MiR-130b-3p在非小細胞肺癌患者血液中的表達及潛在意義

李靖霄，李國盛，徐陽，何融泉，周華富，孔晉亮，陳罡*

肺癌（lung cancer，LC）是中國最常見且病死率最高的癌種；最新的研究報道顯示，在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中，LC的發(fā)病率和病死率分別位居第二和第一［1，2］。根據(jù)病理分型，LC常被分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩種亞型，而前者約占LC的85%［3］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是最常被診斷的NSCLC組織學亞型［4］。隨著診斷和治療技術的進步，手術聯(lián)合新型放化療已可使NSCLC患者5年生存率達到21.7%［5］。然而，更多的患者在確診時腫瘤已進展到晚期，這讓常規(guī)治療方法的療效不容樂觀［6，7］。因此，挖掘有效的臨床篩查和治療NSCLC的標志物，對降低患者病死率和提高患者生存質(zhì)量尤為重要。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）可通過調(diào)控信使RNA的表達而影響轉(zhuǎn)錄過程［8］。作為miR-130家族的一員，miR-130b-3p已被報道參與調(diào)控多種腫瘤的進展，但其調(diào)控作用與調(diào)控機制在不同腫瘤中卻不盡相同［9］。例如，miR-130b-3p在肝細胞癌、乳腺癌、前列腺癌中被認為具有抑制腫瘤發(fā)展的作用，而在膀胱癌、腎母細胞癌、胃癌中被認為具有促進腫瘤發(fā)展的作用［10-15］。此外，miR-130b-3p在NSCLC中的作用也已被初步報道。一些針對人工培育NSCLC細胞和NSCLC患者腫瘤組織的研究表明，miR-130b-3p具有促進癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［16-18］。盡管Ulivi等人的研究提到，血液中miR-130b-3p的表達與NSCLC患者的總生存率顯著相關，但他們并未闡明miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達情況與臨床意義［18］。此外，這些有關miR-130b-3p和NSCLC的研究均屬于單中心的小樣本研究，未探索miR-130b-3p應用于篩查NSCLC的潛在價值，且未闡明miR-130b-3p在NSCLC中的作用機制。因此，應用大量樣本進一步探索miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達水平和作用機制對明確miR-130b-3p的潛在臨床應用價值至關重要。

本研究旨在通過分析來自公共數(shù)據(jù)庫的miRNAs表達譜，以探究miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達水平及鑒別該疾病的潛力，從而挖掘miR-130b-3p篩查和治療NSCLC的潛在臨床意義。

1 資料與方法

1.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達水平

為采集用于分析miR-130b-3p在NSCLC中的表達水平與鑒別潛力的數(shù)據(jù)，本研究以“l(fā)ung AND（tumor OR cancer OR carcinoma OR neoplasms）

AND（microRNA OR miRNA）”作為檢索式，在基因表達譜數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）以及序列片段歸檔數(shù)據(jù)庫（Sequence Read Archive，SRA）中進行檢索。同時，為了檢索與提取癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中收錄的數(shù)據(jù)，Xena數(shù)據(jù)庫被用于下載LC相關數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集納入條件如下：①研究對象為智人；②數(shù)據(jù)應來自血液，包括全血、血漿等；③數(shù)據(jù)集需包含miR-130b-3p表達數(shù)據(jù)；④每個數(shù)據(jù)集需包含至少3個腫瘤和3個非腫瘤樣本；⑤樣本未經(jīng)過任何藥物或其它化學物質(zhì)處理。隨后，將所收集到的數(shù)據(jù)按照測序平臺進行合并，并進行了log2（x+1）轉(zhuǎn)換。

為觀察不同NSCLC亞型中miR-130b-3p的表達水平，本研究根據(jù)腫瘤亞型將所有樣本分為兩組，分別為LUAD和LUSC組。首先，對數(shù)據(jù)集的平均值、標準差、敏感度、特異度進行計算，并根據(jù)分組進行記錄。接著，各個數(shù)據(jù)集的miR-130b-3p表達水平被繪制成散點圖和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。為了綜合展示各個數(shù)據(jù)集的結果，標準化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD）和診斷性似然比（diagnostic likelihood ratio，DLR）也被計算。我們還繪制森林圖與綜合受試者工作特征（summaryreceiver operating characteristic，sROC）曲線。由于可收集到的數(shù)據(jù)有限，本研究在此將LUAD和LUSC的數(shù)據(jù)集合并分析。曲線下面積（area under curve，AUC）的百分比值大小是在ROC及sROC曲線中評判miR-130b-3p鑒別NSCLC的潛力的標準。

