環(huán)境DNA方法對(duì)進(jìn)口親蝦攜帶水中宿主物種的鑒定

張 娜 ， 劉 驍 ， 鄭 樞 ， 謝艷輝 ， 劉 葒 ， 鄭舒尹 ， 李家僑

(1.湛江海關(guān)技術(shù)中心 ， 廣東 湛江 524000 ； 2.湛江海關(guān) ， 廣東 湛江 524000；3.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 ， 廣東 深圳 518045)

環(huán)境DNA(Environmental DNA，eDNA)是環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)的，許多不同生物體基因組DNA的復(fù)雜混合物[1]。環(huán)境樣本包括土壤、沉淀物、水和糞便等，也包括過(guò)濾空氣或水、過(guò)濾沉積物或大塊狀樣品所產(chǎn)生的物質(zhì)。eDNA的研究對(duì)象是環(huán)境樣本中提取的DNA，基于環(huán)境樣本DNA的收集為所研究的體系獲得盡可能全面的分類或功能信息[2]。傳統(tǒng)的生物多樣性評(píng)估方法是利用捕獲或記錄的個(gè)體來(lái)確定生物的存在或豐度，與直接取樣的傳統(tǒng)生物多樣性評(píng)估方法不同，eDNA檢測(cè)方法具有非侵入性和敏感性。一些研究證實(shí)，eDNA已經(jīng)成功應(yīng)用于單一物種生物入侵、難以捕獲或威脅性較大的動(dòng)物物種監(jiān)測(cè)中[3-4]。eDNA檢測(cè)方法在檢測(cè)瀕危、低密度入侵的生物監(jiān)測(cè)時(shí)比傳統(tǒng)的生物監(jiān)測(cè)方法更準(zhǔn)確、更靈敏[5-7]。Biggs等采用eDNA方法對(duì)英國(guó)瀕危大冠蠑螈的監(jiān)控效率比傳統(tǒng)方法高出許多，并且不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性[8]。eDNA研究具有易野外取樣和能探測(cè)隱秘物種等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于廣泛直接取樣的生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)來(lái)說(shuō)是一種有吸引力的替代方法[9-10]。

種蝦入境不僅具有外來(lái)物種入侵風(fēng)險(xiǎn)，而且存在傳播疫病風(fēng)險(xiǎn)，容易給養(yǎng)殖戶及企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖水作為水生動(dòng)物生存的重要環(huán)境因素，也可成為一種外來(lái)物種入侵和疫病生物風(fēng)險(xiǎn)因素之一。本試驗(yàn)以進(jìn)口親蝦攜帶水作為研究對(duì)象，運(yùn)用eDNA檢測(cè)方法進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦物種檢測(cè)分析，并對(duì)攜帶水進(jìn)行宏基因組測(cè)序，分析進(jìn)口親蝦攜帶水中凡納濱對(duì)蝦物種含量，為水生動(dòng)物外來(lái)物種入侵技術(shù)的探討提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為eDNA技術(shù)在檢測(cè)外來(lái)物種入侵中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 進(jìn)境親蝦及水樣品，由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNeasy Blood and Tissue Kit，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN有限公司；ExTaq酶，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和聚碳酸酯膜，均購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；PCR管，購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；UltraTMDNA Library Prep Kit，購(gòu)自美國(guó)NEB生物公司；GenNextTMNGS Library Quantification Kit，購(gòu)自日本東洋紡生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備 PCR儀(ABI ProFlex，美國(guó)ABI)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5417R，德國(guó)艾本德)，真空泵(GM-0-33A，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Qubit熒光儀(Qubit 4，美國(guó)Invitrogen)，超聲波基因組剪切儀 (M220,美國(guó)Covaris)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水樣品eDNA收集和DNA提取 以進(jìn)口親蝦攜帶水樣為研究對(duì)象，每個(gè)水樣取1～2 L，使用孔徑為0.45 μm的過(guò)濾膜，采用無(wú)菌真空抽濾裝置進(jìn)行過(guò)濾。每次過(guò)濾之前用無(wú)菌水、0.5 mol/L氫氧化鈉、3%次氯酸鈉沖洗過(guò)濾漏斗，防止交叉污染。過(guò)濾完成后，將每張過(guò)濾膜單獨(dú)放入1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取 DNA，為了利于過(guò)濾膜中的DNA釋放，對(duì)樣品處理稍加改進(jìn)。將過(guò)濾膜取出解凍后，用剪刀將過(guò)濾膜剪成細(xì)條狀，放入 2 mL 的離心管中，加入試劑盒中裂解液 ATL 550 μL和蛋白酶 K 80 μL，渦旋混勻，恒溫水浴 3 h (期間每隔 15 min 輕輕顛倒混勻)；加入試劑盒中Buffer AL 600 μL，渦旋振蕩混勻。之后的操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的核酸置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同過(guò)濾膜、不同樣本體積對(duì)于eDNA獲取的影響 以20個(gè)進(jìn)口親蝦攜帶水樣為研究對(duì)象，分別取硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和聚碳酸酯膜3種過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，每種過(guò)濾膜的孔徑均為0.45 μm。每個(gè)樣本、每個(gè)過(guò)濾膜分別過(guò)濾水樣1 L、2 L，對(duì)應(yīng)每個(gè)過(guò)濾膜分別做2個(gè)重復(fù)。過(guò)濾后的過(guò)濾膜按照1.3.1方法進(jìn)行DNA提取，通過(guò)Quibt熒光計(jì)測(cè)定DNA濃度。

