細(xì)菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其在耐藥中的作用*

呂鑠言 張貴鑫 朱禹奇 賈 宇 關(guān)松磊

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118）

抗生素的大量使用加劇了耐藥菌的產(chǎn)生以及耐藥基因的傳播［1］。日益增多的耐藥細(xì)菌給臨床感染性疾病的治療帶來巨大挑戰(zhàn)。細(xì)菌耐藥的機制復(fù)雜，主要包括：產(chǎn)生抗生素滅活酶、改變細(xì)胞外膜通透性、激活主動外排系統(tǒng)、形成生物被膜、改變抗菌藥物作用靶位、基因突變等。細(xì)菌中存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通過細(xì)胞之間或細(xì)胞與環(huán)境的信息傳遞，感知并協(xié)調(diào)集體行為，幫助細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境，產(chǎn)生耐藥性［2］。本文主要總結(jié)了雙組分系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、第二信使、吲哚等細(xì)菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或分子在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生、傳播、擴散過程中的作用，為今后阻遏細(xì)菌耐藥性傳播奠定基礎(chǔ)。

1 雙組分系統(tǒng)

1.1 雙組分系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

雙組分系統(tǒng)（two?component system，TCS）是細(xì)菌感知和響應(yīng)外界環(huán)境變化最主要的信號系統(tǒng)，它在細(xì)菌生長、耐藥性、毒力、生物膜形成等方面發(fā)揮重要作用［3］。TCS根據(jù)不同的磷酸基團(tuán)傳遞步驟分為兩類：經(jīng)典系統(tǒng)和非經(jīng)典系統(tǒng)。它們都由兩個基本結(jié)構(gòu)組成：a.組氨酸蛋白激酶（histidine kinase，HK），它是由兩個單體組成的同源二聚體膜蛋白；b.反應(yīng)調(diào)控蛋白（response regulator protein，RR）。TCS 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由信號輸入、HK 自我磷酸化、RR 磷酸化及信號輸出等環(huán)節(jié)構(gòu)成［4］。HK通過傳感器結(jié)構(gòu)域感受刺激，當(dāng)其感應(yīng)到環(huán)境刺激信號時發(fā)生二聚化，催化ATP 依賴的特定組氨酸殘基自我磷酸化，把磷酸基團(tuán)結(jié)合于下游的RR磷酸接受器結(jié)構(gòu)域的天門冬氨酸殘基上，由此激活效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，促使RR與相關(guān)基因啟動子和蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)，從而完成應(yīng)答反應(yīng)［5］。在經(jīng)典途徑中，HK 與RR 之間的磷酸基團(tuán)僅需一次傳遞即可完成反應(yīng)；而在非經(jīng)典系統(tǒng)中，磷酸基團(tuán)則需要多步傳遞最終完成調(diào)控反應(yīng)，包括雜合TCS 和復(fù)雜TCS［6］。故而TCS 主要是將HK 傳遞器中組氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RR磷酸接受器上，也就是通過磷酸基團(tuán)的傳遞進(jìn)而實現(xiàn)信號的輸入及輸出［7］（圖1）。

TCS在革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽性菌中都存在。不同種屬、不同菌株TCS 的種類差別較大。其中大腸桿菌的TCS 研究得最為透徹，Oshima等［8］通過檢測K?12菌株TCS缺失突變體的mRNA表達(dá)譜，得出大腸桿菌K?12菌株中含有18種TCS，功能涉及耐藥性、呼吸調(diào)控、耐藥性調(diào)控、趨化性、能量代謝、鹽代謝調(diào)控、鞭毛合成、滲透壓調(diào)控等。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時，大腸桿菌可以通過諸多的TCS產(chǎn)生響應(yīng)信號，進(jìn)而調(diào)控菌體狀態(tài)［9］。

Fig.1 Signal transduction process of two-component system［6-7］圖1 TCS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［6-7］

