DPPs類有機磷農(nóng)藥寬譜酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立

呂麗蘭，張 婭，陸覃昱，鄒承武，甘志勇 ，李冬桂 ，吳靜娜，王藝霖，李鑫生，何麗珊

(1.廣西亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(南寧)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，南寧 530001；2.廣西大學農(nóng)學院/廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，南寧 530004)

【研究意義】具有廣譜、高效特性的有機磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中已廣泛應(yīng)用于抑制微生物、昆蟲和雜草生長[1]。然而，有機磷農(nóng)藥作為傳統(tǒng)的中高毒農(nóng)藥，不僅具有一般毒性，可能對人體的遺傳、神經(jīng)及生殖發(fā)育也存在毒性[2-3]，還會對土壤和水體環(huán)境產(chǎn)生不良影響[4-5]。已有研究表明，果蔬樣品中均可檢出有機磷殘留，且部分樣品存在殘留超標情況[6-7]。間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法(ic-ELISA)是一種靈敏度高、方便快捷、成本低廉及可批量分析樣本的檢測方法，已應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留、病原微生物、生物毒素、轉(zhuǎn)基因食品、重金屬殘留、過敏性殘留物及違規(guī)添加成分等的檢測，但目前仍未廣泛應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥檢測。因此，通過DPPs的共性結(jié)構(gòu)設(shè)計合成通用半抗原以制備廣譜性更強的抗DPPs單克隆抗體，篩選符合檢測要求的抗體識別對象并建立其ic-ELISA，對開展大規(guī)模農(nóng)產(chǎn)品有機磷農(nóng)藥殘留監(jiān)測及保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費者健康具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】曾劍鋒[8]研究認為，開發(fā)基于廣譜性單克隆抗體的ic-ELISA，對有機磷農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)的推進具有市場應(yīng)用價值。目前，有機磷類農(nóng)藥殘留的檢測方法主要包括色譜法[9-10]、酶抑制法[11-13]和酶聯(lián)免疫法[14-15]。色譜法雖然技術(shù)相對成熟，但因開展檢測工作所需設(shè)備昂貴，操作過程繁瑣且耗時長，無法適應(yīng)大規(guī)?？焖俸Y查及滿足基層單位應(yīng)用的需求。酶抑制法雖然在高通量篩查過程中具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，但酶試劑穩(wěn)定性較差，其分析結(jié)果易產(chǎn)生較大不確定性且重復性也較差[16]。傳統(tǒng)單克隆抗體窄譜識別造成方法漏檢的可能性極大增加，已無法適應(yīng)目前農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管需要。多殘留檢測主要依賴氣相質(zhì)譜法(GC)[17]和液相質(zhì)譜法(LC)[18]，這2種方法對設(shè)備性能及檢測人員的技能要求較高，不方便基層開展農(nóng)藥殘留監(jiān)測。因此，開發(fā)寬譜農(nóng)殘檢測抗體，適應(yīng)基層農(nóng)藥普篩需求，是ELISA農(nóng)殘檢測的重要研究方向。復合免疫法、雙特異性抗體法和通用半抗原法等被認為是主流的多殘留免疫分析方法[19]，其中通用半抗原法是最常用的方法[20]。劉運清等[21]針對甲基對硫磷、殺螟硫磷和倍硫磷開發(fā)了ic-ELISA，最低檢出限分別達0.94、1.07和2.79 mg/L。李永祥等[22]制備4種寬譜特異性抗體，可實現(xiàn)對異氯磷、殺螟腈和倍硫磷等8種高毒農(nóng)藥的多殘留分析，檢出限達2.60 μg/kg，符合相關(guān)限量標準要求。但值得注意的是，多數(shù)寬譜抗體所覆蓋的農(nóng)藥中，日常監(jiān)測中出現(xiàn)的農(nóng)藥覆蓋度不高。有機磷類農(nóng)藥以DPPs為主，選擇其藥效官能團硫代磷酸二乙酯為抗原決定簇可制備檢測靈敏度更高及廣譜性更強的單克隆抗體[23]?！颈狙芯壳腥朦c】至今，針對有機磷農(nóng)藥分析抗體選擇有限及應(yīng)用范圍較少現(xiàn)狀的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過DPPs的共性結(jié)構(gòu)設(shè)計合成通用半抗原以制備廣譜性更強的抗DPPs單克隆抗體，同時篩選符合檢測要求的抗體識別對象并建立其ic-ELISA，為開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)中有機磷農(nóng)藥殘留快檢技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年2—8月在廣西大學廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室進行。試驗用小鼠(6～7周齡，Balb/c雌性)購自廣州動物實驗中心，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室保存提供；添加回收試驗使用的柑橘和鮮橙購自廣西南寧市海吉星農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場。有機磷農(nóng)藥標準品(對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷和倍硫磷)購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；免疫及細胞培養(yǎng)用相關(guān)生化試劑購自美國Sigma公司；相關(guān)酶標二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備：分光光度計(UV-1800，日本島津)、倒置顯微鏡(Moshot MSX2，廣州明美)、酶標儀(Infinite M200，瑞士TECAN)、CO2培養(yǎng)箱(Herocell 180，美國賽默飛)、氣相色譜儀(6890N-FPD，美國安捷倫)。

