非洲豬瘟病毒研究進(jìn)展

張 帥，劉 媛，趙云環(huán)，劉 瑩，左玉柱*，范京惠*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省邢臺(tái)市邢東新區(qū)社會(huì)發(fā)展局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 邢臺(tái) 054000；3.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，病死率高達(dá)100%[1]，其自1921年在肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)[2]以后，已蔓延至南美洲、歐洲和亞洲國(guó)家，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2018年8月傳入我國(guó)后，迅速在我國(guó)各地豬場(chǎng)蔓延，由于該病目前沒有商業(yè)疫苗和有效防控方法，目前控制ASFV傳播的措施是對(duì)感染和接觸豬立即撲殺并深埋，導(dǎo)致我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模、結(jié)構(gòu)以及供應(yīng)結(jié)構(gòu)均受到一定影響，嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。

ASFV是一種具有復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA病毒[4]，為非洲豬瘟科非洲豬瘟屬唯一成員，基因組大小在170～190 kb之間，能夠編碼超過200種蛋白質(zhì)，且絕大部分蛋白質(zhì)的功能尚不清楚。ASFV結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜多樣的特性在很大程度上阻礙了病毒-宿主間作用機(jī)制的探明及疫苗研發(fā)的進(jìn)程，也給ASF的有效防控帶來了挑戰(zhàn)。近年來，ASFV的相關(guān)研究取得了巨大的成就，但仍只是少部分蛋白的結(jié)構(gòu)和功能被解析，現(xiàn)對(duì)ASFV主要蛋白質(zhì)功能、檢測(cè)方法和疫苗研究方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為ASFV-宿主間作用機(jī)制研究、ASF快速及早準(zhǔn)確地篩查檢測(cè)和疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)性幫助。

1 ASFV蛋白質(zhì)功能研究進(jìn)展

ASFV具有龐大的基因組，整個(gè)基因組編碼200多種蛋白質(zhì)，其中超過50種為結(jié)構(gòu)蛋白，分別參與維持病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)[5]、基因轉(zhuǎn)錄與功能修復(fù)、病毒入侵和復(fù)制、宿主細(xì)胞免疫調(diào)控等[6]過程。掌握病毒蛋白的功能和特性，是建立檢測(cè)方法、研發(fā)疫苗以及探明病毒-宿主之間相互作用機(jī)制和病毒免疫逃逸機(jī)制的基礎(chǔ)，以下將根據(jù)病毒粒子結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外所包含的主要蛋白質(zhì)及功能進(jìn)行綜述。

1.1 病毒核心蛋白ASFV的核心由基因組和核蛋白組成，其中發(fā)揮主要功能的核蛋白是pA104R蛋白。pA104R蛋白是一種高度保守的組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白，與大腸桿菌U93的組蛋白樣蛋白(HU)和整合宿主因子(IHF)最為相似[7]。pA104R蛋白與DNA結(jié)合形成染色質(zhì)，參與異染色質(zhì)形成、基因印記和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種拓?fù)湫揎棥ROUCO等[8]研究表明，帶正電荷的pA104R蛋白以不依賴ATP的方式結(jié)合DNA，并且還與ASFV中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ協(xié)同誘導(dǎo)DNA超螺旋；pA104R蛋白是一種中后期蛋白質(zhì)，能被招募到合成組裝工廠進(jìn)行基因組包裝[9]。同時(shí)，還有較強(qiáng)的抗原性，是IgG和IgM抗體反應(yīng)性較好的靶標(biāo)[10]，且無癥狀感染豬對(duì)pA104R的抗體反應(yīng)高于慢性感染豬，因此，針對(duì)pA104R蛋白的抗體可能是有效免疫反應(yīng)的指標(biāo)[8,10]，可用作血清學(xué)診斷。LIU等[11]研究指出,ASFV的DNA包裝是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過程，病毒可能采用一種混合機(jī)制，以pA104R蛋白為中心，使DNA迅速壓縮，這可能是產(chǎn)生大量ASFV顆粒維持成功感染機(jī)體所必需的關(guān)鍵。當(dāng)前缺失pA104R蛋白的BA71株已經(jīng)構(gòu)建，但基于疫苗的體內(nèi)研究還未取得階段性進(jìn)展。體外研究結(jié)果顯示，pA104R蛋白與DNA的結(jié)合可被二苯乙烯類化合物所破壞，從而抑制ASFV在原代豬肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，提示pA104R蛋白在ASFV復(fù)制過程中具有重要作用以及pA104R蛋白有望成為抗病毒治療的靶標(biāo)[11]。