1.2 細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與耐藥性的關(guān)系及機制

TCS作為細(xì)菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要形式，已被證實與耐藥性有關(guān)（表1）。TCS 參與的耐藥機制較為復(fù)雜［10?11］，主要包括以下5條途徑。a.促進(jìn)生物膜形成：生物膜通過包裹細(xì)菌，形成屏障阻止抗生素的滲入，是引起細(xì)菌耐藥的主要機制之一。形成生物膜的細(xì)菌耐藥性極強，且可以逃避宿主的免疫識別，造成臨床治療的困難［12］。TCS 系統(tǒng)是調(diào)控生物膜形成的4種機制之一。許多TCS都在生物膜形成過程中發(fā)揮作用，如銅綠假單胞菌中的GacS/GacA 和SagS TCS。GacS/GacA TCS 通過激活rsm基因，編碼兩個小的ncRNA（RsmY和RsmZ），其高表達(dá)時細(xì)菌呈生物膜狀態(tài)，低表達(dá)時呈浮游狀態(tài)；SagS系統(tǒng)的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域HmsP可調(diào)節(jié)生物膜形成，ΔsagS菌株會恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性［13］。此外，表皮葡萄球菌的SrrBA TCS也具有促進(jìn)菌體生長和生物膜形成的能力［14］。b.上調(diào)藥物外排泵的表達(dá)水平：細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)對藥物的濃度敏感，通過外排作用誘導(dǎo)耐藥。如QseBC TCS 通過調(diào)節(jié)外排泵基因的轉(zhuǎn)錄水平（如acrA、acrB、acrD等基因）或促進(jìn)生物膜合成調(diào)控耐藥性［15?16］。EvgS/EvgA TCS 通過調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)來增加藥物外排的效率，增強了大腸桿菌對阿霉素、紅霉素以及結(jié)晶紫的耐藥性［17］。Wang 等［18］在BaeSR TCS 中發(fā)現(xiàn)，BaeR 過量可以降低外膜TolC 蛋白以及ompR、marA、rob基因的表達(dá)水平，進(jìn)而降低無acrB大腸桿菌對頭孢菌素的敏感性，同時也可以通過上調(diào)MdtABC 泵的表達(dá)量，增加抗生素的外排［19］。AdeRS TCS可以通過上調(diào)AdeAB（C）外排泵的活性，誘導(dǎo)對替加環(huán)素的耐藥性［20?21］。c.激活抗生素滅活酶：銅綠假單胞菌中的CreBC TCS 不僅影響生物膜的形成，還激活染色體ampC基因，進(jìn)而激活β?內(nèi)酰胺酶，水解β?內(nèi)酰胺類抗生素［22］。此外，GluSR、PhoPQ TCS 也可以激活β?內(nèi)酰胺酶引起β?內(nèi)酰胺類抗生素的抗性［23?24］。d.應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)抗生素耐藥：在β?內(nèi)酰胺類抗生素環(huán)境下，細(xì)菌細(xì)胞壁遭到破壞，細(xì)菌ftsI基因產(chǎn)物青霉素結(jié)合蛋白3（PBP3）的失活能夠激活DpiB/A 雙組分信號，中斷DNA 復(fù)制從而誘導(dǎo)細(xì)菌DNA 損傷修復(fù)機制（SOS 反應(yīng)）發(fā)生，使細(xì)菌在惡劣環(huán)境中存活［25］。e.修飾細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)：CesRK、CesSR、CiaRH、WalKR TCS 在抗生素環(huán)境中，通過上調(diào)細(xì)胞膜相關(guān)基因的表達(dá)，修飾細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或增強細(xì)胞壁的合成［26?27］，使抗生素不易進(jìn)入菌體內(nèi)造成破壞。以上研究均表明，TCS在細(xì)菌耐藥過程中具有不可或缺的作用。

Table 1 Two-component systems associated with bacterial resistance表1 與細(xì)菌耐藥性有關(guān)的雙組分系統(tǒng)

