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    氨基寡糖素對苦瓜枯萎病的抗性誘導(dǎo)作用

    2022-02-08 12:09:10黃熊娟黃如葵馮誠誠琚茜茜梁家作陳振東黃玉輝陳小鳳劉杏連
    關(guān)鍵詞:灌根寡糖枯萎病

    黃熊娟,黃如葵,馮誠誠,琚茜茜,秦 健,梁家作,陳振東,黃玉輝,陳小鳳,劉杏連

    (廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007)

    【研究意義】苦瓜是我國重要的特色瓜類蔬菜,在其產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí),連作障礙問題也日益突出。其中,苦瓜枯萎病發(fā)病率已呈直線上升趨勢,且重病區(qū)的發(fā)病率在85%以上,經(jīng)濟(jì)損失慘重。此外,苦瓜科研中的種質(zhì)資源和中間材料因枯萎病而大量死亡,對苦瓜種質(zhì)資源保存、創(chuàng)新及新品種選育也造成嚴(yán)重影響。目前,對枯萎病的防御策略主要是從耕作制度和種植方式優(yōu)化、抗病品種和嫁接砧木篩選利用、土壤消毒和土壤管理、栽培管理及化學(xué)防治和生物防治等角度著手。誘導(dǎo)抗病技術(shù)是一種安全有效的植物病害防治技術(shù),可通過誘抗劑刺激植物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生廣譜、持久的抗病性能,其中的氨基寡糖素(一種植物免疫誘抗劑類新型生物農(nóng)藥[1])對各種果樹、蔬菜和作物的真菌、細(xì)菌和病毒均具有一定的防治效果[2-5],但其對苦瓜枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果尚不清楚。因此,探究氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜幼苗抗枯萎病發(fā)生的方式及誘導(dǎo)抗病性對苦瓜組織結(jié)構(gòu)、次生代謝物質(zhì)和病程相關(guān)蛋白活性變化情況的影響,對完善氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜抗枯萎病技術(shù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】與傳統(tǒng)殺菌劑相比,植物誘抗劑具有微量、廣譜、持效期長、不易產(chǎn)生抗藥性及對環(huán)境友好等特點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn),寡糖、聚糖類和苯并噻二唑類等有機(jī)化合物類誘抗劑對多種真菌病害的抗性誘導(dǎo)具有較好效果[6-9]。在土傳病害抗性誘導(dǎo)中,莊敬華等[10]研究認(rèn)為,0.1和0.5 mol/L水楊酸及4.0 mol/L草酸處理土壤對甜瓜枯萎病的誘抗有效;石延霞等[11-12]利用氟唑活化酯胚根浸種結(jié)合葉面噴霧、吡唑并嘧啶衍生物葉面噴施誘導(dǎo)黃瓜抗枯萎病,均獲得較好的誘導(dǎo)抗病效果;袁新琳等[13]研究認(rèn)為,氨基寡糖素可有效誘導(dǎo)棉花抗枯萎病和黃萎病。植物次生代謝產(chǎn)物主要包括木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和酚類化合物等,而病原物侵襲可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量可溶性酚類物質(zhì),抑制病原物遷移和擴(kuò)增[14],細(xì)胞壁上的大量酚類物質(zhì)也與植物的抗病性密切相關(guān)[15],在病原菌侵染產(chǎn)生過敏性反應(yīng)過程中,植物細(xì)胞中的木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和酚類物質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)及植物組織木質(zhì)化程度均有所增強(qiáng),能阻止病原菌從植物細(xì)胞汲取營養(yǎng)和水分,抵御病原菌侵染[16]。已有研究表明,在寄主植物和病原物抗病反應(yīng)及親和性互作的感病反應(yīng)中,過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等植物體內(nèi)較重要的保護(hù)酶和防御酶與植物抗性密切相關(guān)[16-18]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今,關(guān)于氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜枯萎病抗性的研究未見報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以不同濃度誘抗劑氨基寡糖素對苦瓜幼苗進(jìn)行噴霧和灌根處理,誘導(dǎo)苦瓜對外來病原菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)從而獲得對枯萎病的抗性,實(shí)現(xiàn)抵御枯萎病能力的提升,為完善氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜抗枯萎病技術(shù)及促進(jìn)苦瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)于2018年7—10月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所院科研基地進(jìn)行。供試誘抗劑為5%氨基寡糖素(海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司,水劑),對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖(成都特普科技發(fā)展有限公司,水劑)和6%低聚糖素(海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司,水劑);供試苦瓜品種桂農(nóng)科三號(hào)由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育提供;供試病原菌尖孢鐮刀菌苦瓜?;?Fusariumoxysporumf. sp.Momordicae,F(xiàn)OM)由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所保存提供。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 誘導(dǎo)方式 葉面噴霧誘導(dǎo):配制5%氨基寡糖素1500倍液(Y-3處理),于苦瓜2葉1心期首次噴施,每隔3 d噴施1次,共噴3次,3次重復(fù),每重復(fù)40株;對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖300倍液(Y-1處理)和6.0%低聚糖素800倍液(Y-2處理),以噴霧清水為空白對照(CK1)。使用微量噴霧系統(tǒng)將藥液均勻噴施于苦瓜葉面,噴霧量為200 μL/株。誘導(dǎo)24 h后用1×106個(gè)/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調(diào)查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