表1 小鼠免疫方案

1.2 半抗原設(shè)計、合成及單克隆抗體制備

參照Xu等[24]的方法合成和鑒定半抗原和完全抗原。合成的半抗原4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸結(jié)構(gòu)式如圖1-A所示。采用活潑酯法[25]制備免疫抗原(DPPs-BSA，抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián))和包被抗原(DPPs-OVA，抗原與卵清蛋白肽OVA偶聯(lián))。完全抗原的合成結(jié)構(gòu)如圖1-B所示，對目標產(chǎn)物進行紫外吸收光譜掃描鑒定。

1.3 小鼠免疫及其血清評價

將免疫原稀釋至1.0 mg/mL(0.01 mol/L PBS)，免疫時間、劑量及注射部位見表1。將完全弗氏佐劑與免疫原等體積混合后充分乳化，選取5只小鼠進行初免；三免后第7天，眼周采血，離心分離血清，ic-ELISA檢測血清效價，選取效價最高的小鼠為融合小鼠；融合前4 d進行加強免疫。

雜交瘤細胞制備及篩選：采用PEG-2000(50%)對小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞(細胞數(shù)目比約10∶1) 進行融合。培養(yǎng)9～11 d后，采用ic-ELISA對陽性融合細胞株進行篩選，再采用ic-ELISA對陽性細胞株識別有機磷農(nóng)藥標準物(對硫磷)的能力進行評估。其中，抑制孔中對硫磷濃度為500.00 ng/mL。采用有限稀釋法制備穩(wěn)定分泌特異性抗體的細胞株。

抗體制備：選取5只小鼠，注射無菌石蠟油7 d后，將上述試驗中篩選出的細胞株注射入其腹腔，制備腹水。約1周后，當小鼠腹腔部位明顯膨大時可收集腹水，間隔3～4 d抽取第二次，重復3～4次。抽取的腹水靜置4 h，離心取上清，飽和硫酸銨法[26]純化，去離子水透析，冷凍干燥，即制得純化單克隆抗體。

A：半抗原；B：完全抗原A：Hapten；B：Complete antigen圖1 合成的半抗原和完全抗原結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of synthesized hapten and complete antigen

1.4 ic-ELISA開發(fā)

1.4.1 抗原與抗體最佳工作濃度組合篩選 采用ic-ELISA棋盤格試驗，即在492 nm下測定吸光值(OD492nm)，篩選零孔的OD492nm在1.00以上、抑制孔的抑制率高于90%時包被抗原與抗體的工作濃度組合。

1.4.2 標準曲線的建立 采用ic-ELISA分析不同對硫磷濃度下抗原與抗體的結(jié)合率(B/B0)，并建立對應(yīng)的標準曲線。

1.4.3 ic-ELISA特異性分析 在相同工作條件下，建立蠅毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷和倍硫磷的標準曲線，并計算交叉反應(yīng)率，用于評估所制得單克隆抗體對有機磷農(nóng)藥的識別廣譜性。

交叉反應(yīng)率(%)= IC50(對硫磷)/IC50(有機磷農(nóng)藥)×100

1.4.4 ic-ELISA準確性評估 為考察不同濃度基質(zhì)對ic-ELISA準確性的影響，取空白水果樣品，參考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》的方法進行前處理。提取樣品基質(zhì)后氮氣吹干，用PBS將其稀釋1、5、10和20倍，并用不同濃度基質(zhì)將喹硫磷標準品分別稀釋為4個標準濃度(0.05、0.10、0.20和0.40 μg/mL)后進行添加回收試驗。篩選對ic-ELISA性能影響最小的稀釋倍數(shù)，在柑橘和鮮橙樣品中進行驗證，同時采用NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》中的GC進行平行測定。

圖2 人工抗原DPPs-BSA(A)和DPPs-OVA(B)的紫外吸收圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of artificial antigens DPPs-BSA(A) and DPPs-OVA(B)

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行方差分析和多重比較。標準曲線擬合及IC20、IC50和IC80等參數(shù)采用GraphPad Prism 7進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