2 群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)是細(xì)菌感應(yīng)自身群體密度的信號系統(tǒng)，這種感應(yīng)作用依賴于細(xì)菌自分泌的信號分子（autoinducer，AI），當(dāng)自身密度達(dá)到閾值時信號分子與受體蛋白相互作用，從而導(dǎo)致群體中基因表達(dá)的協(xié)調(diào)變化，是菌體之間信號聯(lián)絡(luò)的主要方式之一。它依賴于細(xì)胞外信號的產(chǎn)生和傳遞，在毒力、生物膜形成、菌體生長、Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、抗生素抗性及與生物體共生等方面有重要作用［28?30］。不同的種屬擁有不同的群體系統(tǒng)及信號分子，主要包括［31］：a.以?；呓z氨酸內(nèi)酯（N?acyl homoserine lactone，AHL）為自誘導(dǎo)信號的革蘭氏陰性菌LuxI（AHL 合成酶）/LuxR（AHL 受體）系統(tǒng)［32］，包括4 個子系統(tǒng)（Las、Rhl、Qqs、Iqs），3?oxo?C12?HSL和C4?HSL等都屬于AHL 的同系物［33］。b.以寡肽AIP（寡肽類物質(zhì)）為信號分子的革蘭氏陽性菌，以TCS 為信號系統(tǒng)，如葡萄球菌的Agr系統(tǒng)。此外，革蘭氏陽性菌還可以通過γ?丁內(nèi)酯（GBL）與AHL 受體結(jié)合，形成革蘭氏陽性菌與陰性菌之間的信號通訊［34］。c.LuxS/AI?2 系統(tǒng)以呋喃硼酸二酯（furanosyl borate diester，AI?2）為信號分子，屬于種間QS系統(tǒng)，在革蘭氏陽性菌與陰性菌中都有分布。d.擴散性信號分子（diffusible signal factor，DSF）。以上QS系統(tǒng)各具特點，在介導(dǎo)細(xì)菌耐藥過程中發(fā)揮作用。QS 可通過調(diào)控生物被膜、藥物外排泵、抗生素水解酶活性及可移動元件等多種機制影響耐藥（圖2）。其中，調(diào)控生物被膜形成是QS系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌耐藥最主要的作用。

Fig.2 Mechanism of quorum sensing system inducing drug resistance圖2 群體感應(yīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)耐藥的機制

2.1 LuxI/luxR-AHL系統(tǒng)及其與耐藥性的關(guān)系

AHL 是QS 的一類主要自誘導(dǎo)信號，有超過200種細(xì)菌可以產(chǎn)生這種分子。AHL具有一個高度保守的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，通過酰胺鍵連接到酰基鏈上。LuxI/luxR 是革蘭陰性桿菌中最常見的QS 系統(tǒng)，其中LuxI是合成AHL 的關(guān)鍵酶，LuxR 是AHL的受體［35］。AHL可以通過調(diào)控生物膜形成和耐藥基因表達(dá)等機制誘導(dǎo)耐藥。當(dāng)細(xì)菌密度增加，AHL 水平也逐漸升高，密度達(dá)到閾值時，AHL 進(jìn)入細(xì)胞，結(jié)合并激活LuxR，二者形成復(fù)合物，隨后激活與QS相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞外聚合物（EPS，包括多糖基質(zhì)、脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白等）的合成，影響生物膜的形成［36］。早在2007年就有研究者發(fā)現(xiàn)，AHL 信號分子缺乏的銅綠假單胞菌只能形成很薄的生物膜，極易被表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）破壞，但在重新添加AHL 后，又恢復(fù)為成熟生物膜，證實了AHL 在調(diào)控生物膜形成過程中的關(guān)鍵作用。Tang等［37］又發(fā)現(xiàn)，LuxI和LuxR缺失的熒光假單胞菌的生物膜和胞外多糖產(chǎn)量顯著降低，生物膜薄且不致密，重新添加AHL的同系物C4?HSL后，菌株的生物膜又恢復(fù)致密。Culler 等［38］發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可通過SdiA 蛋白檢測其他細(xì)菌分泌的AHL，來控制細(xì)胞膜的合成。除了調(diào)控生物膜以外，AHL 還通過其他途徑影響耐藥。如Dou等［39］在AHL缺陷型的鮑曼不動桿菌突變體中加入美羅培南和哌拉西林，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHL 缺陷型的鮑曼不動桿菌突變體對美羅培南和哌拉西林比野生型更敏感，說明AHL 參與調(diào)控耐藥基因的表達(dá)。