    灌根誘導(dǎo):配制5%氨基寡糖素1000倍液(G-3處理),于苦瓜2葉1心期首次灌根,每株灌根50 mL,每隔3 d灌根1次,共灌3次,3次重復(fù),每重復(fù)40株;對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖100倍液(G-1處理)和6%低聚糖素600倍液(G-2處理),以清水灌根為空白對照(CK2)。誘導(dǎo)24 h后用1×106個(gè)/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調(diào)查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

    1.2.2 最佳誘導(dǎo)濃度篩選 采用灌根誘導(dǎo)方式,設(shè)5%氨基寡糖素800倍液(NG1-1)、1000倍液(NG1-2)和1500倍液(NG1-3)3個(gè)濃度處理,以清水灌根為對照(NG1-CK),3次重復(fù),每重復(fù)40株,篩選5%氨基寡糖素灌根的最佳濃度,并以此濃度開展1.2.4和1.2.5試驗(yàn)。

    1.2.3 枯萎病病情分級(jí)及誘抗效果評價(jià) 參考陳振東等[19]的方法進(jìn)行苦瓜枯萎病病情分級(jí)。無病癥為0級(jí);子葉發(fā)黃為1級(jí),子葉變黃且邊緣皺縮,但真葉正常為3級(jí);子葉皺縮枯死、部分真葉發(fā)黃為5級(jí);真葉發(fā)黃、部分葉片黃化或停止生長為7級(jí);全株葉片黃化萎蔫或枯死為9級(jí)。病情指數(shù)(DI)為0表示免疫,0.01≤病情指數(shù)<15.00表示高抗(HR),15.00≤病情指數(shù)<35.00表示抗病(R),35.00≤病情指數(shù)<55.00表示中抗(MR),55.00≤病情指數(shù)<75.00表示感病(S),75.00≤病情指數(shù)<100.00表示高感(HS)。誘導(dǎo)抗病指數(shù)越高,表示誘導(dǎo)效果越好。

    病情指數(shù)=∑(病株數(shù)×該級(jí)代表值)/(總株數(shù)×最高級(jí)代表值)×100

    誘導(dǎo)抗病指數(shù)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

    1.2.4 氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜病程相關(guān)蛋白酶活性的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液對苦瓜幼苗進(jìn)行灌根誘導(dǎo)(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法),分別設(shè)誘導(dǎo)不接種(T1)、誘導(dǎo)后接種(T2)、未誘導(dǎo)只接種(T3)和未誘導(dǎo)未接種(T4)4個(gè)處理,每處理50株。各處理苦瓜幼苗分別于誘導(dǎo)接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜根部,參考蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PAL試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GLU)試劑盒、POD試劑盒和PPO試劑盒說明分別進(jìn)行PAL、β-1,3-GA、POD和PPO活性測定。

