā)現(xiàn)，過氧乙酸消毒無法消除環(huán)境中ampC、mecA、ermB、sul1、sul2、tetA、tetO、tetW、vanA等抗性基因。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS 的形成、SOS反應(yīng)、細(xì)胞膜通透性的增加以及相關(guān)基因表達的改變可能增強接合轉(zhuǎn)移。Lu等［96］通過表型實驗、全基因組RNA 測序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境濃度的三氯生暴露可誘導(dǎo)微生物細(xì)胞ROS產(chǎn)生量增長至原來的1.3～1.5倍，引起細(xì)胞膜損傷，上調(diào)外膜孔蛋白翻譯，增強一般分泌系統(tǒng)Sec 約1.4倍、雙精氨酸轉(zhuǎn)位系統(tǒng)Tat約1.2倍和IV型菌毛分泌系統(tǒng)約2.5 倍，有助于微生物通過菌毛捕獲和細(xì)胞膜通道的轉(zhuǎn)運等方式獲得外源基因，使攜帶精氨酸合成基因的質(zhì)粒向大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化提高1.4 倍。生物膜的形成會導(dǎo)致微生物群體中出現(xiàn)廣泛的遺傳多樣性，高細(xì)胞密度、基質(zhì)的存在、大量DNA 的釋放和生物膜內(nèi)的營養(yǎng)條件都可能促進接合和轉(zhuǎn)化過程［37］?；虻霓D(zhuǎn)移賦予受體新的代謝能力，使之適應(yīng)新的生態(tài)位［91］。

一些消毒方式會對抗性基因的轉(zhuǎn)移有不同程度的影響。通常高劑量的消毒劑會取得更好的滅菌效果，而劑量不足則可能引發(fā)抗性擴散的不良后果。用0.2 mmol/L過氧化氫處理恥垢分枝桿菌后的轉(zhuǎn)錄分析表明，糖酵解、糖異生和脂肪酸代謝等代謝途徑可能參與抗性反應(yīng)；而7 mmol/L 過氧化氫處理時，編碼核糖體的基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，會影響蛋白質(zhì)合成裝置，減少蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)菌生長減少［97］。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的紫外線或氯氣均可顯著抑制精氨酸轉(zhuǎn)移的頻率，而低劑量的紫外線消毒和氯化對接合轉(zhuǎn)移有不同影響，紫外線照射只減少細(xì)菌數(shù)量，不改變細(xì)胞通透性，因此影響很小，而氯胺刺激可提高細(xì)胞的通透性，細(xì)胞表面誘導(dǎo)出的菌毛是精氨酸轉(zhuǎn)移的途徑，于是低劑量氯消毒可提高接合轉(zhuǎn)移頻率2～5 倍［98］。與之類似，游離氯、氯胺和過氧化氫的亞抑制濃度（低于MIC）導(dǎo)致種內(nèi)接合轉(zhuǎn)移的頻率較對照組增加1.5～7.5 倍、屬間接合轉(zhuǎn)移頻率較對照組增加1.4～2.3 倍，而高于MIC的消毒劑顯著抑制接合轉(zhuǎn)移［99］。

4 消毒劑抗性與抗生素抗性的關(guān)聯(lián)

微生物對抗生素的耐藥性已構(gòu)成世界性危機，除醫(yī)療機構(gòu)外，更多的研究調(diào)查從污水處理廠、養(yǎng)殖場、土壤、水體等各種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)廣泛存在的抗生素抗性基因（ARG）和抗生素抗性細(xì)菌（ARB）。這會加劇ARB 全球傳播的環(huán)境風(fēng)險，目前ARG 已歸為新興污染物，引發(fā)了全球的關(guān)注［100］。消毒劑作為另一類殺滅微生物的物質(zhì)，微生物對其也會產(chǎn)生抗性，相關(guān)抗性基因的傳播機制及潛在危害也逐漸引起研究者的重視。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，消毒劑抗性與抗生素抗性之間具有一定的關(guān)聯(lián)性。Lyon 等［101］研究質(zhì)粒介導(dǎo)的消毒劑抗性基因時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)編碼多藥外排系統(tǒng)的基因位于含有青霉素、慶大霉素、甲氧芐啶和卡那霉素等抗生素耐藥基因的質(zhì)粒上，可以說明消毒劑抗性與抗生素抗性之間具有一定的相關(guān)性。Amsalu 等［102］研究銅綠假單胞菌在不同自然生態(tài)位中同時對多種抗生素和消毒劑產(chǎn)生耐藥性的能力，發(fā)現(xiàn)存在交叉耐藥性，其主要促成因素是調(diào)節(jié)基因mexR、nalC或nalD及相應(yīng)氨基酸突變導(dǎo)致的MexAB?OprM藥物外排泵的過度表達。