2.2 LuxS/AI-2系統(tǒng)及其與耐藥性的關(guān)系

AI?2 是一種在物種間交流的通用信號分子。AI?2 的前體是DPD（4，5?二羥基?2，3?戊二酮，S?腺苷甲硫氨酸甲基化代謝的副產(chǎn)物），DPD活性很高，可以形成不同的衍生物，可被細(xì)菌識別。LuxS/AI?2 系統(tǒng)可通過以下4 種方式誘導(dǎo)耐藥。a.調(diào)控生物被膜形成的關(guān)鍵基因：Xue 等［40］采用外源添加AI?2，證明可增強ica操縱子及編碼生物被膜相關(guān)bhp基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而顯著提高表皮葡萄球菌生物被膜的形成能力。更早的研究發(fā)現(xiàn)，AI?2通過抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)或調(diào)控lytA基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞壁的降解和生物被膜的形成。b.影響外排泵活性：如在大腸桿菌中，LuxS/AI?2 通過過表達(dá)調(diào)控SdiA，使耐藥外排泵AcrAB 和MDR 的表達(dá)增加，誘導(dǎo)耐藥。在豬鏈球菌中，LuxS/AI?2 系統(tǒng)影響外排泵SatAB的表達(dá)，影響其對喹諾酮類抗生素的耐藥性［41］。c.調(diào)控可移動元件攜帶耐藥基因的表達(dá)：質(zhì)粒、整合子基因盒及轉(zhuǎn)座子在細(xì)菌耐藥過程中發(fā)揮重要作用。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥是最常見的形式。β?內(nèi)酰胺酶位于質(zhì)粒上，通過水解β?內(nèi)酰胺類抗生素引起耐藥。Xue 等［42］證實了在外源添加AI?2后，通過以LsrR依賴性方式上調(diào)質(zhì)粒TEM型酶（屬于超廣譜β?內(nèi)酰胺酶）的表達(dá)來增加大腸桿菌的耐藥性。另外，轉(zhuǎn)座子能夠在染色體、質(zhì)粒和噬菌體之間移動，因此轉(zhuǎn)座子上的耐藥基因更容易水平傳播。四環(huán)素耐藥基因tet（M）位于轉(zhuǎn)座子Tn916 上，Wang 等［43］證實，通過外源添加AI?2，可以上調(diào)tet的基因表達(dá)，從而增加中間鏈球菌以及豬鏈球菌對四環(huán)素的耐受性。具體基因調(diào)控的機制尚不清楚。d.與VraSR TCS 協(xié)同誘導(dǎo)耐藥［44］：VraSR TCS 能夠檢測破壞細(xì)菌細(xì)胞壁合成的因素，并調(diào)節(jié)細(xì)胞壁生物合成途徑。研究發(fā)現(xiàn)，ΔluxS金黃色葡萄球菌VraSR 表達(dá)水平較野生型增高4 倍，且同時恢復(fù)了對萬古霉素的敏感性，細(xì)胞壁更容易被破壞，表明LuxS/AI?2 系統(tǒng)可能通過VraSR TCS誘導(dǎo)了對抗生素的耐藥性。

由于新型抗生素研發(fā)困難，研究者提出了抑制QS 或群體猝滅（quorum quenching，QQ）阻礙生物膜形成及抑制細(xì)菌毒力來抑制耐藥的策略。QQ主要機制是酶解或修飾AHL 分子、抑制信號分子合成、干擾信號分子或阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，比較有代表性的群體猝滅劑包括乳糖酶、?；?、還原酶、氧化酶、c8?HSL、AgrA 轉(zhuǎn)錄小分子抑制劑等［45］。目前阻斷QS已經(jīng)成為防止細(xì)菌耐藥的主要策略之一。