    1.2.5 氨基寡糖素誘導(dǎo)對枯萎病菌侵染苦瓜的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液(JG1)進(jìn)行灌根誘導(dǎo)(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法),設(shè)未誘導(dǎo)只接種為對照(JG-CK)。接種后0、2、4、6、8、10、14、18、22和26 d分別取苦瓜根組織備用。每處理50株,對照50株。采用酸性品紅染色法對苦瓜根系進(jìn)行處理,處理后取出放入培養(yǎng)皿中,用不加酸性復(fù)紅的乳酸液脫色30 min,置于TO型生物制片透明劑中透明2 min,在Olympus BX51顯微鏡下觀察菌絲侵染情況[20]。

    1.2.6 氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜次生代謝物質(zhì)的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液進(jìn)行灌根誘導(dǎo)處理(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法),觀察苦瓜根、莖、葉的木質(zhì)素、酚類化合物和胼胝質(zhì)變化情況。分別設(shè)誘導(dǎo)不接種(J1)、誘導(dǎo)后接種(J2)、未誘導(dǎo)只接種(J3)和未誘導(dǎo)未接種(J4)4個(gè)處理,每處理50株。分別于接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜+1葉和+2葉(中部葉片)、根(距土表0.5 cm處)和莖(距土表0.5 cm處),將根莖處理成厚1.0 mm的薄片(橫切面),葉片處理成4.0 mm葉盤,放入冰醋酸和95%酒精混合液(1∶1)中,固定24 h后置于飽和水合氯醛水溶液中,抽氣去氣泡靜置60 d,待植物組織透明后浸泡于無水乙醇中48 h,用蒸餾水清洗3次后備用。

    采用Maule反應(yīng)方法測定誘導(dǎo)后苦瓜木質(zhì)素的沉積量,將透明過的根、莖、葉組織塊浸于1%(W/V)KMnO4溶液中15 min,水沖洗2次,再浸于2%(W/V)HCl中5 min,水沖洗后用4.0 mol/L NH4Cl溶液制片,在Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況。

    采用甲苯胺藍(lán)染色法測定誘導(dǎo)后苦瓜的酚類化合物含量,將透明過的根、莖、葉組織塊浸于 0.05%甲苯胺藍(lán)(溶于 0.05 mol/L檸檬酸緩沖液,pH 3.0)中 10 min,在相同溶液中制片,在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況,并測定各組織的熒光平均強(qiáng)度。

    采用苯胺藍(lán)染色法測定誘導(dǎo)后苦瓜的胼胝質(zhì)含量,在透明過的根、莖、葉組織塊上滴 5~10 滴 0.5%(W/V)苯胺藍(lán)(溶于50%乙醇中)染色 4~8 h,50%乙醇(新配制)中沖洗制片,在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況,并測定各組織的熒光平均強(qiáng)度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007、DPSV 15.10和網(wǎng)頁版ImageJ.JS(https://cnij.imjoy.io/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 5%氨基寡糖素葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病抗性的影響

    由表1可知,苦瓜幼苗葉面噴霧Y-1、Y-2和Y-3誘導(dǎo)接種15 d后,其枯萎病病株率分別為82.35%、94.44%和52.63%,其中,Y-1和Y-3處理分別較CK1降低5.15%和34.87%(絕對值,下同),Y-2處理較CK1提高6.94%;Y-1、Y-2和Y-3處理的苦瓜病情指數(shù)分別為54.90、62.34和30.83,其中,Y-1和Y-2處理的病情指數(shù)分別較CK1提高0.73和8.17,Y-3處理的病情指數(shù)較CK1降低23.34;Y-1、Y-2和Y-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為-1.34、-15.08和43.09,其中,Y-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)極顯著高于Y-1和Y-2處理(P<0.01,下同),Y-1處理與Y-2處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)差異不顯著(P>0.05,下同)。說明5%氨基寡糖素1500倍液噴霧對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于噴施0.5%幾丁聚糖300倍液和6.0%低聚糖素800倍液。