1.3.3 凡納濱對(duì)蝦宿主物種鑒定 在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索凡納濱對(duì)蝦 EF584003.1線粒體保守基因序列，使用 Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為347 bp。引物序列為：F2:5′-AACAGCCCTCACTA-TTTCAAG-3′；R2:5′-ATCGTTGCGTTGGATAAAATG-3′。

提取凡納濱對(duì)蝦組織 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：10×PCR buffer(Mg2+Plus) 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA 5 μL，加水至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行目的條帶測(cè)序和質(zhì)粒構(gòu)建。目的條帶序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，確定為凡納濱對(duì)蝦 EF584003.1線粒體基因序列，質(zhì)粒放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 不同來(lái)源水樣中的宿主物種鑒定比對(duì) 設(shè)立3個(gè)不同來(lái)源的水樣進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，分別為：成蝦養(yǎng)殖池塘水樣(10份樣品)、進(jìn)口親蝦攜帶水水樣(10份樣品)、親蝦養(yǎng)殖池塘水樣(10份樣品)。每份水樣分別取1.5 L并用硝酸纖維膜過(guò)濾，提取過(guò)濾膜DNA，按照1.3.3方法進(jìn)行宿主物種鑒定。

1.3.5 不同過(guò)濾膜中的宿主物種鑒定比對(duì) 根據(jù)1.3.2結(jié)果分析，聚碳酸酯膜過(guò)濾易發(fā)生堵塞，過(guò)濾水樣體積達(dá)不到1.5 L，所以本階段過(guò)濾分別使用硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜對(duì)20份進(jìn)口親蝦攜帶水樣進(jìn)行過(guò)濾，每個(gè)樣品過(guò)濾1.5 L，按照1.3.3方法進(jìn)行宿主物種鑒定。

1.3.6 不同取樣時(shí)間的宿主物種鑒定比對(duì) 取4份進(jìn)口親蝦水樣(設(shè)為水樣1、水樣2、水樣3、水樣4)，每份水樣設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每份水樣分別是放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后過(guò)濾。按1.3.1方法提取過(guò)濾膜DNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠方法觀察DNA降解情況。按1.3.3方法進(jìn)行宿主物種鑒定。

1.3.7 水過(guò)濾膜eDNA的宏基因組測(cè)序分析 對(duì)進(jìn)口親蝦攜帶水過(guò)濾膜提取的DNA使用Quibt熒光計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定，送往廣州美格生物科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。取質(zhì)量合格的樣品構(gòu)建基因文庫(kù)。利用超聲波基因組剪切儀將各基因組 DNA 樣本隨機(jī)打斷成300 bp左右的片段，隨后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，首先對(duì)原始序列進(jìn)行去接頭、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理，然后使用優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行拼接組裝和基因預(yù)測(cè)，對(duì)得到的基因進(jìn)行物種和功能上的注釋以及分類。