3 第二信使

第二信使是細(xì)菌之間信息交流的主要分子，主要位于細(xì)胞內(nèi)，主要包括cAMP、c?di?GMP（cyclic diguanosine monophosphate）、c?di?AMP（cyclic diadenosine monophosphate）、cGMP，這些分子在細(xì)菌毒力、生物膜形成、藥物外排等過程中發(fā)揮重要作用。

3.1 環(huán)磷酸腺苷（cAMP）與耐藥性的關(guān)系

cAMP是第一個被發(fā)現(xiàn)的第二信使，在原核和真核生物中廣泛存在，主要作用是將外部的信息傳遞給內(nèi)部效應(yīng)分子，使細(xì)胞對外界環(huán)境做出響應(yīng)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。除此之外，cAMP還可以調(diào)節(jié)許多細(xì)菌的基本生理功能以及病理過程，并在細(xì)菌分泌系統(tǒng)和毒力基因調(diào)控方面具有重要作用。cAMP 由跨膜腺苷酸環(huán)化酶（transmembrane adenylate cyclase，tmAC）水解ATP 生成，磷酸二酯酶（PDE）催化其水解，tmAC 受異三聚體G 蛋白直接調(diào)控，G 蛋白與其偶聯(lián)受體（GPCR）結(jié)合發(fā)出信號調(diào)控cAMP的產(chǎn)生［46］。cAMP的受體蛋白CRP為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它控制大腸桿菌中490 多種基因表達(dá)［47］，包括acrAB-tolC外排基因以及marAB基因。有研究表明，crp基因的失活，降低了MarA 介導(dǎo)的對諾氟沙星、氯霉素以及米諾環(huán)素的多重耐藥性［48］，證明CRP?cAMP 具有調(diào)節(jié)細(xì)菌耐藥性的作用。

c?di?AMP 是近10 年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細(xì)菌中的第二信使。2分子的ATP在DAC催化下合成1分子c?di?AMP，后者調(diào)控生物膜誘導(dǎo)耐藥性的作用尚存在爭議。有研究顯示，c?di?AMP 可以調(diào)控金黃色葡萄的生物膜形成，但是具體機制不詳。在變異鏈球菌中，c?di?AMP 積累調(diào)控細(xì)菌多糖合成酶編碼基因gtfB的表達(dá)，促進(jìn)生物膜的形成［49］。與之相反，c?di?AMP 在枯草芽孢桿菌中通過促進(jìn)sinR基因的表達(dá)，抑制生物被膜形成相關(guān)基因epsA、tapA和slrR，從而抑制生物被膜的形成［50］。因此，c?di?AMP 在細(xì)菌耐藥性中的作用尚有待確認(rèn)。

3.2 c-di-GMP及其與耐藥性的關(guān)系

與cAMP 相同，c?di?GMP 也屬于第二信使，它由兩個GTP 分子通過雙鳥苷酸環(huán)化酶（dual guanylate cyclase，DGC）合成，其濃度受鳥苷酸環(huán)化酶（cGMPase，GC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）影響。c?di?GMP 在調(diào)節(jié)細(xì)菌行為、毒力和生物膜形成過程中扮演著重要角色［51］。影響生物膜形成使c?di?GMP 引起細(xì)菌耐藥的主要途徑。c?di?GMP 的濃度可以控制細(xì)菌生存的狀態(tài)：低濃度c?di?GMP使細(xì)菌處于浮游狀態(tài)，此時生物膜不形成；反之，高濃度的c?di?GMP 能夠提高黏附能力，促進(jìn)胞外多聚物的合成，幫助生物被膜形成［52?53］。除了控制細(xì)菌生存狀態(tài)以外，c?di?GMP 還可以提高酶的活性，促進(jìn)細(xì)菌EPS 的分泌，在大腸桿菌中，c?di?GMP 可同時結(jié)合受體蛋白PgaC、PgaD，改變PgaCD 的結(jié)構(gòu)，激活酶活性，促進(jìn)胞外多糖的合成和釋放，從而促進(jìn)生物被膜的形成［54］。在熒光假單胞桿菌中，c?di?GMP 與LapD蛋白結(jié)合引起構(gòu)象改變，使后者與LapG蛋白結(jié)合，釋放了與細(xì)胞表面黏附有關(guān)的LapA 蛋白，LapA 蛋白通過ABC 型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分泌到細(xì)胞表面，促進(jìn)生物被膜的形成［55?56］。說明c?di?GMP 作為第二信使在細(xì)菌耐藥性方面具有重要作用。