1.2 核殼蛋白核殼蛋白包裹在核的外層，是一層約30 nm厚的蛋白質(zhì)層，主要由多聚蛋白pp220和pp62組成，在結(jié)構(gòu)上起到保護(hù)核的作用，在病毒的組裝和病毒的感染過程中具有重要作用[12]。GERMN等[13]發(fā)現(xiàn)，pp62蛋白的加工需要pp220蛋白核心前體的表達(dá)，pp220和pp62蛋白的加工都依賴于主要衣殼蛋白p72的表達(dá)，pp220和pp62蛋白的表達(dá)，是成熟ASFV的重要標(biāo)志，pp220和pp62蛋白加工合成被抑制，會(huì)導(dǎo)致缺損病毒或無感染性病毒粒子的出現(xiàn)[13-14]。據(jù)報(bào)道，pp220蛋白具有銜接病毒核衣殼和囊膜的功能，pp220蛋白在被S273R蛋白酶酶解后加工形成p150、p37、p34和p14等主要結(jié)構(gòu)蛋白，參與核殼的組裝，其中p37蛋白能夠穿透細(xì)胞核，參與細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。ANA等[16]利用萊普霉素B和靶向CRM1受體的siRNA進(jìn)行的試驗(yàn)表明，p37蛋白的亞細(xì)胞定位不受CRM1介導(dǎo)的核輸出通路抑制的影響，并通過原位雜交試驗(yàn)中ASFV DNA和p37蛋白在感染后的早期于特定的核區(qū)域、后期在病毒工廠中共定位證實(shí)了這一結(jié)論；pp62蛋白被S273R蛋白酶酶解成p15和p35蛋白，共同參與DNA復(fù)制和核殼的組裝。GERMN等[13]通過免疫熒光顯微鏡觀察到抗p35和抗p15抗體都能在病毒工廠以及細(xì)胞質(zhì)中被檢測(cè)到，為了更詳細(xì)地研究p35和p15蛋白在組裝位點(diǎn)的分布，進(jìn)一步對(duì)ASFV感染細(xì)胞處理后通過冷凍切片進(jìn)行了免疫金標(biāo)記，結(jié)果顯示在接近病毒膜結(jié)構(gòu)(ASFV粒子的前體元素)的地方檢測(cè)到顯著標(biāo)記，與免疫熒光結(jié)果一致。曹乾大等[15]通過對(duì)ASFV Pig/HLJ/2018株pp220蛋白進(jìn)行分子生物信息學(xué)分析，篩選出了53條優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞抗原表位和23條強(qiáng)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位區(qū)域，為靶向藥物、表位疫苗的研制提供了新的候選對(duì)象。這些研究發(fā)現(xiàn)，均對(duì)于ASF防治和疫苗的研發(fā)有著重要意義。