2 結(jié)果

2.1 不同過(guò)濾膜、不同樣本體積對(duì)于eDNA獲取的影響 分別用硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜3種過(guò)濾膜過(guò)濾水樣1 L、2 L。結(jié)果如圖1和圖2所示，使用硝酸纖維素膜過(guò)濾水樣獲得的eDNA的濃度大于相同體積的玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜。在過(guò)濾過(guò)程中玻璃纖維膜過(guò)濾速度最快，而聚碳酸酯膜過(guò)濾最慢，并且容易發(fā)生堵塞。在過(guò)濾2 L水樣時(shí)，聚碳酸酯膜發(fā)生堵塞的情況最多，影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果。從結(jié)果還可以看出，過(guò)濾2 L水樣比過(guò)濾1 L水樣時(shí)獲得的eDNA的濃度高，但是低于1 L水樣得到的eDNA濃度的2倍，說(shuō)明水樣中eDNA的獲取達(dá)不到與體積成正比關(guān)系，會(huì)受到過(guò)濾膜中DNA提取、水樣過(guò)濾時(shí)損失等因素的影響。

圖1 3種過(guò)濾膜分別過(guò)濾1 L親蝦攜帶水的eDNA濃度對(duì)比 Fig.1 Comparison of eDNA concentration in 1 L parent shrimp carrying water filtered by three kinds of filtration membranes

圖2 用3種過(guò)濾膜分別過(guò)濾2 L親蝦攜帶水的eDNA濃度對(duì)比 Fig.2 Comparison of eDNA concentration in 2 L parent shrimp carrying water filtered by three kinds of filtration membranes

2.2 不同來(lái)源水樣中的宿主物種鑒定比對(duì) 如圖3所示，本試驗(yàn)成功地從10份成蝦養(yǎng)殖池塘水樣中擴(kuò)增出347 bp的特異性目的片段，目的條帶單一且明亮，與預(yù)期大小一致；如圖4所示，10份親蝦養(yǎng)殖池塘水樣(飼養(yǎng)超過(guò)15 d)中有8份水樣成功擴(kuò)增出特異性目的片段；如圖5所示，10份進(jìn)口親蝦攜帶水水樣中有4份水樣成功擴(kuò)增出特異性目的片段。測(cè)序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶的序列與EF584003.1線粒體基因片段同源性達(dá)100%。

圖3 成蝦養(yǎng)殖池塘水樣凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.3 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from adult shrimp culture ponds1～10:10個(gè)成蝦養(yǎng)殖池塘水樣鑒定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； M：DL-2 000 DNA Marker1-10:PCR amplification products of 10 water samples from adult shrimp culture ponds; M:DL-2 000 DNA Marker

圖4 親蝦養(yǎng)殖池塘水樣凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.4 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from broodstock culture ponds1～10:10個(gè)親蝦養(yǎng)殖池塘水樣鑒定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； M：DL-2 000 DNA Marker 1-10:PCR amplification products of 10 water samples of broodstock culture ponds; M:DL-2 000 DNA Marker

圖5 進(jìn)口親蝦水樣凡納濱對(duì)蝦物種鑒定 Fig.5 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps1～10:10個(gè)進(jìn)口親蝦水樣鑒定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； P：陽(yáng)性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA Marker1-10:PCR amplification products of 10 water samples from imported parent shrimps; P: Positive control; M:DL-2 000 DNA Marker

2.3 不同過(guò)濾膜中的宿主物種鑒定比對(duì) 如圖6所示，硝酸纖維素膜過(guò)濾后，20份水樣中有12份水樣成功擴(kuò)增出特異性目的片段；如圖7所示，玻璃纖維膜過(guò)濾后，20份水樣中有9份樣品成功擴(kuò)增出特異性目的片段。此結(jié)果與2.1結(jié)果一致，同樣體積的水樣使用硝酸纖維素膜過(guò)濾后獲得的eDNA濃度較高，擴(kuò)增效果好。