4 新型信號分子——吲哚

4.1 吲哚的信號分子作用

吲哚也是一種廣泛存在的細(xì)菌AI，最早在1897年被發(fā)現(xiàn)，一直被認(rèn)為與細(xì)菌代謝息息相關(guān)。近年來，才被發(fā)現(xiàn)是一種新型的信號分子。截止目前，超過145種細(xì)菌能產(chǎn)生吲哚。吲哚可影響細(xì)菌的抗生素耐受性、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、生物膜合成等多種生理過程，且與細(xì)菌的致病性息息相關(guān)。吲哚由色氨酸代謝產(chǎn)生，且在細(xì)胞內(nèi)被色氨酸酶轉(zhuǎn)化為色氨酸，故而色氨酸酶的活性直接影響吲哚的濃度與信息傳遞功能。除色氨酸酶外，SOS 反應(yīng)中LexA下游的小熱激蛋白IbpA也調(diào)控吲哚的含量［57］。當(dāng)小熱激蛋白大量產(chǎn)生導(dǎo)致破壞細(xì)胞新陳代謝時，可促使吲哚大量產(chǎn)生。故而當(dāng)細(xì)菌在抗生素環(huán)境下誘發(fā)SOS 反應(yīng)時，吲哚可大量產(chǎn)生，從而幫助細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)吲哚還是一種重要的信號分子，其滿足信號分子的條件［58］：a.吲哚在特定的時期和生理條件下產(chǎn)生以適應(yīng)環(huán)境；b.可被感受器識別，吲哚的輸入與輸出感受器為AcrEF泵和Mtr轉(zhuǎn)運蛋白［59］；c.具有積累效應(yīng)；d.吲哚的代謝和分解不會影響菌體正常的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。所以，吲哚是細(xì)菌之間關(guān)鍵的信號分子之一。

4.2 吲哚與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系

吲哚主要通過多種方式調(diào)控細(xì)菌的耐藥性。a.影響藥物外排泵的活性：吲哚通過轉(zhuǎn)錄激活因子GadX 誘導(dǎo)藥物外排泵基因mdtEF、acrD的表達(dá)，提高對苯唑西林、氯苯西林、萘夫西林及紅霉素的抗性［60］。吲哚也通過TCS 或QS 效應(yīng)蛋白SdiA 調(diào)控藥物外排泵AcrAB 的表達(dá)［61］。研究發(fā)現(xiàn)，吲哚通過BaeSR 和CpxAR TCS 可上調(diào)多種耐藥基因的表達(dá)［62］。大腸桿菌在加入外源吲哚后，mdtABCD、mdtI、mdfA、mdtK、mdtJ、cusB、acrD 等多個基因的表達(dá)增加了兩倍以上，提高了對羧芐青霉素的抗性［63］。吲哚這種促進(jìn)外排泵基因表達(dá)的作用不僅局限在產(chǎn)吲哚菌，在不產(chǎn)吲哚的菌屬中也同樣發(fā)揮作用。b.影響生物膜形成：吲哚可以通過促進(jìn)細(xì)菌多糖的合成而參與大腸桿菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌等生物膜的形成。但是也有一部分研究認(rèn)為，吲哚抑制生物膜合成。如大腸桿菌的小熱激蛋白IbpAB與細(xì)菌的熱應(yīng)激有關(guān)，IbpAB可以調(diào)控吲哚的合成，內(nèi)源性氧化及熱應(yīng)激脅迫使ibpAB突變菌株吲哚合成增加，此時生物膜合成受阻［64］。另一種說法是，多元脅迫抗性蛋白YcfR 誘導(dǎo)吲哚生物合成，但是卻抑制了生物膜的合成。c.其他途徑：吲哚也被證明可通過氧化應(yīng)激（OxyR）和噬菌體休克（Psp）通路，產(chǎn)生持留菌進(jìn)而對抗生素產(chǎn)生抗性。此外，吲哚還具有穩(wěn)定質(zhì)粒的作用。當(dāng)耐藥基因跟隨質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移時，細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)子（regulator of cell division，Rcd）通過吲哚防止多拷貝質(zhì)粒的丟失，提高質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性，進(jìn)而提高細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗能力。雖然吲哚也屬于細(xì)菌的AI，但是其受體系統(tǒng)及在微生物群體協(xié)調(diào)中的作用仍存在爭議，它可以抑制細(xì)胞分裂降低群體密度，抑制群體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［65］，也可以正反雙向調(diào)控生物膜的合成，這些特點與其他QS 信號分子不同，因此目前并沒有明確地把吲哚歸入QS信號分子，而是單獨作為細(xì)菌之間信息傳遞的分子進(jìn)行研究。吲哚在微生物之間傳遞信息的生態(tài)學(xué)機制將是今后研究的熱點問題。

