白三葉TrDFR基因克隆及表達(dá)分析

張婷婷，劉 洋，許本波，田 宏，熊軍波，陸姣云，張鶴山

(1. 動(dòng)物胚胎及分子育種湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2. 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

【研究意義】白三葉(Trifoliumrepens)含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白，可以調(diào)節(jié)地溫、防止病蟲害、抑制雜草、改良土壤、提高土壤肥力，因而作為牧草被廣泛應(yīng)用于濕潤(rùn)溫帶氣候[1-3]。白三葉除了在牧草上有廣泛應(yīng)用外，因其花色、葉形而具有很高的觀賞價(jià)值，也作為草坪草或城市綠化植物被廣泛利用[4-6]。目前已有多個(gè)具有觀賞價(jià)值性狀的白三葉種質(zhì)，如Dark Dancer、Salsa Dancer、Dark Dancer、Good Luck和Purpurescens，在美國(guó)被登記注冊(cè)為觀賞品種[7]。值得注意的是，Dark Dancer和Dark Dancer均具有粉紅色花瓣，并且已經(jīng)作為商品種子在市場(chǎng)銷售[8]。花的變化經(jīng)常引起消費(fèi)者的注意并且使得植物具有更高的觀賞價(jià)值[9]。因此，白三葉的花色特征，如紅色性狀，具有很高的商業(yè)價(jià)值?；ㄉ剀帐屈S酮類物質(zhì)的次生代謝產(chǎn)物，在植物器官中均有分布，決定大部分花色形成的色素群[10]，不但影響植物多彩的顏色[11]，在植物傳粉、抵御逆境脅迫、防止紫外線損傷、抗氧化、抗衰老等方面也有重要作用[12]。花色是白三葉的重要表型性狀，常常作為育種工作者的參考指標(biāo)，但目前對(duì)白三葉花色調(diào)控研究較少，發(fā)掘調(diào)控花色的關(guān)鍵基因?qū)Π兹~相關(guān)性狀分子遺傳改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】二氫黃酮醇4-還原酶(Dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是調(diào)控花色苷和原花色素的關(guān)鍵酶，可以催化一種或三種二氫黃酮醇(二氫楊梅素、二氫山萘酚和二氫槲皮素)形成相應(yīng)的無(wú)色花青素，進(jìn)而通過(guò)花青素合成酶將無(wú)色的花色素苷氧化脫水變成有色的花青素[13]。在龍膽(Gentianalutea)[14]、香玉簪(Hostaventricosa)[15]、日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)[16]、觀賞芥藍(lán)(Brassicaoleraceavar. acephala)[17]、金花茶(Camellianitidissima)[18]等植物中，DFR基因已被發(fā)現(xiàn)和花的顏色相關(guān)。白三葉花瓣通常為白色，但也有粉色或紅色花瓣的突變體[19-20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究在田間資源圃中發(fā)現(xiàn)一株開紅花的白三葉突變體，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)其DFR同源基因在野生型(白花)和突變體間具有顯著差異，白三葉的紅色花瓣可能與DFR基因的調(diào)控有關(guān)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以白三葉突變體為材料克隆TrDFR序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，以期為白三葉TrDFR基因功能的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，為紅花白三葉突變體的育種提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料處理

選取野生型和紅花突變體白三葉的根、莖、葉、花瓣、花梗和葉柄，在開花期取樣并快速置于液氮中，樣品于-80 ℃保存待用。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RNA存放-80 ℃冰箱，cDNA存放-20 ℃冰箱，用于熒光定量分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白三葉RNA及cDNA的獲取 利用RNA提取試劑盒(OMEGA公司)中配套的常規(guī)使用方法提取野生型和突變體白三葉的根、莖、葉、花梗和葉柄的RNA；野生型和突變體白三葉的花瓣利用試劑盒中的提取樣品方法。RNA提取完成后，測(cè)定濃度并利用瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測(cè)其完整性。合格的RNA樣品存放于-80 ℃冰箱。用DNase I RNase-free反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛公司)及其配套使用方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到野生型和突變體白三葉根、莖、葉、花瓣、花梗和葉柄的cDNA。cDNA樣品存放于-20 ℃冰箱。