圖6 硝酸纖維素膜過(guò)濾進(jìn)口親蝦水樣的凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.6 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps filtered by nitrocellulose membrane1～20:20個(gè)經(jīng)硝酸纖維素膜過(guò)濾的進(jìn)口親蝦水樣的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA Marker1-20:PCR amplification products of 20 water samples from imported parent shrimps filtered by nitrocellulose membrane; P:Positive control; N:Negative control; M:DL-2 000 DNA Marker

圖7 玻璃纖維膜過(guò)濾進(jìn)口親蝦水樣的凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.7 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps filtered by glass fiber membrane1～20:20個(gè)經(jīng)玻璃纖維膜過(guò)濾的進(jìn)口親蝦水樣的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA Marker1-20:PCR amplification products of 20 water samples from imported parent shrimps filtered by glass fiber membrane; N:Negative control; P:Positive control; M:DL-2 000 DNA Marker

2.4 不同取樣時(shí)間的宿主物種鑒定比對(duì) 如圖8所示，樣品放置時(shí)間越長(zhǎng)，DNA降解越多，在放置0.5 d后過(guò)濾已經(jīng)有DNA降解，在放置3 d過(guò)濾獲得的DNA降解非常多，在放置6 d時(shí)DNA已經(jīng)全部降解。

凡納濱對(duì)蝦特異性鑒定結(jié)果如圖9～圖11所示,樣品不放置(0 h)時(shí)，所有樣品PCR擴(kuò)增條帶均非常亮；在水樣放置2 d后，PCR擴(kuò)增條帶已非常弱。但由圖8結(jié)果對(duì)比可知，放置2 d后的樣品過(guò)濾得到的DNA降解不嚴(yán)重。過(guò)濾后可以鑒定出宿主的水樣最長(zhǎng)放置時(shí)間分別為：水樣1為3 d，水樣2為4 d，水樣3為4 d，水樣4為3 d。

圖8 進(jìn)口親蝦水樣放置不同時(shí)間進(jìn)行過(guò)濾后DNA電泳降解圖 Fig.8 DNA electrophoretic degradation of water samples from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; P：陽(yáng)性對(duì)照； N：陰性對(duì)照； M：DL-5 000 DNA Marker 1-8:Samples were placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; P:Positive control; N:Negative control; M：DL-5 000 DNA Marker

圖9 進(jìn)口親蝦水樣1和水樣2分別在放置不同時(shí)間過(guò)濾后凡納濱對(duì)蝦物種鑒定 Fig.9 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 1 and sample 2 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8和A～H：樣品1和樣品2分別放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d；N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照； M: DL-2 000 DNA Marker1-8 and A-H：sample 1 and sample 2 were placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

圖10 進(jìn)口親蝦水樣3在放置不同時(shí)間過(guò)濾后凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.10 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 3 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品3放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA Marker1-8:Sample 3 was placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

圖11 進(jìn)口親蝦水樣4在放置不同時(shí)間過(guò)濾后凡納濱對(duì)蝦物種鑒定Fig.11 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 4 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品4放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA Marker1-8:Sample 4 was placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

2.5 水過(guò)濾膜eDNA的宏基因組測(cè)序分析 對(duì)進(jìn)口親蝦的環(huán)境水過(guò)濾膜進(jìn)行宏基因組測(cè)序，使用 DIAMOND 軟件將 UniqGeneSet 與 NCBI 的NR 序列進(jìn)行比對(duì)(Blastp 比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值為1e-5)；取相似度最高的比對(duì)序列作為該序列的物種注釋信息，基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度，并在各個(gè)分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種在各個(gè)樣品中的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜(Abundance profile)。為了綜合而直觀的展示各樣品中不同分類層級(jí)的物種相對(duì)豐度，采用 Krona 對(duì)物種注釋結(jié)果進(jìn)行可視化展示，十足目(Decapoda)對(duì)蝦科(Penaeidae)對(duì)蝦屬(Penaeus)的總序列豐度占比如圖12所示，凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)物種序列占對(duì)蝦屬的40%，日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)占38%，斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)占10%，加州對(duì)蝦(Penaeuscaliforniensis)占3%，印度對(duì)蝦(Penaeusindicus)占3%，中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)占2%，其他對(duì)蝦屬(Penaeussp.)序列占3%。在宏基因組測(cè)序得到的所有物種序列中，宿主凡納濱對(duì)蝦測(cè)序序列物種豐度占比最高。