1.3 內(nèi)膜蛋白內(nèi)膜蛋白主要由p12、p17、p30、p54蛋白組成，分別由O61R、D117L、CP204L、E183L基因編碼。p12蛋白參與病毒的黏附入侵；p17蛋白是維持病毒二十面體結(jié)構(gòu)的重要蛋白，參與各蛋白組裝病毒粒子后的形態(tài)轉(zhuǎn)化，同時(shí)還能對(duì)S273R蛋白酶起抑制作用，抑制多聚蛋白pp220和pp62的酶解[17]。p30蛋白是重要的毒力蛋白，參與宿主細(xì)胞的入侵，在感染早期表達(dá)并持續(xù)存在于整個(gè)感染周期，是最具免疫原性的蛋白之一，這2個(gè)特點(diǎn)使p30蛋白成為檢測(cè)ASFV感染的良好診斷指標(biāo)。PETROVAN等[18]通過免疫沉淀、Western blot和免疫熒光檢測(cè)對(duì)p30特異性單克隆抗體和基于單克隆抗體的診斷進(jìn)行了分析，為ASFV的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和疾病控制提供有價(jià)值的工具。WU等[19]通過開發(fā)21個(gè)單克隆抗體與ASFV p30反應(yīng)，確定了14個(gè)包含至少4個(gè)線性表位的抗原區(qū)域，這些單克隆抗體和確定的p30抗原區(qū)為ASF血清學(xué)檢測(cè)的發(fā)展和改進(jìn)提供了有價(jià)值的工具。同樣，p54蛋白也是進(jìn)行ASF檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的良好血清學(xué)靶點(diǎn)。PETROVAN等[20]通過單克隆抗體制備了針對(duì)桿狀病毒表達(dá)的p54蛋白的多肽，并通過篩選和定位研究確定了p54蛋白上重要的抗原和免疫原性區(qū)域，為ASFV診斷提供了新的工具。p30和p54蛋白共同參與病毒入侵宿主細(xì)胞，是病毒囊膜形成的關(guān)鍵蛋白，是血清抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)，還被用作抗原廣泛應(yīng)用于當(dāng)前國(guó)內(nèi)外熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)成品試劑盒中。ZHANG等[21]將ASFV p30和p54融合到一個(gè)新的細(xì)胞穿透肽Z12中表達(dá)和純化了2個(gè)重組融合蛋白ZPM和ZPMT，通過小鼠評(píng)估了蛋白引起的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)ZPMT誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)有力的中和抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫，表明ZPMT可能是引起豬免疫應(yīng)答的合適候選疫苗，為ASF亞單位疫苗的開發(fā)提供了有價(jià)值的信息。HüBNER等[22]利用編碼Cas9的質(zhì)粒和靶向ASFV p30蛋白71 aa～78 aa密碼子的向?qū)NA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)SL細(xì)胞株，并驗(yàn)證了在至少50代內(nèi)可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因表達(dá)和病毒抑制，該研究是一種有效的傳遞抗ASF感染耐藥性的策略。此外，p54蛋白的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)被吸附細(xì)胞的凋亡[23]，p54蛋白能與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白輕鏈LC8特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)病毒在胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)；當(dāng)ASFV感染后，p54-LC8復(fù)合物與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合，進(jìn)而消除Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，導(dǎo)致Caspase-9、Caspase-3活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。以上研究均為ASFV入侵宿主的機(jī)制、ASFV診斷和疫苗研發(fā)提供幫助。

1.4 衣殼蛋白衣殼蛋白是維持病毒二十面體結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由p72蛋白和其他輔助蛋白組成包裹病毒顆粒。p72蛋白由B646L基因編碼，在宿主細(xì)胞合成后分布于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，p72蛋白形成二十面體結(jié)構(gòu)時(shí)需要輔助蛋白(M1249L、p17、p49和H240R)的參與，此外由于p72蛋白較為保守且有較高的免疫原性，常被用作診斷用抗原[25]。HEIMERMAN等[26]用桿狀病毒表達(dá)的ASFV重組抗原片段制備單克隆抗體，通過免疫熒光抗體鑒定和寡肽識(shí)別確定所有單克隆抗體均位于p72蛋白的高度保守區(qū)域內(nèi)，為ASFV抗體和抗原的檢測(cè)提供了新的靶點(diǎn)。CHEN等[27]采用針對(duì)ASFV p72蛋白的單克隆抗體M-5和M-6，建立了一種基于均相ELISA的快速、免洗滌、一步夾心式免疫檢測(cè)方法，該方法特異性好，靈敏度高，進(jìn)一步提示了p72蛋白在診斷方面的價(jià)值。輔助蛋白中的p14蛋白由E120R基因編碼，可將組裝好的病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，E120R基因的缺失將導(dǎo)致病毒粒子的滯留，進(jìn)一步影響病毒粒子的復(fù)制與合成[28]。

1.5 外囊膜蛋白外囊膜蛋白主要包括CD2v蛋白，由EP402R基因編碼，為感染晚期表達(dá)的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，具有N端信號(hào)肽和單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其不是ASFV必須存在的蛋白，有研究表明，將EP402R基因敲除后，不會(huì)影響病毒的存活，但是影響病毒擴(kuò)散的推遲[29]。SEREDA等[30]研究表明，CD2v蛋白能介導(dǎo)紅細(xì)胞對(duì)ASFV感染細(xì)胞的吸附作用，并指出ASF保護(hù)性免疫可能是血清型特異性的表現(xiàn)。同時(shí)，THANH等[31]根據(jù)CD2v蛋白HAI特性進(jìn)行了血清學(xué)分型，發(fā)現(xiàn)同一基因型下的毒株表現(xiàn)出不同的血清型分型，進(jìn)一步證實(shí)了血清型是決定ASFV分離株之間的同源交叉保護(hù)問題和影響疾病出現(xiàn)的病毒決定因素，也提示了ASFV CD2v蛋白的血清分型對(duì)疫苗的設(shè)計(jì)和開發(fā)的重要性。CD2v蛋白還在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，能有效地抑制有絲分裂原介導(dǎo)的旁系淋巴細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。BURMAKINA等[32]利用IFN-γ ELISpot 法通過ASF免疫動(dòng)物的外周血單核細(xì)胞鑒定了CD2v和C型凝集素上的6個(gè)獨(dú)立的T細(xì)胞表位區(qū)域，為ASFV保護(hù)性抗原、相關(guān)表位及其性質(zhì)多樣性的進(jìn)一步探明奠定了基礎(chǔ)。