1.2 MiR-130b-3p下游靶基因的篩選

MiRwalk 2.0納入了12個數(shù)據(jù)庫的miRNAs和基因的表達情況，具有預測miRNA-靶基因關系的功能。本研究將“miR-130b-3p”作為關鍵詞在MiRwalk 2.0中進行檢索。對檢索到的靶基因基于下列條件篩選：結合分數(shù)（binding score）等于1且同時在12個數(shù)據(jù)集中被認為是miR-130b-3p的靶基因。將篩選到的基因輸入檢索相互作用基因的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）分析靶基因之間作用關系，并構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡。隨后，根據(jù)各基因相互作用的degree值篩選出的樞紐基因（hub genes）被選用于后續(xù)分析。

1.3 富集分析

將篩選得到的miR-130b-3p下游靶基因輸入注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）v 6.8進行富集分析。本研究選擇了基因本體（Gene Ontology，GO）-生物過程（biological process，BP）、GO-細胞成分（cellular component，CC）、GO-分子功能（molecular function，MF）對miR-130b-3p下游靶基因進行功能富集，同時應用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，以探討miR-130b-3p下游靶基因調(diào)控腫瘤發(fā)展的潛在信號通路。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在本研究中，Graphpad prism 8.0被用于構建散點圖及描繪ROC曲線。應用IBM SPSS 23.0計算數(shù)據(jù)平均值和標準差。Stata 14.0被用于計算SMD和DLR并繪制森林圖與sROC曲線。在線數(shù)據(jù)庫miRwalk 2.0以及DAVID v6.8分別被用于預測miR-130b-3p的下游靶基因和下游靶基因的潛在信號通路。我們使用Cytoscape v3.7.1的cytohubba模塊篩選出了miR-130b-3p下游靶基因的樞紐基因。

2 結果

2.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中低表達

在本研究中，共有來自公共數(shù)據(jù)庫的7項研究被納入分析（表1）。

在4個納入的LUAD數(shù)據(jù)集中，有3個表明miR-130b-3p在LUAD組和對照組血液樣本間的表達差異被認為具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A～D）。如 圖1E～G所 示，在3個 納 入 的LUSC數(shù)據(jù) 集 中有1個表明在LUSC組和對照組血液樣本間miR-130b-3p的表達差異被認為具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。根據(jù)各個數(shù)據(jù)集ROC曲線的AUC，我們認為使用在NSCLC患者血液中低表達的miR-130b-3p具有良好的預測價值（圖2）。

圖1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中表達水平的散點圖A～D：樣本來自LUAD患者血液；E～G：樣本來自LUSC患者血液

圖2 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的ROC曲線A～D：分別為GSE27486、GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲線；E～G：分別為GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲線

為了進一步明確miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表達水平，本研究綜合計算了miR-130b-3p的SMD（表2）。結果表明，在LUAD中，SMD=-1.45，95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）為-2.66～-0.23；在LUSC中，SMD=-0.46，95%CI：-0.84～-0.09（圖3A）。未發(fā)現(xiàn)SMD結果存在明顯的發(fā)表偏倚（圖3B）。因此，目前結果顯示miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達量顯著低于健康人血液。綜合結果，我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者血液中低表達的miR-130b-3p具有較好地區(qū)分腫瘤組織和正常組織的潛力（AUC=0.85，95%CI：0.82～0.88）（圖3C）。圖3D提示納入的NSCLC組織數(shù)據(jù)集具有較低的陰性DLR以及較高的陽性DLR。

圖3 MiR-130b-3p在NSCLC患者體內(nèi)的表達水平及鑒別潛力A：MiR-130b-3p在血液中表達水平森林圖，上半部分表示其在LUAD血液樣本中的表達水平，下半部分表示其在LUSC血液樣本中的表達；B：漏斗圖展示所納入血液樣本的發(fā)表偏倚；C：MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的sROC曲線；D：在NSCLC患者血液中miR-130b-3p的DLR注：LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鱗狀細胞癌；sROC，綜合受試者工作特征；NSCLC，非小細胞肺癌；DLR，診斷性似然比

表2 在7項納入的研究中，miR-130b-3p在NSCLC患者和健康人血液中的表達水平平均值與標準差

2.2 探索miR-130b-3p的下游靶基因

在miRwalk 2.0中，本研究篩選出了47個miR-130b-3p的下游靶基因，并通過PPI網(wǎng)絡展示了他們之間的聯(lián)系（圖4A）。根據(jù)各下游靶基因間的degree值，我們篩選出了前10個degree值最高的下游靶基因作為樞紐基因，分別為ESR1、AGO1、DDX6、MTMR9、CFL2、TRIM2、QKI、FMR1、TNRC6B和BRWD1（圖4B）。所篩選出的下游靶基因們將被用于后續(xù)分析。