    表1 誘導(dǎo)劑葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果

    從表1可看出,苦瓜幼苗灌根G-1、G-2和G-3誘導(dǎo)接種15 d后,其枯萎病病株率分別為93.75%、91.67%和50.00%,分別較CK2降低6.25%、8.33%和50.00%;G-1、G-2和G-3處理的病情指數(shù)分別為75.69、87.96和25.00,其中,G-1和G-3處理分別較CK2降低8.75和59.44,G-2處理較CK2提高3.52;G-1、G-2和G-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為10.36、-4.16和70.39,其中,G-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)極顯著高于G-1和G-2處理,G-1處理顯著高于G-2處理(P<0.05,下同)。說明5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)效果優(yōu)于0.5%幾丁聚糖100倍液和6.0%低聚糖素600倍液灌根。

    2種枯萎病抗性誘導(dǎo)方式的最佳誘導(dǎo)效果比較結(jié)果表明,5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)抗病指數(shù)(70.39)較5%氨基寡糖素1500倍液噴霧的誘導(dǎo)抗病指數(shù)(40.09)高27.30。因此,下一步以氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)方式開展誘導(dǎo)濃度篩選試驗(yàn)。

    2.2 5%氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)苦瓜幼苗枯萎病抗性的濃度篩選結(jié)果

    前期試驗(yàn)結(jié)果表明,以5%氨基寡糖素進(jìn)行灌根較葉面噴霧更適合苦瓜苗期枯萎病抗性誘導(dǎo),因此,進(jìn)一步開展氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)濃度篩選試驗(yàn)。由表2可知,苦瓜幼苗灌根NG1-1、NG1-2和NG1-3誘導(dǎo)接種15 d后,其枯萎病病株率分別為50.00%、37.50%和50.00%,分別較NG1-CK降低50.00%、62.50%和50.00%;病情指數(shù)分別為27.22、19.44和26.11,分別較NG1-CK降低64.59、72.37和65.70;誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為70.35、73.24和71.56,其中,NG1-2處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)最高,但三者間無顯著差異。說明5%氨基寡糖素800倍液、1000倍液和1500倍液灌根對苦瓜枯萎病均具有較好的誘抗效果,且抗性均達(dá)抗病(R)水平,其中1000倍液的誘導(dǎo)抗病效果最佳。因此,以5%氨基寡糖素1000倍液灌根進(jìn)一步開展其他試驗(yàn)。

    表2 不同濃度5%氨基寡糖素對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果比較

    2.3 5%氨基寡糖素對苦瓜根系病程相關(guān)蛋白酶活性的影響

    2.3.1 對PPO活性的影響 從圖1-A可看出,T1、T2和T3處理的PPO活性在誘導(dǎo)或接種后迅速升高,處理1 d即達(dá)峰值,以T2處理的峰值明顯高于其他處理,隨后3個(gè)處理的PPO活性均開始逐漸下降,至處理第6天又開始上升,處理第8天達(dá)第二峰值,但3個(gè)處理間差異較??;而T4處理的PPO活性在處理后1 d升幅較小,且在處理1 d后均均處于降低狀態(tài)??梢姡?%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可提高苦瓜幼苗根系組織的PPO活性,并維持在較高水平,有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力,尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

    2.3.2 對PAL活性的影響 從圖1-B可看出,T2處理的PAL活性在處理后1 d達(dá)峰值,之后活性緩慢降低,在處理第2天又緩慢升高,并保持在較平穩(wěn)的高水平;T1處理的PAL活性在處理后1 d達(dá)峰值,隨后快速降低,處理第2天快速升高,并在處理第4天達(dá)第二峰值,隨后呈降低趨勢;T3處理的PAL活性分別在處理的第1天和第6天出現(xiàn)2個(gè)峰值,但升高幅度不大;T4處理的PAL活性在處理后呈波動(dòng)降低趨勢。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可提高苦瓜根系組織的PAL活性,并維持在較高水平,有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力,尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