從圖2可看出，合成半抗原Hapten-DPPs、BSA和OVA的最大吸收峰分別在272、285和287 nm處，與免疫抗原DPPs-BSA和包被抗原DPPs-OVA存在明顯差異，且與各自的載體蛋白相比，在272～287 nm區(qū)間范圍的吸收峰明顯不同，說明抗原偶聯(lián)成功。

2.2 融合小鼠的篩選結(jié)果

由表2可知，在融合試驗前4 d，綜合考慮最佳稀釋倍數(shù)需對照孔的OD492nm較高，且同時抑制孔有較高的抑制率，包被抗原DPPs-OVA(1.0 mg/mL)稀釋500倍、血清稀釋4000倍時為建立標準曲線的最佳抗原抗體工作濃度組合。以500倍稀釋抗原和4000倍稀釋血清為條件開展下一步試驗。

2.3 單克隆抗體的制備結(jié)果

細胞融合后，采用ic-ELISA對陽性細胞孔和抗性細胞孔進行篩選。有4個雜交瘤細胞融合孔表現(xiàn)出較強的陽性及對對硫磷的抗性(表3)，采用有限稀釋法對多次克隆進行篩選，以抑制率為篩選標準，選取效價較高的雜交瘤細胞株系，經(jīng)多次篩選，獲得4株效價較高、特異性較強的單克隆雜交瘤細胞株，其抑制率分布在59%～93%，其中特異性最強的細胞株為5G8，將其擴大培養(yǎng)后用腹水法制備抗體。

表2 對硫磷對融合小鼠抗血清抑制反應(yīng)的檢測結(jié)果

表3 篩選所獲雜交瘤細胞株的陽性及抑制效率檢測結(jié)果

2.4 抗原和抗體工作濃度的優(yōu)化結(jié)果

包被抗原與抗體的配合效果會對ic-ELISA的靈敏度產(chǎn)生影響，故需對其配合的工作濃度進行優(yōu)化。由表4可知，抑制率隨著包被抗原與抗體稀釋倍數(shù)提高表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢。當包被抗原DPPs-OVA以1∶2000(0.5 μg/mL)、抗體以1∶1000稀釋(1.0 μg/mL)時，達到峰值對照孔的吸光值OD492nm≥1.00，且抑制孔的抑制率≥90.00%，故以0.5 μg/mL包被抗原與1.0 μg/mL抗體濃度組合建立標準曲線。

2.5 對硫磷ic-ELSA標準曲線的建立

從擬合得到的標準曲線(圖3)可看出，細胞株5G8所分泌抗體(單克隆抗體5G82D5)的IC50為41.78 ng/mL，ic-ELISA檢測范圍(IC20～IC80)位于3.21～239.59 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9999。說明該抗體可在一定范圍內(nèi)與有機磷農(nóng)藥分子特異性結(jié)合，且具有較寬的線性范圍，可用于ic-ELISA開發(fā)。

2.6 抗體的廣譜性分析結(jié)果

選取6種有機磷類化合物標準物(對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷和倍硫磷)，評價所構(gòu)建的ic-ELISA對有機磷農(nóng)藥識別的廣譜性。由表5可知，單克隆抗體5G82D5與有機磷農(nóng)藥均存在不同程度的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率為0.70%～19.79%，其中，與喹硫磷的交叉反應(yīng)率最強，IC50僅為221.12 ng/mL，而與倍硫磷和甲拌磷的交叉反應(yīng)率較弱，IC50分別為5953.06和4913.91 ng/mL，說明該單克隆抗體可用多種有機磷農(nóng)藥廣譜篩選的ic-ELISA開發(fā)。根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定可知，該抗體對喹硫磷的檢測范圍可滿足水果(柑橘類)中喹硫磷的最大殘留限量要求，因此后續(xù)開展該抗體應(yīng)用于喹硫磷的ic-ELISA開發(fā)研究。

圖3 ic-ELISA檢測對硫磷的標準曲線Fig.3 Standard inhibition curve of parathion in ic-ELISA detection

2.7 喹硫磷添加回收試驗結(jié)果

由表6可知，以柑橘為基質(zhì)，在5×稀釋倍數(shù)下的喹硫磷添加回收率為100.18%～116.08%，以鮮橙為基質(zhì)時，在5×稀釋倍數(shù)下的喹硫磷添加回收率為71.38%～88.84%，二者的喹硫磷添加回收率誤差均小于20.00%，而在10×和16×稀釋倍數(shù)下的喹硫磷添加回收率誤差均大于20.00%。可見，在不同基質(zhì)背景下，將基質(zhì)緩沖液的目標稀釋倍數(shù)設(shè)定為5×為最佳稀釋倍數(shù)。

ic-ELISA與GC 2種方法交叉驗證結(jié)果(表7)表明，柑橘中ic-ELISA的加標回收率為102.35%～107.53%，GC的加標回收率為93.30%～93.90%；鮮橙中ic-ELISA的加標回收率為94.09%～97.30%，GC的加標回收率為100.80%～101.10%?？梢姡?種方法檢測結(jié)果的一致性較好，說明建立的喹硫磷ic-ELISA準確度較高。