2.3 富集分析

結果顯示，在GO-BP分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于protein phosphorylation、mRNA processing和RNA splicing（圖4C）。在GO-CC分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于lysosome、early endosome membrane和processing body（圖4D）。在GO-MF分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于protein binding、chromatin binding和protein serine（圖4E）。KEGG分析結果表明，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于endocytosis和axon guidance通路（圖4F）。這些結果提示miR-130b-3p可能通過參與相關通路的調(diào)控進而影響NSCLC的發(fā)展。

圖4 MiR-130b-3p下游靶基因的富集分析A：使用miR-130b-3p下游靶基因構建的PPI網(wǎng)絡圖；B：MiR-130b-3p下游靶基因的樞紐基因（hub genes）；C：在GO_BP分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；D：在GO_CC分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；E：在GO_MF分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；F：在KEGG富集分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況

3 討論

在本研究中，基于300例血液樣本的miR-130b-3p表達水平，我們首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液中表達下調(diào)。同時，我們發(fā)現(xiàn)在血液中低表達的miR-130b-3p具有顯著的篩查NSCLC患者的潛力。47個基因被鑒定為miR-130b-3p的下游靶基因，且根據(jù)這些靶基因探索miR-130b-3p參與調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的潛在信號通路。

近年來，已有一些研究報道了miR-130b-3p在NSCLC中的表達水平及生物學作用?；诜治?5例組織樣本，Yu等［16］人發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p的表達水平在來自NSCLC患者體內(nèi)的癌細胞中明顯升高，并與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移速度呈正相關，且敲低miR-130b-3p后，腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移隨之受到抑制。Guo等［17］人發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p在人工培育的NSCLC細胞中表達上調(diào)；而敲低miR-130b-3p的NSCLC細胞具有更低的增殖、侵襲和遷移能力，提示了miR-130b-3p表達可能影響NSCLC的進展。通過分析99例LUAD樣本和83例LUSC樣本的血液miRNAs表達水平，Ulivi等［18］人報道了高表達的miR-130b-3p與LUSC患者的無瘤生存期呈明顯負相關，且與LUAD患者的總生存率呈明顯負相關。這些研究提示了miR-130b-3p在NSCLC的表達差異及重要生物學功能，但存在樣本量較?。╪≤182）、僅基于單中心數(shù)據(jù)等問題，他們也并未闡明miR-130b-3p在血液中的表達水平。在本研究首次通過來自公共數(shù)據(jù)庫大樣本探討了miR-130b-3p在NSCLC患者血液內(nèi)的表達水平，并發(fā)現(xiàn)相較于健康人的血液，miR-130b-3p在NSCLC患者的血液中呈現(xiàn)明顯的低表達。已有的研究認為，細胞凋亡和活性分泌是血液中miRNAs的重要來源，當細胞凋亡和活性分泌活躍時，血液中miRNAs含 量 上調(diào)［19］。Guo等［17］人認為，miR-130b-3p主要來自間充質(zhì)干細胞，并通過胞外囊泡分泌轉(zhuǎn)移至NSCLC細胞內(nèi)，從而促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們推斷NSCLC患者間充質(zhì)干細胞分泌的miR-130b-3p隨血液轉(zhuǎn)移至NSCLC細胞內(nèi)，導致患者血液中miR-130b-3p含量較正常人的更低；同時，由于腫瘤細胞凋亡活動減弱，患者血液中miR-130b-3p將持續(xù)處于低水平。

現(xiàn)有研究表明，血液中miRNAs可作為某些腫瘤的生物標志物［20］。一些研究也通過診斷試驗鑒定了多個具有作為NSCLC早期篩查的生物標志物前景的miRNAs［21-23］。在本研究中，診斷試驗結果顯示miR-130b-3p的AUC=0.85，提示miR-130b-3p可以較為準確地鑒別NSCLC患者和健康人。因此，我們提出通過檢測血液中miR-130b-3p的表達水平，有助于篩查NSCLC。在未來投入更多的精力研究miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表達水平，對早期預測NSCLC及其預后具有積極作用。

本研究尚存在一些局限：首先，尚需在將來經(jīng)過實驗驗證miR-130b-3p與下游靶基因的聯(lián)系；其次，下游靶基因所顯著富集的信號通路與NSCLC發(fā)展的關系尚無法闡明；最后，因可收集的樣本有限，除了LUAD和LUSC外，本研究未能對NSCLC的其他亞型進行分析。

總之，本研究通過分析來自多中心的大樣本數(shù)據(jù)，首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液內(nèi)表達下調(diào)，并有望用于NSCLC的篩查。