川楝子醇提物抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖的作用機制研究

苗玉迪 胡星星 王九菊 李艷春

(1 陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，西安，710068； 2 西安大興醫(yī)院檢驗科，西安，710016； 3 西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院血液病醫(yī)院實驗診斷中心，西安，710018)

白血病在臨床上較為常見，主要是由于造血干細胞于不同的階段，出現(xiàn)凋亡受阻、失控性增殖、異常分化等情況，從而導致組織被大量的克隆性白血病細胞累積、浸潤，最終影響正常的造血功能[1]。人急性T淋巴細胞為白血病最為常見的類型，主要起源于T系細胞，以惡性增殖為主[2]。對于此癥，臨床多采用化學療法、造血干細胞移植等，但該類治療方法不良反應較大，預后不佳[3]。因此，及時尋求一種有效、價格低廉的治療藥物為臨床亟待解決的問題。川楝子為楝科落葉喬木植物川楝的成熟果實，主要產(chǎn)于貴州、四川等地，味苦、性寒，具有疏肝泄熱、行氣止痛等功效[4]。報道顯示，該藥可抑制神經(jīng)遞質(zhì)、抗癌、抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡等，多用于治療肝癌、胃癌等疾病中，但關(guān)于川楝子對白血病的應用機制及效果報道鮮見[5]?；诖耍疚倪x擇急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)細胞株及雌性大鼠12只作為實驗對象，展開以下分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物 選取2020年1月至2021年12月實驗中心提供的人急性淋巴白血病細胞T淋巴細胞(CCRF-CEM)，患者均知情同意，本研究通過陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(倫理審批號：2020PS001K)及無特定病原體Specific Pathogen Free，SPF)動物級6周Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠12只購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK2013-0001)，體質(zhì)量為(310.00±10.00)g，飼養(yǎng)條件：室溫20～26 ℃，相對濕度：50%～70%，單籠喂養(yǎng)，喂飼粉狀基礎(chǔ)飼料，自由攝食、飲水，實驗過程遵循3R原則，給予人道主義關(guān)懷。1)診斷標準參考《中國急性早幼粒細胞白血病診療指南(2018年版)》符合白血病診斷標準。2)納入標準：符合診斷標準；SPF級6周SD大鼠雌性大鼠；體質(zhì)量≥300 g。3)排除標準：對川楝子等過敏大鼠；合并有嚴重惡性腫瘤大鼠；合并感染性、血液系統(tǒng)疾病大鼠。4)脫落及剔除標準：中途由于其他因素無法繼續(xù)參與研究；中途意外死亡大鼠。

1.1.2 藥物 川楝子(上海源葉生物科技有限公司，CAS編號：79304-40-8)。

1.1.3 試劑與儀器 乙醇(新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司，國藥準字F20110002)，ECL發(fā)光液(上海士鋒生物科技有限公司，貨號：R-2374-50 mL)，噻唑藍試劑(Thiazole Blue，MTT)(上海譜振生物科技有限公司，CAS編號：298-93-1)；兔抗人單克隆一抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associated X，Bax)(Abcam公司，美國，貨號：ab109536)，兔抗人單克隆一抗P53(Abcam公司，美國，貨號：ab7015)，兔抗人單克隆一抗B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax(Abcam公司，美國，貨號：ab8926)，P53羊抗兔二抗(Abcam公司，美國，貨號：ab9358)，細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B)，RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國，貨號：186025)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜(Millipore公司，美國，貨號：ISEQ00238)，TRIzol、RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司，德國，貨號：74106)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司，貨號：DRR041A)；粉碎機(揚州諾亞機械有限公司，型號：SF50)，圓底燒瓶(泰州市六六順教學設備有限公司，規(guī)格：2 000 mL，型號：GG17)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京金洋萬達科技有限公司，型號：YRE-2000E)，濾過除菌膜(蘇州優(yōu)可發(fā)新材料科技有限公司，型號：YKF10018)，二氧化碳(培養(yǎng)箱(南北儀器有限公司，型號：CHP-80)，Nanodrop 2000儀器(Thermo Fisher公司，美國，型號：NanoDrop 2000C)，PCR儀(ABI公司，美國，型號：ABI7900)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 培養(yǎng)CCRF-CEM至對數(shù)生長期時，將細胞懸液的濃度調(diào)整為1×108/L，并接種到96孔培養(yǎng)板并分為對照組、觀察組，于每孔中加入細胞懸液，容量190 μL，每組取平行孔6個，于飽和溫度培養(yǎng)箱中、持續(xù)培養(yǎng)24 h。在觀察細胞中，分別加入質(zhì)量濃度為16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L的川楝子醇提物10 μL；在對照組中，加三蒸水10 μL，置于與1.2.2條件相同的培養(yǎng)箱中，連續(xù)對其培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。之后，于每個平行孔中加入20 μL的MTT，再放入培養(yǎng)箱中，持續(xù)4 h，之后進行離心處理，1 000 r/min，離心10 min，離心半徑5.5 cm，棄去上清液，加150 μL的二甲基亞砜，以酶標儀測定各孔吸光度值。抑制率為2組吸光度之差與對照組吸光度的比值[7]。

