仔豬腹瀉病例的RT-PCR診斷

張婧旭 ， 梁海英 ， 曾智勇 ， 湯德元 ， 王 彬 ， 萬(wàn) 娟 ， 徐松平 ， 黃二素 ， 徐 玉 ， 祝 羊

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

2020年10月初，貴州省安順市某豬場(chǎng)7日齡仔豬發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，病程初期豬只發(fā)生腹瀉、食欲廢絕、精神不濟(jì)、不愿走動(dòng)，后期由于抗生素治療無(wú)效，豬只持續(xù)性腹瀉導(dǎo)致大量脫水死亡。為明確引起腹瀉的具體病原，對(duì)送檢腹瀉病死仔豬的腸內(nèi)容物分別進(jìn)行了豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬丁型冠狀病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)診斷，現(xiàn)將診斷過(guò)程和結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品 貴州省安順市某豬場(chǎng)送檢的7日齡腹瀉病死仔豬的腸內(nèi)容物。

1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2.0、pMD19T vector、DL2 000 Marker,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒,購(gòu)自O(shè)MEGA生物有限公司。

1.3 4種病毒的RT-PCR檢測(cè) 將腹瀉病死仔豬的腸內(nèi)容物于12 000 r/min離心5 min,取上清。按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取核酸。參照參考文獻(xiàn)[1-2]設(shè)計(jì)并合成PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV的RT-PCR引物，應(yīng)用Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2.0試劑盒，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(25.0 μL):2×1 Step Buffer 12.5 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL,模板3.0 μL,上、下游引物各1.0 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)充至25.0 μL。反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PoRVVP7基因擴(kuò)增及序列分析

1.4.1 PoRVVP7基因的RT-PCR擴(kuò)增 參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中PoRVVP7基因序列，在兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物，上游引物：5′-GGCTTTAAAAGMGAGAATTTCC-3′；下游引物：5′-GGTCACATCAWACARYTCTAMY-3′。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。預(yù)計(jì)擴(kuò)增基因片段大小為1 062 bp。以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,首先置于95 ℃溫浴5 min，快速置于冰上5 min解開(kāi)雙鏈，加入引物，用Prime Script 1 Step Enzyme Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系同1.3。反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 PoRVVP7基因的序列分析 將上述RT-PCR產(chǎn)物回收純化，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并應(yīng)用MegAlign軟件，將GenBank上公布的VP7基因的G3、G4、G5、G6、G8、G9、G10血清型序列與該序列進(jìn)行親緣性分析，構(gòu)建VP7基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 4種病毒的RT-PCR檢測(cè) 電泳結(jié)果顯示，TGEV(531 bp)、PEDV(663 bp)、PDCoV(357 bp)呈陰性，未擴(kuò)增出條帶，PoRV(341 bp)呈陽(yáng)性，擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 樣品的RT-PCR檢測(cè)Fig.1 RT-PCR test of samplesM:DL2 000 DNA Marker; 1:TGEV; 2:PEDV; 3:PoRV; 4:PDCoV

2.2 PoRVVP7基因的擴(kuò)增及序列分析 PoRVVP7基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可看到約1 062 bp的特異性條帶，與預(yù)期的目的條帶大小相符(圖2)。測(cè)序所得序列[GZAS(2020)]與G5血清型處于同一分支，同源性最近，與其他血清型處于不同分支，同緣性較遠(yuǎn)(圖3)。

圖2 PoRV VP7基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 RT-PCR amplification of PoRV VP7 geneM：DL2 000 DNA Marker； 1：PoRV VP7基因M:DL2 000 DNA Marker; 1:PoRV VP7 gene

圖3 PoRV VP7基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Evolutionary tree of PoRV VP7 gene▲:本試驗(yàn)所得分離株▲:Strain obtained in this study

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)腹瀉病死仔豬腸道內(nèi)容物進(jìn)行TGEV、PEDV、PDCoV、PoRV的RT-PCR檢測(cè)，排除了TGEV、PEDV、PDCoV三個(gè)常見(jiàn)致腹瀉病毒的感染。腹瀉病死仔豬腸內(nèi)容物含有PoRV，說(shuō)明該豬場(chǎng)存在PoRV感染的情況。隨后設(shè)計(jì)引物對(duì)VP7基因進(jìn)行序列的擴(kuò)增及測(cè)序，構(gòu)建GZAS(2020)的遺傳進(jìn)化樹(shù)，確定GZAS(2020)VP7全基因的具體血清型。序列分析結(jié)果顯示，GZAS(2020)VP7全基因?qū)儆赑oRV A群G5血清型。對(duì)于該病尚無(wú)有效的治療藥物，故本病以預(yù)防為主，要做好豬只的日常飼養(yǎng)管理工作，分不同飼養(yǎng)批次消毒處理，全進(jìn)全出，注意防寒保暖，增強(qiáng)動(dòng)物的抵抗力。新生仔豬盡早吮食初乳，以獲得母源抗體的保護(hù)，當(dāng)仔豬發(fā)生腹瀉后應(yīng)立即停止哺乳。在實(shí)際治療過(guò)程中，由于該病的臨床癥狀主要為腹瀉，故在病程嚴(yán)重時(shí)會(huì)因脫水發(fā)生酸堿平衡紊亂而造成豬只死亡，飲用葡萄糖生理鹽水和碳酸氫鈉溶液有防止脫水和酸中毒的作用，對(duì)延緩病情起到較好的效果，同時(shí)高能量的日糧和限期飼喂可降低豬只的發(fā)病率和死亡率[3-4]。

1974年，英國(guó)Woode等首次從豬體分離出PoRV[5],隨后感染PoRV導(dǎo)致仔豬腹瀉死亡的病例在北愛(ài)爾蘭、澳大利亞、法國(guó)、美國(guó)等國(guó)家陸續(xù)報(bào)道,PoRV的廣泛傳播逐漸引起了世界各國(guó)的重視[6]。PoRV主要感染幼齡仔豬，患病豬和帶毒豬是主要傳染源，經(jīng)消化道感染，傳播迅速，流行面廣。飼喂非全價(jià)飼料，應(yīng)激，在寒冷、潮濕、衛(wèi)生不良的飼養(yǎng)環(huán)境下，繼發(fā)或并發(fā)其他疾病等都可加重病情[7]。仔豬患腹瀉病的情況在豬場(chǎng)非常普遍且發(fā)病情況日益嚴(yán)重，豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TEG)、豬輪狀病毒病(Porcine rotavirus disease,RV)、豬丁型冠狀病毒病(Porcine delta coronavirus disease,PDCo)是嚴(yán)重困擾養(yǎng)豬場(chǎng)的病毒性傳染病，發(fā)病時(shí)的臨床癥狀極為相似，難以鑒別，一旦豬群發(fā)病會(huì)導(dǎo)致大范圍的迅速傳播，同時(shí)病毒難以凈化，為了加強(qiáng)這4種腹瀉疾病的防控，避免造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，通常養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生腹瀉類(lèi)疾病時(shí)會(huì)要求同時(shí)檢測(cè)這幾種病毒，以便及時(shí)采取有效的防控治療措施[8-9]。動(dòng)物源的輪狀病毒是人新型輪狀病毒的潛在來(lái)源，具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[10]。