此外，消毒劑暴露下誘導(dǎo)出的抗性微生物往往也能抵抗一定濃度的抗生素，甚至可能促進微生物抗生素耐藥性的產(chǎn)生和傳播。比如，土壤中銅、鋅濃度與ARG和MGE基因豐度之間存在相關(guān)性［103］，垃圾填埋場中ARG與MGE的相對豐度與砷、鎘含量顯著相關(guān)，表明ARG 的出現(xiàn)主要受重金屬消毒劑和MGE 的影響，造成抗生素耐藥性傳播的風(fēng)險［104］。飲用水氯消毒時，消毒劑的副產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)抗生素抗性，導(dǎo)致群落抗生素耐藥性與抗生素水平不一致［6］。究其原因，氯化過程能夠通過自然轉(zhuǎn)化促進質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致ARG 在屬間的交換和新型ARB 的出現(xiàn)，氯損傷還會使致病菌從非ARB 轉(zhuǎn)移到ARB，而且轉(zhuǎn)移元件很難通過消毒降解［100］。總之，多種消毒劑可以通過誘導(dǎo)基因突變增強微生物的抗生素抗性，從而增加抗生素抗性基因在環(huán)境中傳播的潛在風(fēng)險。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，微生物可通過形成生物膜、改變細(xì)胞膜滲透性、過量表達外排泵、產(chǎn)生消除或減弱消毒劑的特異性酶及改變作用靶點等策略產(chǎn)生針對消毒劑的抗性。抗性基因可由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)，并且不合理使用消毒劑可能會誘導(dǎo)抗性并加劇抗性基因的傳播風(fēng)險。大量環(huán)境調(diào)查和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的病原檢測發(fā)現(xiàn)微生物的消毒劑抗性與抗生素抗性存在一定關(guān)聯(lián)，消毒劑的不規(guī)范使用不僅能加劇消毒劑抗性基因污染，而且還會增加抗生素抗性基因傳播，對環(huán)境和醫(yī)療健康造成更大的風(fēng)險。

目前國內(nèi)外缺乏對微生物消毒劑的抗性機理、抗性基因轉(zhuǎn)移，以及與微生物特性、消毒水平及環(huán)境條件等有關(guān)的研究［1］。消毒劑不規(guī)范使用及可能存在的環(huán)境風(fēng)險已經(jīng)引起全球關(guān)注，其中歐盟已頒布評估消毒劑環(huán)境風(fēng)險的法律條款，統(tǒng)一市場運作和管理，確保消毒劑不危害環(huán)境和人類健康［9］。并已提出減少長期使用單一消毒劑，選擇加熱、臭氧、UV等替代措施進行消毒。而針對生物膜結(jié)構(gòu)等抗性機制，應(yīng)用酶處理會提高消毒效率［37］，可以聯(lián)合使用多種處理方法協(xié)同作用來更徹底地消除有害微生物，避免消毒劑抗性的產(chǎn)生和傳播。另外值得注意的是，相對于抗生素抗性，微生物消毒劑抗性機制更復(fù)雜。今后應(yīng)加強針對不同消毒劑的抗性研究，尤其是作為抗性傳播重要載體的MGE 在抗性水平轉(zhuǎn)移方面的研究，利用轉(zhuǎn)座子突變體庫等分子生物學(xué)先進技術(shù)，聯(lián)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)分析手段，開發(fā)相應(yīng)的消毒劑抗性基因數(shù)據(jù)庫和相應(yīng)生物信息學(xué)分析工具，廣泛開展微生物消毒劑抗性、抗性相關(guān)基因及產(chǎn)生機制的研究，深入探索微生物對消毒劑抗性的產(chǎn)生和傳播機理，為科學(xué)有效使用消毒劑、減少消毒劑抗性風(fēng)險提供理論支持。