    2.3.3 對POD活性的影響 從圖1-C可看出,T1、T2和T3處理的POD活性變化趨勢一致,均在處理后迅速升高,處理第2天達(dá)峰值,隨后活性急劇下降,在處理第4天活性降至谷底后又迅速升高,處理第8天達(dá)第二峰值,2個(gè)峰值均以T2處理最高;T4處理的POD活性變化較平緩,無明顯的升降變化。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的POD活性,有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力,尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

    2.3.4 對β-1,3-GLU活性的影響 圖1-D表明,T2處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高,并在處理的第1天達(dá)峰值,隨后活性開始下降,處理的第2天降至T4處理水平,之后活性上升,在處理的第6天達(dá)第二峰值;T1處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高,在處理的第1天達(dá)峰值,隨后活性開始下降,在處理2 d后又繼續(xù)升高,在處理的第6天達(dá)第二峰值,且該峰值明顯高于其他處理;T3處理的β-1,3-GLU活性變化趨勢與T2處理相似,但活性整體較T2處理低;T4處理β-1,3-GLU活性的升降變化平緩。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的β-1,3-GLU活性,有利于提高破壞真菌細(xì)胞壁能力,從而提高抵抗枯萎病能力。

    A、B、C、D分別代表PPO、PAL、POD、β-1,3-GLU活性A,B,C and D represented activities of PPO,PAL,POD and β-1,3-GLU,respectively 圖1 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗PPO、PAL、POD和GLU活性的變化情況Fig.1 Activity changes of PPO,PAL,POD and GLU in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    2.4 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)對枯萎病菌侵染苦瓜的影響

    經(jīng)顯微觀察,經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6 d,苦瓜根系中開始有枯萎病菌侵染(圖2-A),接種后6~14 d根系中觀察到少量菌絲,接種后18 d出現(xiàn)大量菌絲(圖2-B),接種后22 d開始出現(xiàn)孢子(圖2-C),接種后24 d產(chǎn)生大量孢子;而對照(JG-CK)在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產(chǎn)生(圖2-D),接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲并產(chǎn)生孢子(圖2-E),接種后14 d產(chǎn)生大量孢子(圖2-F)??梢姡?%氨基寡糖素誘導(dǎo)不能阻止苦瓜枯萎病菌菌絲對根系的侵染,但可延緩枯萎病菌的侵染時(shí)間,同時(shí)可阻止菌絲進(jìn)一步發(fā)展和抑制孢子形成。

    2.5 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜次生代謝物質(zhì)的影響

    2.5.1 對苦瓜木質(zhì)素沉積的影響 在5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后接種0 d取樣發(fā)現(xiàn),J1或J2處理苦瓜幼苗的根、莖和葉片中均出現(xiàn)木質(zhì)素沉積現(xiàn)象,根細(xì)胞組織(圖3-A)、莖組織的韌皮部和木質(zhì)部(圖3-B)及葉面細(xì)胞壁(圖3-C)均出現(xiàn)木質(zhì)素沉積,但J1處理與J2處理差異不明顯;隨著處理時(shí)間的延長,根、莖和葉片中木質(zhì)素沉積量明顯增加,J1或J2處理的木質(zhì)素沉積量在根組織的細(xì)胞壁(圖3-D)、莖組織的細(xì)胞壁和韌皮部(圖3-E)及葉片的大葉脈和細(xì)胞壁(圖3-F)沉積明顯。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后的苦瓜組織均存在不同程度的木質(zhì)素沉積現(xiàn)象。