圖12 水濾膜eDNA的宏基因組測(cè)序 Krona 示例圖Fig.12 Krona map after metagenome sequencing of water filtration membrane eDNA

3 討論

3.1 不同過(guò)濾膜、不同樣品體積對(duì)于eDNA獲取的影響 有文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)說(shuō)明，eDNA濃度和過(guò)濾樣本體積呈正增長(zhǎng)關(guān)系[11]，但是，樣本量過(guò)大時(shí)容易發(fā)生過(guò)濾膜堵塞情況。本試驗(yàn)中，對(duì)20份樣本分別用硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜進(jìn)行過(guò)濾，結(jié)果顯示，玻璃纖維膜不容易堵，流速也快，過(guò)濾所用時(shí)間最短，過(guò)濾的樣品量也最多，最多的時(shí)候可以達(dá)到4 L；聚碳酸酯膜過(guò)濾效果不好，且容易發(fā)生堵塞。所以水樣渾濁或有大量浮游植物時(shí)，先用大孔徑(如100目)尼龍膜預(yù)過(guò)濾后再用0.45 μm孔徑過(guò)濾膜過(guò)濾效果更好。

3.2 凡納濱對(duì)蝦的特異性引物設(shè)計(jì) 大多數(shù)eDNA可能來(lái)源于排放的尿液和糞便物質(zhì)[12-13]、從外部黏液層脫落的上皮細(xì)胞[14]和從分解有機(jī)體中脫落的組織[15]。研究顯示，魚(yú)類、兩棲動(dòng)物和軟體動(dòng)物向環(huán)境中釋放大量的eDNA[16]。Tréguier等[17]在低豐度條件下檢測(cè)小龍蝦eDNA時(shí)遇到了困難，節(jié)肢動(dòng)物的eDNA似乎很難檢測(cè)，可能是因?yàn)樗鼈兊耐夤趋罍p少了表皮細(xì)胞的脫落。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證了多個(gè)凡納濱對(duì)蝦物種鑒定引物，在驗(yàn)證不同引物時(shí)，有的引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在測(cè)序時(shí)會(huì)得到很多非特異性結(jié)果，分析原因應(yīng)是eDNA 的成分較為復(fù)雜，含有許多其他物種和細(xì)菌、病毒的DNA，所以對(duì)引物的特異性要求更高。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并驗(yàn)證后選用的凡納濱對(duì)蝦物種鑒定引物的特異性較強(qiáng)，沒(méi)有擴(kuò)增出其他物種序列，且該引物靈敏度較好。

3.3 不同條件對(duì)凡納濱對(duì)蝦物種鑒定的影響 蝦體養(yǎng)殖時(shí)間較長(zhǎng)的蝦塘水樣，更容易進(jìn)行宿主物種鑒定。已有多個(gè)研究證實(shí)，eDNA的含量與對(duì)蝦的生存時(shí)間和排泄能力有關(guān)[18-21]。本試驗(yàn)中部分進(jìn)口親蝦攜帶水水樣沒(méi)有擴(kuò)增出凡納濱對(duì)蝦的特異性條帶，分析原因是攜帶水中蝦的數(shù)量較少或蝦在攜帶水中的生存時(shí)間較短，所釋放的eDNA含量太低。這個(gè)情況也是eDNA方法用于鑒定水中物種的缺點(diǎn)之一，需進(jìn)一步加強(qiáng)eDNA濃縮和富集方法的研究。