5 多種信號系統(tǒng)構(gòu)成協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

細(xì)菌的各種信號系統(tǒng)往往并不是單獨發(fā)揮作用，它們之間存在復(fù)雜的協(xié)同網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)各種生理活動。a.TCS 之間存在協(xié)同作用：如BaeSR TCS 中的調(diào)節(jié)因子BaeR 過量產(chǎn)生可使耐藥基因（如多藥轉(zhuǎn)運蛋白ABC）以及麥芽糖轉(zhuǎn)運、趨化反應(yīng)和鞭毛生物合成的基因上調(diào)，但前提條件為細(xì)胞中有TCS PhoBR 或CreBC 的存在［66］，說明TCS 之間存在協(xié)同作用機制。在銅綠假單胞菌的生物膜形成階段不僅需要QS信號分子的參與，還至少需要4 個TCS 來完成，包括SagS、BfiRS、BfmRS 和MifRS。b.TCS 與QS 的協(xié)同作用：LuxS/AI?2 和LuxI/luxR?AHL QS是TCS與QS互相協(xié)作的經(jīng)典例子。Sperandio等［67］研究表明，TCS QseBC的調(diào)節(jié)因子通過QS信號分子AI?2激活鞭毛和運動基因的調(diào)節(jié)因子flhDC的轉(zhuǎn)錄，故而雙TCS QseBC是大腸桿菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)級聯(lián)的一個組成部分。c.TCS與c?di?GMP 形成復(fù)雜的多級信號網(wǎng)絡(luò)：如銅綠假單胞菌的耐藥性通過TCS SagS和c?di?GMP響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑BrlR 共同調(diào)節(jié)，其中BrlR 是多藥外排泵激活劑MerR家族的成員，當(dāng)sagS基因失活時，生物膜中BrlR水平含量降低，證明TCS SagS間接促進(jìn)BrlR 功能的激活，導(dǎo)致多藥耐藥［12］。d.第二信使與吲哚的協(xié)同作用：研究者們發(fā)現(xiàn)，增加cAMP的含量可以促進(jìn)吲哚的產(chǎn)生。原因是色氨酸酶受cAMP 調(diào)節(jié)，色氨酸酶活性與cAMP 活性成正相關(guān)，當(dāng)磷酸二酯酶降解了cAMP，吲哚水平也隨之降低［68］。e.第二信使與QS的相互協(xié)同和制約：銅綠假單胞菌的LasR/LasIQS 可通過誘導(dǎo)DGC 活性來正向調(diào)控c?di?GMP，RhlR/RhlI系統(tǒng)則通過誘導(dǎo)PDE活性負(fù)向調(diào)節(jié)c?di?GMP水平，QS與c?di?GMP相互配合地調(diào)控細(xì)胞毒力與生物膜形成［69］。另一項研究發(fā)現(xiàn)［70］，當(dāng)霍亂弧菌處于高密度時，QS HapR 受體蛋白可抑制c?di?GMP 的合成，降低c?di?GMP 水平，使細(xì)菌處于浮游狀態(tài)，而間接抑制生物膜的形成。所以，c?di?GMP 的作用受控于群QS，二者既相互協(xié)同，又相互制約。f.吲哚與QS 的協(xié)同作用：吲哚衍生物4?羥基吲哚（4?HI）與QS 信號能使刺激肽（CSP）和sigX誘導(dǎo)肽（XIP）共同作用來增強變形鏈球菌的生物膜形成。在變形鏈球菌中加入吲哚之后可使細(xì)胞內(nèi)形成變形鏈球菌生物膜的主要成分，胞外不溶性多糖和胞外DNA（eDNA）的含量明顯增加，證明4?HI對變形鏈球菌的生物膜形成起到很大作用。而CSP和XIP也可誘導(dǎo)變形鏈球菌中的細(xì)胞死亡和eDNA 釋放。有研究發(fā)現(xiàn)［71］，在QS 信號CSP 和XIP 缺失株ΔcomC和ΔsigX中加入吲哚，其生物膜無增加現(xiàn)象，而在LytF 自溶素缺失株ΔlytF 中加入吲哚后，其生物膜顯著增加。證明吲哚與QS 信號分子CSP與XIP具有協(xié)同作用，改變變形鏈球菌的生物膜含量。細(xì)菌內(nèi)含有的信號系統(tǒng)互相協(xié)調(diào)，互相制約，形成密切的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為細(xì)菌耐藥提供了條件（圖3）。