    2.5.2 對苦瓜酚類化合物代謝變化的影響 從圖4~5可看出,在J1或J2處理的根組織中,接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖4-A),有酚類物質(zhì)沉積(圖5-A),隨后平均熒光強(qiáng)度呈上升趨勢,接種后2和6 d平均熒光強(qiáng)度分別達(dá)峰值,酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-B),接種后8 d平均熒光強(qiáng)度降低,酚類物質(zhì)沉積減少(圖5-C);而在J3和J4處理的根系組織中,接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(hào)(圖4-A),J3處理在接種后1 d平均熒光強(qiáng)度達(dá)峰值,隨后緩慢下降,J4處理在接種后2和8 d平均熒光強(qiáng)度分別達(dá)峰值,但整體波動(dòng)不大,熒光信號(hào)不強(qiáng)。在J1或J2處理的莖組織中,接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖4-B),有少量酚類物質(zhì)沉積(圖5-D),接種后1 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào),有酚類物質(zhì)沉積(圖5-E),隨后熒光信號(hào)迅速增強(qiáng),平均熒光強(qiáng)度在接種后4 d達(dá)峰值,酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-F),接種后6 d熒光信號(hào)減弱,接種后8 d信號(hào)繼續(xù)增強(qiáng),其中J2處理的平均熒光強(qiáng)度出現(xiàn)第二峰值;而在J3和J4處理的莖組織中,接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖4-B),隨后平均熒光強(qiáng)度緩慢增強(qiáng),J3處理在接種后4 d出現(xiàn)峰值,J4處理在接種后6 d出現(xiàn)峰值,但熒光強(qiáng)度均不強(qiáng)。在J1或J2處理的葉組織中,接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖4-C),有酚類物質(zhì)沉積(圖5-G),接種后4 d熒光信號(hào)最強(qiáng),酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-H),隨后熒光信號(hào)減弱,至接種后8 d熒光信號(hào)繼續(xù)減弱,酚類無明顯沉積(圖5-I)。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后,苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的酚類化合物沉積現(xiàn)象。

    A、B、C分別代表氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6、18和22 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況;D、E、F分別代表對照接種后2、8和14 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況;M代表菌絲;S代表孢子A,B and C represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings induced and inoculated with amino-oligosaccharide on 6,18 and 22 days,respectively;D,E and F represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings in the control on 2,8 and 14 days of inoculation;M represented mycelium;S represented spore圖2 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根系枯萎病菌的侵染情況Fig.2 Wilt pathogen infection status in bitter gourd roots after being induced and inoculated by 5% amino-oligosaccharides