調(diào)整對數(shù)生長期CCRF-CEM細胞濃度為1×108/L，灌入4個培養(yǎng)瓶(1瓶對照組、3瓶觀察組)中，均為9.5 mL，一一標記后將其置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)，共24 h，根據(jù)19:1的藥液比，依次加入低、中、高質(zhì)量濃度的川楝子醇提物，均0.5 mL，以使終質(zhì)量濃度分別為16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L，分別設定為16 mg/L川楝子醇提物組、80 mg/L川楝子醇提物組、400 mg/L川楝子醇提物組。對照組加入等體積三蒸水，對其持續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，收集細胞并進行離心沉淀，之后在沉淀中加裂解液300 μL，進行離心處理，持續(xù)10 min后可得蛋白液。進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，再加入兔抗人單克隆一抗Bax、P53、Bcl-2，于4 ℃環(huán)境下孵育過夜，加山羊抗兔二抗，孵育2 h，加ECL發(fā)光液。分析條帶吸光度值。

1.2.2 給藥方法 取川楝子果實，洗凈、曬干，用粉碎機打成粉末(約為40目)，以56 ℃的溫度將其烘干，置于圓底燒瓶中，加體積分數(shù)為80%的乙醇持續(xù)浸泡24 h，回流提取、過濾，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓、回收溶劑，最終可得浸膏，使用100 mL乙酸乙酯萃取3次，以同樣方法回收乙酸乙酯萃取劑，真空干燥，得棕褐色固體川楝子醇提物，置于4 ℃的冰箱中保存。取1.02 g川楝素、與6 mL三蒸水溶解，經(jīng)0.22 μm濾過除菌膜進行過濾，得170 g/L的川楝子醇提物母液，置于4 ℃的冰箱中保存，以待使用。

于體積分數(shù)為10%的新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中、接種CCRF-CEM懸液，將細胞濃度調(diào)整為1×108/L，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(溫度：37 ℃、體積分數(shù)：5%)培養(yǎng)，每3天對培養(yǎng)基進行1次更換，待細胞生長良好、處于對數(shù)生長期時行后續(xù)實驗。

1.2.3 檢測指標與方法 分析川楝子醇提物對CCRF-CEM的抑制作用，對CCRF-CEM凋亡的影響(川楝子醇提物作用CCRF-CEM 24 h、48 h后Bax、P53、Bcl-2基因表達)。使用TRIZOL試劑從1.2.1中的CCRF-CEM中提取總RNA，并使用Nanodrop 2000進行定量。使用RNeasy Mini試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Premix Ex TaqTM進行RT-qPCR：95 ℃下持續(xù)2 min，58 ℃下維持20 s，然后在72 ℃下反應20 s(該步驟40個循環(huán))，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計算Bax、P53、Bcl-2的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 川楝子醇提物對CCRF-CEM細胞生長的影響 16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用CCRF-CEM的不同時間具有明顯的抗增殖作用。相較于對照組，于同一時間點，不同質(zhì)量川楝子醇提物的吸光度值明顯不同，且隨著質(zhì)量的增加，吸光度值逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 川楝子醇提物對CCRF-CEM生長的影響

2.2 川楝子醇提物對外周血淋巴細胞生長的影響 與對照組比較，16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用外周血淋巴細胞同一時間段的給藥吸光度值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示不同質(zhì)量濃度對外周血淋巴細胞無明顯的不良反應。見表2。

表2 川楝子醇提物對外周血淋巴細胞生長的影響

2.3 川楝子醇提物對CCRF-CEM凋亡的影響 于同一時間點，與對照組比較，不同質(zhì)量濃度川楝子醇提物的Bax、P53、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因表達明顯不同(P<0.05)；Bax隨質(zhì)量濃度的增加而增加，Bcl-2基因表達隨質(zhì)量濃度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表達達到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表達呈上升趨勢(P<0.05)。見表3。