2 ASF檢測(cè)方法研究進(jìn)展

ASF作為一種高度烈性傳染病，由于該病病程極短、病死率極高，發(fā)病癥狀容易與豬丹毒、豬繁殖與呼吸綜合征等病混淆，且尚無高效的疫苗，已對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊，因此需要通過快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法來診斷ASF，為ASF的預(yù)防控制與根除提供基礎(chǔ)性的幫助[33-34]。

2.1 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(haemadorption，HAD)是基于感染ASFV的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面能夠被豬的紅細(xì)胞吸附，在出現(xiàn)病變前可形成便于識(shí)別的玫瑰花環(huán)狀[35]，因此該方法早期被用于ASFV的檢測(cè)，直到1963年，有研究發(fā)現(xiàn)了沒有紅細(xì)胞吸附能力但是可以發(fā)生病變的ASFV，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，同時(shí)由于HAD整個(gè)過程需要1周的時(shí)間，無法滿足當(dāng)前ASF發(fā)病迅速需快速篩查的需求，因此當(dāng)前沒有得到廣泛應(yīng)用。

2.2 熒光抗體檢測(cè)熒光抗體檢測(cè)(fluorescent antibody test，F(xiàn)AT)是利用標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(FITC)的特異性抗體與感染發(fā)病豬的組織中的ASFV抗原結(jié)合，通過顯微鏡觀察熒光情況來判定是否感染ASFV。FAT不但可以用于鑒定不產(chǎn)生HAD反應(yīng)的ASFV毒株，而且可用于鑒別診斷由ASFV或其他病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞病變，但由于操作復(fù)雜且不能檢出亞急性和慢性病例，逐漸被PCR技術(shù)取代。

2.3 PCR檢測(cè)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室診斷ASFV最常用的診斷方法，WANG等[36]采用β-actin作為內(nèi)參基因，以p72基因?yàn)榘悬c(diǎn)，根據(jù)GenBank中69條β-actin序列和1 012條p72序列設(shè)計(jì)引物和探針，以確保覆蓋更廣泛的宿主和ASFV范圍，建立了高度敏感、特異、快速的ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。LIN等[37]根據(jù)ASFVB646L、MGF360-14L和CD2v基因設(shè)計(jì)了3套引物和探針，建立了可同時(shí)鑒別檢測(cè)ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重?zé)晒釶CR方法，該方法靈敏度比OIE推薦的熒光PCR還高10倍，具有較好的實(shí)用性。韋瑩華等[38]以ASFV的p72基因作為檢測(cè)靶基因，建立了一步法可視化等溫檢測(cè)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本基因組40 min內(nèi)完成檢測(cè)，可肉眼直接判斷檢測(cè)結(jié)果，該方法為ASF的現(xiàn)場(chǎng)診斷和疫情監(jiān)測(cè)提供了一種可靠、便捷、低成本的選擇。WANG等[39]基于p10基因建立了實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法和目視LAMP法檢測(cè)ASFV，為ASFV的預(yù)防和控制提供了有前景的解決方案，有助于進(jìn)行初步的、具有成本效益的監(jiān)測(cè)。曾宇晨等[40]參考ASFVB646L、EP402R和MGF360/505基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性的酶促重組酶擴(kuò)增(enzymatic recombinase amplification,ERA)探針和引物，建立了42℃等溫條件下檢測(cè)ASFV DNA的ERA方法，該方法對(duì)陽性樣品的檢測(cè)下限均為102拷貝/μL，為流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種快速有效的檢測(cè)方法。REN等[41]建立了一種基于重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)-CRISPR的ASF核酸檢測(cè)方法，該方法具有與TaqMan qPCR相同的靈敏度，在養(yǎng)豬業(yè)的臨床檢疫和食品安全方面的應(yīng)用具有很大的潛力。此外，IDEXX公司基于p72蛋白研制的ASFV實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒已經(jīng)商品化，為ASFV的快速檢測(cè)提供了幫助。當(dāng)前無商品疫苗的情況下，根據(jù)ASFV復(fù)制過程必需且保守的蛋白基因，建立靈敏、特異的PCR方法，對(duì)ASFV進(jìn)行檢測(cè)，是目前有效防控ASF的重要手段之一，隨著ASFV蛋白特性的不斷探明，針對(duì)不同蛋白基因的檢測(cè)方法也將逐漸建立。