    A、D分別代表誘導(dǎo)接種后0和8 d J1處理根系木質(zhì)素的沉積情況;B、E分別代表誘導(dǎo)接種后0和8 d J2處理莖木質(zhì)素的沉積情況;C、F分別代表誘導(dǎo)接種后0和6 d J1處理葉片木質(zhì)素的沉積情況A and D represented root lignin deposition on 0 and 8 days of J1 treatment after induction and inoculation,respectively;B and E represented stem lignin deposition on 0 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation;C and F represented leaf lignin deposition on 0 and 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖3 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉木質(zhì)素的沉積情況Fig.3 The dynamic changes of lignin in root,stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    A、B、C分別代表根、莖和葉組織酚類化合物的平均熒光強(qiáng)度A,B and C represented the mean gray value change of phenolic compounds in root,stem and leaf,respectively 圖4 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗酚類化合物平均熒光強(qiáng)度的變化情況Fig.4 Mean gray value changes of phenolic compounds in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    A、B、C代表誘導(dǎo)接種后0、6和8 d J2處理根系酚類化合物的沉積情況;D、E、F代表誘導(dǎo)接種后0、1和8 d J2處理莖酚類化合物的沉積情況;G、H、I代表誘導(dǎo)接種后0、4和8 d J2處理葉片酚類化合物的沉積情況A,B and C represented root phenolic compound deposition on 0,6 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation;D,E and F represented stem phenolic compound deposition on 0,1 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation;G,H and I represented leaf phenolic compound deposition on 0, 4 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation圖5 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉酚類化合物的沉積情況Fig.5 Phenolic compound deposition in root,stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    2.5.3 誘導(dǎo)后苦瓜胼胝質(zhì)的變化 從圖6~7可看出,在J1或J2處理的根組織中,接種后0 d出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖6-A),隨后平均熒光強(qiáng)度呈上升趨勢,接種后4 d平均熒光強(qiáng)度達(dá)峰值,胼胝質(zhì)沉積量較大,隨后熒光信號(hào)和平均熒光強(qiáng)度減弱(圖7-A);而在J3和J4處理的根系組織中,接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(hào)(圖6-A),其中,J3處理隨后呈緩慢上升趨勢,接種后4 d達(dá)峰值,隨后急劇下降,而J4處理的熒光信號(hào)波動(dòng)相對平緩,熒光強(qiáng)度處于較低水平(圖7-A)。在J1或J2處理的莖組織中,接種后0 d有微弱熒光信號(hào)(圖6-B),接種后1 d到第一峰值,但平均熒光強(qiáng)度較低,隨后呈下降趨勢,胼胝質(zhì)沉積不明顯,接種后4 d后熒光信號(hào)迅速增強(qiáng),平均熒光強(qiáng)度在接種后8 d達(dá)峰值,胼胝質(zhì)沉積量較大(圖7-B);而在J3和J4處理的莖組織中,接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖6-B),隨后平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng),但整體波動(dòng)不大,熒光強(qiáng)度均不高(圖7-B)。在J1或J2處理的葉組織中,接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖6-C),有胼胝質(zhì)沉積,接種后6 d J1處理的熒光信號(hào)最強(qiáng),胼胝質(zhì)沉積量較大(圖7-C),隨后熒光信號(hào)減弱,接種后8 d熒光信號(hào)不明顯,胼胝質(zhì)無明顯沉積,而J2處理在接種后2 d熒光信號(hào)最強(qiáng)(圖6-C),胼胝質(zhì)沉積量較大,隨后熒光信號(hào)減弱,接種后8 d熒光信號(hào)不明顯,胼胝質(zhì)無明顯沉積(圖7-C)。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后,苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的胼胝質(zhì)沉積現(xiàn)象。

    3 討 論

    氨基寡糖素作為一種新型植物免疫誘抗劑在抗病誘導(dǎo)方面具有較好效果,已受到越來越多研究者的關(guān)注。已有研究表明,氨基寡糖素可誘導(dǎo)棉花抗枯黃萎病[13]、番茄抗早疫病[21]、香蕉抗褐緣灰斑病[22]和火龍果抗?jié)儾23]。檀志全等[24]研究發(fā)現(xiàn),5%氨基寡糖素對葡萄霜霉病的預(yù)防效果為78.29%,對葡萄炭疽病的預(yù)防效果為60.00%。李育林[25]研究發(fā)現(xiàn),噴施3%氨基寡糖素250倍液對葡萄霜霉病的防效達(dá)74.73%。本研究結(jié)果表明,5%氨基寡糖素1000倍液灌根可有效誘導(dǎo)苦瓜對枯萎病的抗性,誘導(dǎo)接種后的苦瓜枯萎病病情指數(shù)降低59.44,對枯萎病的抗性達(dá)抗病(R)水平,誘導(dǎo)抗病指數(shù)為70.39,與上述研究結(jié)果相似。

    A、B、C分別代表根、莖和葉組織胼胝質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度A,B and C represented the mean gray value change of callose in root,stem and leaf,respectively 圖6 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗胼胝質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度的變化情況Fig.6 Mean gray value changes of callose in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    A代表誘導(dǎo)接種后6 d J2處理根系的胼胝質(zhì)沉積情況;B代表誘導(dǎo)接種后2 d J1處理莖的胼胝質(zhì)沉積情況;C代表誘導(dǎo)接種后6 d J1處理葉片的胼胝質(zhì)沉積情況A represented root callose deposition on 6 days of J2 treatment after induction and inoculation;B represented stem callose deposition on 2 days of J1 treatment after induction and inoculation;C represented leaf callose deposition on 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖7 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉胼胝質(zhì)的沉積情況Fig.7 Callose deposition in root, stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