表4 抗原和抗體最佳工作濃度篩選結(jié)果

表5 單克隆抗體5G82D5交叉反應(yīng)評價結(jié)果

表6 柑橘和鮮橙樣品的喹硫磷添加回收試驗結(jié)果

3 討 論

目前，關(guān)于農(nóng)藥多殘留免疫檢測方法的建立已有較多報道。Jang等[27]建立識別4種有機磷農(nóng)藥的ELISA方法，其IC50介于100.00～300.00 ng/mL。Liu等[28]開發(fā)的抗體可對6種有機磷農(nóng)藥進行ELISA檢定，但靈敏度較低。Piao等[29]建立可監(jiān)測12種農(nóng)藥的ELISA，其IC50最低為2.00 ng/mL，已具備較好的檢測廣譜性和靈敏度。Wang等[30]開發(fā)4種有機磷農(nóng)藥的ELISA，其IC50最低為20.32 ng/mL。針對相關(guān)抗體的應(yīng)用研究也有報道，如Jiang等[31]基于ELISA結(jié)合磁珠技術(shù)實現(xiàn)對敵百蟲、草甘膦和馬拉松3種有機磷農(nóng)藥多殘留的快速檢測，檢測限分別達72.20、88.80和195.37 ng/mL。

現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留監(jiān)測結(jié)果表明，蔬菜的有機磷農(nóng)藥殘留已向多殘留發(fā)展[32-33]。本研究通過合成半抗原4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸，將其與載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合及系列篩選過程獲得能識別DPPs藥效官能團硫代磷酸二乙酯的寬譜型抗體，建立對DPPs的多殘留免疫分析方法，通過分析對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷和倍硫磷6種DPPs的交叉反應(yīng)情況，評價抗體5G82D5的寬譜性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗體具備對6種有機磷農(nóng)藥的初篩能力，其中，蠅毒磷、喹硫磷和倍硫磷未出現(xiàn)在現(xiàn)行國標快速檢測方法GB/T 18630—2002《蔬菜中有機磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗方法酶抑制法》和GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》可檢指標中，但對對硫磷的定量監(jiān)測能力遠優(yōu)于國標法的檢出能力；抗體對對硫磷和喹硫磷具有較強的識別效率，其IC50分別為41.78和211.12 ng/mL，依據(jù)國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)，本研究建立的ic-ELISA基本能滿足該2種DPPs農(nóng)藥在果蔬中的檢測要求，可用于對硫磷和喹硫磷快速篩查技術(shù)開發(fā)及相關(guān)定性分析技術(shù)研究。

表7 ic-ELISA和GC法添加回收試驗結(jié)果

對硫磷和喹硫磷的結(jié)構(gòu)均與免疫原相似，可能更有利于分子間作用力及抗體識別區(qū)結(jié)合界面形成，因此具有較高的識別效率[34]。在本研究的6種DPPs中，抗體對甲基對硫磷的識別效率最低，IC50為5953.06 ng/mL，推測芳香環(huán)在抗體與農(nóng)藥的識別過程中發(fā)揮了重要作用[34]。采用4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸[4-(diethoxyphosphorothioyloxy) benzoic acid]可構(gòu)建對硫磷高特異性抗原，本研究在此基礎(chǔ)上，于苯環(huán)與其他官能團連接處增加一個二酯鍵結(jié)構(gòu)，提高了所構(gòu)建抗體的廣譜識別率，但其中的作用機制仍需進一步探究。周麗君等[35]研究指出，在檢測靈敏度方面，基于單鏈抗體scFv的ELISA對所有DPPs的IC50均低于基于單克隆抗體的ELISA結(jié)果，說明與親本單克隆抗體相比，所獲得的scFv對二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農(nóng)藥檢測的靈敏度整體上會有所改善。因此，開發(fā)5G82D5抗體的scFv抗體，可進一步提高其對對硫磷和喹硫磷的識別篩選能力。

4 結(jié) 論

利用半抗原4-(二乙氧基硫代磷酰氧基)-肉桂酸偶聯(lián)載體蛋白合成完全抗原制備對6種DPPs具備不同識別效率的寬譜型小鼠單克隆抗體5G82D5，并建立喹硫磷ic-ELISA檢測方法，經(jīng)GC法交叉驗證準確性較高，可作為快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中喹硫磷殘留新的有效手段。