2.4 ELISA檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)適合于短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品的大規(guī)模篩查，是ASFV抗體檢測(cè)所使用的主要方法，目前商品化的檢測(cè)試劑盒主要以強(qiáng)免疫原性的p30和p54蛋白作為檢測(cè)抗原，美國(guó)IDEXX公司開發(fā)了基于p30和p54蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒。CAO等[42]制備ASFV p54蛋白的單克隆抗體并確定了該單克隆抗體的靶表位，利用合成的表位肽作為抗原建立了高敏感性和特異性的ELISA方法，對(duì)ASF疫病的監(jiān)測(cè)和控制具有很大的潛力。TESFAGABER等[43]通過制備和鑒定p54蛋白單克隆抗體開發(fā)了一種基于單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)用于ASFV抗體檢測(cè)，為快速、方便的ASFV血清學(xué)診斷提供了一種有前途的方法，可作為其他血清學(xué)方法篩查ASFV感染的替代方法。GIMéNEZMUR等[44]通過多重?zé)晒馕⑶蛎庖叻治?FMIA)，比較ASFV感染豬的早期血清抗體反應(yīng)(NHV-p68分離物)與3種主要的重組多肽(p30、p54、p72)，選擇作為ELISA的重組蛋白，開發(fā)了一種基于重組蛋白p30間接ELISA方法檢測(cè)血清和唾液，為AFS的檢測(cè)提供新的方法。LI 等[45]提出雙QDM重組病毒蛋白p30和p54探針和體外預(yù)培養(yǎng)，作為QDM基礎(chǔ)的ASFV免疫傳感器(QAIS)，用于血清中ASFV抗體的超敏定量檢測(cè)，與商品化酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)和膠體金免疫試紙條(CGICS)相比，其檢測(cè)靈敏度分別至少提高1個(gè)數(shù)量級(jí)和4個(gè)數(shù)量級(jí)，具有很好的實(shí)用性。ASFV ELISA抗體檢測(cè)對(duì)于豬群ASF的防控中起到重要作用，不僅可用于ASF隱性感染豬的篩查，還可為ASF疫苗上市后的免疫效果評(píng)價(jià)提供工具。

2.5 膠體金免疫層析技術(shù)膠體金免疫層析技術(shù)(colloidal gold immunochromatography assay，CGICA)具有方便、精準(zhǔn)、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多領(lǐng)域的檢測(cè)中[46]。鄔旭龍等[46]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的ASFV pK205R蛋白制備了ASFV膠體金免疫層析試紙條，該方法具有較高的特異性，對(duì)表達(dá)的重組蛋白最小檢測(cè)量為30～40 mg/L，為ASFV陽性養(yǎng)殖場(chǎng)的帶毒豬快速篩選提供便捷的條件。LI等[47]選擇截短的p54蛋白作為抗原，并將其與銪元素?fù)诫s的熒光微球結(jié)合作為示蹤劑，特異性檢測(cè)ASFV抗體，該方法與商業(yè)ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。WANG等[48]將重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)與側(cè)流相結(jié)合，開發(fā)了用于ASFV即時(shí)診斷的金納米顆粒檢測(cè)條，該方法不需要任何昂貴的儀器，在ASFV疫情監(jiān)測(cè)和控制中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 ASF疫苗研究進(jìn)展

自1921年ASF在肯尼亞暴發(fā)以來，關(guān)于ASF疫苗的研究和討論從未停歇，但是由于ASFV龐大的基因組、復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制和龐雜的宿主細(xì)胞信號(hào)調(diào)控通路，導(dǎo)致對(duì)ASFV的遺傳變異以及參與宿主適應(yīng)和病毒與宿主之間的相互作用認(rèn)識(shí)的不足，阻礙了有效疫苗的開發(fā)，但近年來對(duì)ASF疫苗的探究成果為有效疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