eDNA衰變的主要途徑是組織和顆粒的物理降解。脫落的生物組織快速?gòu)亩嗉?xì)胞組織碎片降解為單個(gè)細(xì)胞、分離的細(xì)胞器(如線粒體)，并最終釋放DNA，然后通過(guò)外源酶或自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)一步降解DNA，降解的程度影響eDNA是否可以被捕獲[22-24]。本試驗(yàn)在對(duì)比放置時(shí)間對(duì)于物種鑒定的影響時(shí)，結(jié)果顯示，樣本放置時(shí)間越長(zhǎng)，eDNA的降解越多，物種鑒定越困難，故建議采集樣本后馬上進(jìn)行過(guò)濾和收集處理。本試驗(yàn)在進(jìn)行過(guò)濾時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果樣本馬上過(guò)濾則不易出現(xiàn)過(guò)濾膜堵塞情況，如果樣品放置12 h后再進(jìn)行過(guò)濾，則過(guò)濾膜很容易堵塞，水樣中會(huì)出現(xiàn)一些黏液狀物質(zhì)，分析應(yīng)該是細(xì)胞破裂后的黏液。同時(shí)，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，樣品馬上過(guò)濾時(shí)鑒定引物擴(kuò)增得到的PCR條帶最亮，而在水樣放置2 d后過(guò)濾，鑒定擴(kuò)增條帶非常弱，但是樣品馬上過(guò)濾和放置2 d后過(guò)濾所得到的核酸濃度相差不大，所以不能只以核酸濃度來(lái)判斷樣本所獲得的eDNA是否有效。

3.4 宏基因組測(cè)序在eDNA方法中的應(yīng)用 宏基因組學(xué)是以生態(tài)環(huán)境中全部DNA作為研究對(duì)象，通過(guò)克隆、異源表達(dá)來(lái)篩選有用基因及其產(chǎn)物，研究其功能和彼此之間的關(guān)系和相互作用，并揭示其規(guī)律的一門(mén)科學(xué)，它決定了生物群體的生命現(xiàn)象[5,25]。目前，宏基因組測(cè)序是eDNA研究的一個(gè)重要方法[26]。本試驗(yàn)對(duì)親蝦攜帶水進(jìn)行宏基因組測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Virus Refseq、Virus NT和Acalme 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最終的注釋結(jié)果是選取的最優(yōu)注釋。本試驗(yàn)在進(jìn)行NCBI網(wǎng)站比對(duì)時(shí)，測(cè)序序列是與NCBI中全庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，由于測(cè)序片段較短，序列比對(duì)很可能比對(duì)到其他物種上，且在線比對(duì)的參數(shù)與流程中的參數(shù)不一致，NCBI上的數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)時(shí)更新，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)法實(shí)時(shí)更新，數(shù)據(jù)庫(kù)的差異也會(huì)導(dǎo)致比對(duì)結(jié)果的差異。DNA宏基因組編碼還面臨著幾個(gè)重要的技術(shù)難題，主要涉及引物偏差和PCR錯(cuò)誤，更普遍的是需要在所有水平上進(jìn)行試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，以便進(jìn)行交叉試驗(yàn)比較。因此，eDNA研究不僅在試驗(yàn)方法上，而且在記錄相關(guān)單元分析數(shù)據(jù)方面都非常需要標(biāo)準(zhǔn)化[27]。

3.5 eDNA檢測(cè)方法的應(yīng)用與發(fā)展 eDNA檢測(cè)方法的高靈敏性和可遠(yuǎn)程檢測(cè)是其具有吸引力的主要原因，國(guó)外使用該方法在生物入侵方面的研究已經(jīng)很多。該方法非常適合于檢測(cè)瀕危、低密度入侵、瞬時(shí)和隱秘物種，特別是當(dāng)?shù)兔芏任锓N的采樣難以控制時(shí),eDNA檢測(cè)方法的敏感性、簡(jiǎn)單性和減少破壞的優(yōu)勢(shì)愈加顯現(xiàn)出來(lái)。eDNA檢測(cè)方法仍存在許多不足，比如：如何抵抗水的流動(dòng)性對(duì)于eDNA收集的影響；eDNA收集的標(biāo)準(zhǔn)化和一致性；宏基因組測(cè)序的有效性等等，這些方面仍需要更深入地研究。