    在病原菌侵染過程中,寄主植物為抵抗病原菌侵染會(huì)啟動(dòng)自身的免疫系統(tǒng),促進(jìn)細(xì)胞壁次生代謝物質(zhì)活性提高及植保素和病程相關(guān)蛋白合成等誘導(dǎo)抗病性反應(yīng)。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一,由這一途徑產(chǎn)生的次生物質(zhì)木質(zhì)素和酚類物質(zhì)在植物生長發(fā)育、抵御病蟲害及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要意義。PAL和POD均是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶,與木質(zhì)素、植保素和酚類化合物等抗性物質(zhì)的形成密切相關(guān)[26]。PPO可催化木質(zhì)素和酚類氧化產(chǎn)物的形成,產(chǎn)生保護(hù)性屏蔽[27]。β-1,3-GLU是植物真菌病的重要抗性物質(zhì)之一,通過水解β-1,3-葡聚糖破壞真菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致病原真菌死亡,發(fā)揮防御病害作用[28-30]。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn),以苯并噻二唑(ASM)處理甜瓜,可激活甜瓜果實(shí)的內(nèi)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性及增強(qiáng)相關(guān)代謝物質(zhì)含量,從而加強(qiáng)果實(shí)細(xì)胞壁和防止病原入侵。商文靜[32]研究表明,殼寡糖誘導(dǎo)后煙葉體內(nèi)與抗病性相關(guān)的各種防御酶活性均發(fā)生不同程度變化,PAL活性在接種后大幅度升高。王杰等[33]噴施6.25 mg/L氨基寡糖素能系統(tǒng)誘導(dǎo)煙草POD、PAL和SOD活性,提高煙草抗病性。袁新琳等[13]研究表明,氨基寡糖素能誘導(dǎo)棉葉中POD、PPO和PAL活性提高。本研究中,5%氨基寡糖素誘導(dǎo)可有效提高苦瓜幼苗根系中的PPO、PAL和POD活性,與前人研究結(jié)果一致[13];經(jīng)過氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6 d,苦瓜根系開始有枯萎病菌侵染,接種后6~14 d根系中觀察到少量菌絲,而對照在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產(chǎn)生,接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲,接種后14 d有大量孢子產(chǎn)生,說明氨基寡糖素誘導(dǎo)可延緩枯萎病菌侵染時(shí)間,同時(shí)可阻止菌絲進(jìn)一步發(fā)展和抑制孢子形成,與石延霞等[12]、孫輝[34]、石延霞[35]的研究結(jié)果一致,表明誘抗劑氨基寡糖素可有效誘導(dǎo)植物枯萎病的抗性,推測其抗性生理機(jī)理可能是通過苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶調(diào)控木質(zhì)素和酚類化合物沉淀,進(jìn)而直接阻礙枯萎病菌菌絲對苦瓜的侵染而增強(qiáng)苦瓜對枯萎病的防御能力;誘導(dǎo)β-1,3-GLU提高,有效延緩苦瓜枯萎病菌的擴(kuò)展速度。

    4 結(jié) 論

    5%氨基寡糖素誘導(dǎo)可激發(fā)苦瓜抗病免疫系統(tǒng)啟動(dòng),提高苦瓜幼苗根系的PPO、PAL、POD和β-1,3-GLU活性,促進(jìn)苦瓜根、莖和葉組織細(xì)胞壁中木質(zhì)素和酚類物質(zhì)沉積,木質(zhì)化程度增加,增強(qiáng)苦瓜對枯萎病的防御能力,延緩苦瓜枯萎病菌的擴(kuò)展速度,有效誘導(dǎo)苦瓜枯萎病的抗性。

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