表3 分析川楝子醇提物對CCRF-CEM凋亡的影響

2.4 細胞形態(tài)學變化情況 倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對照組患者的CCRF-CEM分布密度較高，大小一致，多有凸起。見圖1A、圖1B。加藥24 h之后，隨著川楝子濃度的增加，細胞出現(xiàn)了不同程度的體積減小、生成密度降低、折光性變差等情況。見圖1C、圖1D。加藥48 h后，生長密度顯著降低，細胞逐漸出現(xiàn)碎片。見圖1E、圖1F。

使用Giemsa染色，油鏡下觀察不同濃度川楝子醇提物作用于CCRF-CEM結(jié)構(gòu)變化。對照組細胞可見大而圓的細胞核，胞漿甚少，細胞膜完整；加藥24 h后，隨著川楝子醇提物作用濃度的不斷增加，作用時間延長至48 h，出現(xiàn)不同程度的細胞膜皺縮破損、染色質(zhì)凝聚成塊、核膜破裂。見圖1G、圖1H。

圖1 不同組別細胞的形態(tài)學變化情況

3 討論

白血病為一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病，白血病細胞大量增殖積累，抑制正常造血，并浸潤其他器官組織，患者多見貧血、出血、感染、骨骼疼痛等癥狀，部分患者經(jīng)積極有效的治療后可緩解癥狀，延長生存時間，但若病情進展迅速，極易導致死亡[8-9]?；瘜W療法與造血干細胞移植等方法可在一定程度上緩解患者癥狀，改善病情，但化學療法無法徹底殺滅癌細胞，易擴散，且不良反應多，異體移植排斥風險較高，治療后復發(fā)率較高，對患者帶來極大痛苦[10-11]。

在中醫(yī)學中并無“白血病”稱謂，依據(jù)患者臨床表現(xiàn)、發(fā)病特點，可歸為“虛勞”“熱勞”“瘀積”“濕病”等范疇[12-13]?！妒備洝吩唬骸盁釀谥C”，面赤、頭痛、唇焦、食欲無味，多臥少起，日漸羸瘦者?！鹅`樞》中記載“人之善病腸中積聚者……皮膚薄而不澤”。中醫(yī)治療此病多在扶正固本的治則下徹底消除病灶，清熱解毒，提高患者的抗癌能力，以起標本兼治的治療效果。《中華人民共和國藥典》中收錄的有毒藥物中，抗白血病藥物10余種，有毒中藥川楝子屬于一種植物類，因其味苦，性寒，可歸為理氣類藥物[14-15]。相關(guān)報道顯示，川楝子的主要成分川楝素，對于胃癌SGC-7901細胞的生長可產(chǎn)生明顯的抑制作用，可見明顯的細胞凋亡特征，且作用機制極可能為通過線粒體介導誘導細胞凋亡[16-17]。

本研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量川楝子醇提物的吸光度值明顯不同，且隨著質(zhì)量的增加吸光度值逐漸降低。提示川楝子提取物作用CCRF-CEM具有明顯的抗增殖作用，且隨著川楝子質(zhì)量濃度的不斷增加，其對CCRF-CEM的生長抑制效果越強，川楝子提取物對于CCRF-CEM的生長抑制作用，與其濃度、作用時間均呈正向關(guān)系[18-19]。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度川楝子提取物的Bax、P53、Bcl-2基因表達明顯不同；Bax表達隨質(zhì)量濃度的增加而增加，Bcl-2表達隨質(zhì)量濃度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表達達到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表達呈上升趨勢。觀察細胞形態(tài)學變化情況發(fā)現(xiàn)，加藥24 h之后，隨著川楝子濃度的不斷增加，細胞出現(xiàn)了不同程度的體積減小、生成密度降低、折光性變差等情況；加藥24 h后，隨著川楝子醇提物作用濃度的不斷增加，作用時間延長至48 h，出現(xiàn)不同程度的細胞膜皺縮破損、染色質(zhì)凝聚成塊、核膜破裂。分析原因：惡性腫瘤細胞肆意生長主要與存在凋亡逃逸現(xiàn)象有關(guān)，若阻斷此現(xiàn)象，需從細胞凋亡途徑著手，而細胞凋亡主要包括內(nèi)源性、外源性通路，二者間相互影響，但前者更重要[20-21]。內(nèi)源性途徑中Bax、Bcl-2等促凋亡因子具有十分重要的作用，Bax/Bcl-2比值下降時，一系列變化可形成“凋亡體”，從而可促使細胞凋亡。

綜上所述，川楝子醇提物可有效抑制CCRF-CEM增殖，且可通過誘導線粒體介導的細胞凋亡實現(xiàn)濃度、時間依賴性，臨床應用價值顯著，值得推廣。