3.1 滅活疫苗滅活疫苗是先對(duì)病毒或細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，再用加熱或化學(xué)試劑將其滅活后結(jié)合佐劑制作而成的疫苗。因其具有安全、不存在散毒危險(xiǎn)、便于貯存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，滅活疫苗得到了廣泛的應(yīng)用。同樣，對(duì)ASF滅活疫苗也展開了研究，但由于在宿主細(xì)胞內(nèi)外不同區(qū)域成熟ASFV粒子的病毒顆粒表面蛋白有著巨大差異，免疫原性的差異也會(huì)受到影響，接種豬后雖然產(chǎn)生抗體但不能對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[49]，目前關(guān)于滅活疫苗的研究還在進(jìn)一步進(jìn)行中。

3.2 減毒活疫苗減毒活疫苗是將病原微生物在人工條件下使其致病性減弱，但仍保留其繁衍能力和免疫原性，制成的減毒活疫苗，即保持了抗原性的一類疫苗。該種疫苗無需添加佐劑，價(jià)格低廉，將其接種到體內(nèi)后，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的記憶B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，起到長(zhǎng)期或終生保護(hù)的作用。目前，可將ASF減毒活疫苗分為自然致弱活疫苗和重組致弱活疫苗。自然界中存在的2株ASFV弱毒株NH/P68和OUR/T88/3，對(duì)豬群免疫后可獲得抗親本毒株的免疫保護(hù)，并能起到交叉保護(hù)作用，NH/P68可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，并抵御ASFV/L60強(qiáng)毒株的攻擊，但會(huì)造成部分豬群的慢性感染，導(dǎo)致病毒的傳播蔓延[50]。OUR/T88/3能抵御多株毒株的攻擊，但是保護(hù)力會(huì)隨著T淋巴細(xì)胞的衰竭而減退，最后引起豬群發(fā)病[51-52]，這也阻礙了這2株病毒作為ASF減毒活疫苗的推廣使用。

同樣，對(duì)重組致弱活疫苗的研究也在進(jìn)行中。PAULA等[53]將ASFV Georgia 2007分離株同時(shí)刪除9GL和UK基因，免疫豬群后發(fā)現(xiàn)可以免受BA71的攻擊。DOUGLAS等[54]通過敲除9GL基因后，再刪除CD2v和C型凝集素樣病毒基因，構(gòu)建了2種新的重組病毒ASFV-G-△9GL/△CD2v和ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R，發(fā)現(xiàn)ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R在豬巨噬細(xì)胞中的體外復(fù)制能力降低，同時(shí)ASFV-G-△9GL/△CD2v和ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R在接種豬群后誘導(dǎo)了幾乎無法檢測(cè)到的病毒血癥水平，但是未能保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒ASFV Georgia的攻擊。張艷艷等[1]以我國(guó)首例ASF疫病中分離的流行毒株SY18為親本株構(gòu)建了多基因家族MGF基因和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗，針對(duì)安全性和有效性的研究結(jié)果顯示接種豬能夠100%抵抗親本強(qiáng)毒株SY18株的攻擊，說明該毒株可作為ASF疫苗候選株。TESHALE等[55]構(gòu)建了同時(shí)缺失CD2v和UK基因的ASFV-SY18-△CD2v/UK株，并通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫ASFV-SY18-△CD2v/UK豬均能抵抗親本株ASFV-SY18的攻擊，表明能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,可作為控制ASF的潛在疫苗候選株，為研制具有交叉免疫保護(hù)效果的疫苗提供了新的思路。