Fig.3 Drug-resistance regulatory networks of bacterial signaling systems圖3 細(xì)菌各種信號系統(tǒng)耐藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

6 結(jié)論

細(xì)菌間的信息傳導(dǎo)系統(tǒng)已被證實與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)。細(xì)菌可以通過信號分子來感受環(huán)境中藥物的濃度進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，且各種信號系統(tǒng)之間互相協(xié)同，共同構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制菌體之間的信息交流，調(diào)控包括耐藥性、毒力、代謝、應(yīng)激等多種生理作用。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研顯示，TCS、QS、第二信使、吲哚等信息傳遞系統(tǒng)可以通過促進(jìn)生物膜形成、提高藥物外排泵活性、促進(jìn)耐藥基因轉(zhuǎn)移、激活抗生素水解酶、細(xì)胞膜修飾等多途徑影響細(xì)菌耐藥性。通過阻斷細(xì)胞間的信號交流可以降低細(xì)菌耐藥性或阻斷耐藥基因的傳播，此策略已經(jīng)成為遏制耐藥菌的新方向。如QQ，通過抑制或降解信號分子的產(chǎn)生來抑制毒力基因的表達(dá)以及生物膜的形成。此外，利用組氨酸酶抑制劑可削減TCS中組氨酸酶的活性作用［72］，減少磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，且一種抑制劑可對同一株菌中含有的多個TCS 有抑制作用［73］。但是，細(xì)菌信號系統(tǒng)十分復(fù)雜，在大腸肝菌K?12中找到的TCS就有18種［8］，如此復(fù)雜的信號系統(tǒng)，單一阻斷一個或幾個信號通路，對于耐藥性的影響可能收效甚微。吲哚存在多種衍生形式，關(guān)于吲哚受體系統(tǒng)尚不清楚，其信號阻斷劑的研制尚無顯著進(jìn)展。因此，繼續(xù)尋找信號分子及其受體系統(tǒng)的多靶點抑制劑，需要深入了解各信號系統(tǒng)之間的互作網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵節(jié)點，才有可能有效干擾菌群信號和阻斷菌體之間的信息交流。要做到這些，不僅關(guān)系到細(xì)菌的耐藥性，更關(guān)系到毒力和致病性。