3.3 亞單位疫苗亞單位疫苗是利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，因其成分中不含病毒核酸部分被稱為最安全的疫苗。但由于ASFV強(qiáng)大的基因組可編碼超過200種蛋白，給疫苗優(yōu)質(zhì)抗原的篩選造成了很大的挑戰(zhàn)。目前，許多ASFV亞單位疫苗的研究都以ASFV p30和p54蛋白為基礎(chǔ)，這2種結(jié)構(gòu)蛋白分別參與病毒附著和內(nèi)化，它們都能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體[56]。僅用p30或p54抗原免疫豬不足以保護(hù)豬免受ASF強(qiáng)毒的侵襲，然而PUERTAS等[56]發(fā)現(xiàn)將p30和p54抗原同時(shí)免疫豬會(huì)使豬的臨床癥狀出現(xiàn)延遲，病毒血癥減輕，有半數(shù)的試驗(yàn)豬可免于E75毒株的毒力攻擊。BARDERAS等[57]用桿狀病毒表達(dá)的p30/p54融合蛋白免疫豬也能減輕病毒血癥，并保護(hù)所有豬免受E75強(qiáng)毒株的攻擊。IVANOV等[58]研究了選擇多肽模仿病毒蛋白建立保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效性，在分析ASFV全核苷酸序列的基礎(chǔ)上對(duì)合成的46個(gè)肽段在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫原性檢測(cè)，篩選出17個(gè)最佳的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)肽，為進(jìn)一步開發(fā)一種有效的ASF疫苗提供了依據(jù)。

3.4 病毒活載體疫苗病毒活載體疫苗是將致病微生物的免疫保護(hù)基因插入到載體病毒的非必需區(qū)，構(gòu)建成重組病毒制備成的疫苗[59]。SHEHNAZ等[60]利用腺病毒作為載體，將ASFV的p32、p54、pp62和p72蛋白分別作為抗原，以雞尾酒形式免疫豬群，結(jié)果顯示豬群體內(nèi)出現(xiàn)了特異性抗體，但是有效性還有待考究。CHEN等[61]通過反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了表達(dá)ASFV p72蛋白的重組新城疫病毒(rNDV)，發(fā)現(xiàn)重組病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制良好，在小鼠模型中評(píng)估了其體液和細(xì)胞免疫原性，結(jié)果表明表達(dá)ASFV p72的rNDV可能是預(yù)防ASF的潛在候選疫苗。

3.5 核酸疫苗核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防疫病的一類疫苗。ARGILAUGET等[62]將編碼ASFV血凝素(sHA)胞外結(jié)構(gòu)域的基因插入到質(zhì)粒pCMV-PQ的P30、P54融合蛋白基因(PQ)N端從而獲得pCMV-sHAPQ質(zhì)粒，將其免疫豬后盡管不能使免疫豬抵抗ASFV E75毒株的致死性攻擊，但免疫豬的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。然而在pCMV-sHAPQ質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，融合泛素(Ub)基因，獲得的質(zhì)粒pCMV-UbsHAPQ免疫豬后，不能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生抗體，但使免疫豬產(chǎn)生了特異的T細(xì)胞反應(yīng)，并能保護(hù)部分免疫豬抵抗ASFV的致死性攻擊，進(jìn)一步證實(shí)了T細(xì)胞免疫在機(jī)體抗ASFV中的作用以及DNA疫苗特別是重組DNA疫苗作為未來ASFV候選疫苗的研究潛力。ANNA等[63]構(gòu)建了一個(gè)包含4 000多個(gè)質(zhì)?？寺〉谋磉_(dá)文庫，用該表達(dá)庫免疫豬群后發(fā)現(xiàn)對(duì)E75強(qiáng)毒株的致死性攻擊有60%的保護(hù)效果，為控制該病毒提供了一個(gè)可能的靶點(diǎn)。

4 討論

近年來，隨著對(duì)ASFV相關(guān)研究的深入，ASFV病毒蛋白的結(jié)構(gòu)及功能逐漸清晰，但由于ASFV基因組龐大，仍有大量蛋白功能尚不清楚。在ASF的防控方面，由于ASFV的復(fù)雜性，以及其免疫逃逸機(jī)制和具體抗原的知識(shí)匱乏，缺乏可用的ASF疫苗，當(dāng)前預(yù)防ASF的主要措施是應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行篩查，但因ASFV傳播速度快、發(fā)病急等特點(diǎn)，需要對(duì)疫區(qū)豬只全部撲殺并作無害化處理，因此給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，導(dǎo)致ASF成為當(dāng)今世界養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)威脅，并對(duì)全球商業(yè)平衡產(chǎn)生了負(fù)面影響[64]。

加快ASFV蛋白功能、入侵機(jī)制、免疫逃逸機(jī)制的探明；確認(rèn)ASFV各類疫苗的安全性和有效性、加速向行業(yè)化轉(zhuǎn)移、進(jìn)行正式注冊(cè)和商業(yè)化，用于ASFV的預(yù)防；建立快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，用于ASF的精準(zhǔn)篩查等，均是有效防控ASF急需解決的問題。