1.2.2 白三葉DFR基因克隆 利用3個(gè)重復(fù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(原始數(shù)據(jù)已上傳GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，No：GSE101059)中TrDFR基因的mRNA序列設(shè)計(jì)克隆引物(TrDFR-F:5′-ATGGGTTCTTTGTCCGAAAC-3′和TrDFR-R:5′-CTTCCCATCCAAGGGTAAA-3′)，以開紅花的白三葉突變體的花瓣cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序參照2×FastTaqpremix PCR mix(TOLOBIO公司)的使用說(shuō)明(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(1%)；參照OMEGA公司普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收；采用pMD18-T載體連接回收產(chǎn)物；連接成功后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng)10～12 h。然后用含100 mg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)篩選，挑選單克隆菌斑進(jìn)行菌液培養(yǎng)，然后經(jīng)菌液PCR檢測(cè)選取5個(gè)陽(yáng)性菌落送往奧科鼎盛生物公司(武漢)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 白三葉DFR基因生物信息學(xué)分析 在軟件DNAMAN 6.0上對(duì)TrDFR基因的開放閱讀框進(jìn)行查找并翻譯成氨基酸序列，利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具中對(duì)白三葉DFR蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TMHMM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)軟件對(duì)TrDFR蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)軟件對(duì)白三葉DFR蛋白質(zhì)的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Wolfpsort(https://wolfpsort.hgc.jp/)軟件對(duì)白三葉DFR蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)軟件對(duì)白三葉DFR蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)軟件對(duì)DFR蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)軟件對(duì)DFR蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用PlantCare(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)軟件對(duì)白三葉DFR蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行同源序列的查找，MEGA X軟件上進(jìn)行氨基酸同源序列的比對(duì)并構(gòu)建白三葉DFR氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 白三葉TrDFR基因的表達(dá)模式 在Primer 5上依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)TrDFR熒光定量引物(TrDFR-F:5′-TTTTGCCGAAGAGTAAAGATG-3′,TrDFR-R:5′-CAAGAGGTGGAATGATTGTGAT-3′)。內(nèi)參β-actin的引物為β-actin-F(AATGAATTGCGTGTTGCTCCTGAGG)和β-actin-R(ACCAGTTGTACGACCACTTGCATAG)。以野生型‘鄂牧2號(hào)’白三葉為對(duì)照，以野生型和突變體材料的根、莖、葉、花瓣、花梗和葉柄的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。熒光定量的程序參照iTaq Universal SYBR Green Supermix熒光定量Mix(Bio-rad公司)使用說(shuō)明(95 ℃ 300 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s)進(jìn)行。用96孔上樣板，目的基因與內(nèi)參基因?qū)?yīng)，操作時(shí)避免強(qiáng)光照射。設(shè)3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉總RNA提取

如圖1所示，野生型和突變體白三葉根、莖、葉、花瓣、花梗和葉柄的總RNA條帶清晰；紫外分光光度檢測(cè)OD260/OD280值均大于2.0，說(shuō)明所提取的RNA純度較高，可用于反轉(zhuǎn)錄獲得野生型和突變體白三葉根、莖、葉、花瓣、花梗和葉柄的cDNA。

2.2 白三葉突變體DFR基因克隆

克隆得到1條略大于1000 bp的片段(圖2)，對(duì)挑選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序得到堿基序列，測(cè)序結(jié)果與目的序列相似度為99.70%，說(shuō)明TrDFR基因已被成功克隆。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST將白三葉FDR基因cDNA核苷酸序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，白三葉與紅三葉(Trifoliumpratense，XM_04593587.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XM_013610680.3)、鷹嘴豆(Cicerarietinum，XM_004499122.3)等物種高度同源，其中與紅三葉的覆蓋度為97.0%，一致性達(dá)到95.0%以上，說(shuō)明所克隆的白三葉DFR基因序列具有高度完整性。

1～6：野生型白三葉的根、莖、葉、花瓣、葉柄和花梗的RNA；7～12：突變體白三葉的根、莖、葉、花瓣、葉柄和花梗的RNA1-6：RNA of the roots, stems, leaves, petal, petioles and pedicles of the wild-type white clover；7-12：RNA of the roots, stems, leaves, petal, petioles and pedicles of the mutant white clover圖1 野生型和突變體不同部位的RNA提取電泳圖Fig.1 RNA extraction from different sites of the wild-type and mutants

2.3 核苷酸序列生物信息學(xué)分析

2.3.1 白三葉DFR蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)TrDFR基因長(zhǎng)1131 bp，開放閱讀框有969 bp，合成322個(gè)氨基酸，以ATG為啟動(dòng)子, TAA為終止子。由這些氨基酸為一級(jí)結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)的分子量為36.59 kD，有5152個(gè)原子，分子式為C1643H2585N429O475S20，為親水的帶負(fù)電荷蛋白，理論等電點(diǎn)為6.52。Lys 氨基酸含量最多，有30個(gè)，質(zhì)量占總數(shù)的9.3%，其次是Leu，有27個(gè)，質(zhì)量百分比為8.4%，Trp 含量最少，只有4個(gè)，質(zhì)量百分比為1.2%(表1)。白三葉DFR蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能，且不分泌到細(xì)胞外作用，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，行使功能的過(guò)程中有可能發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。

白三葉DFR蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，最多的是無(wú)規(guī)則卷曲，有136處，占42.1%；其次是α-螺旋，有116處，占35.9%；延伸鏈有49處，占15.2%；β-折疊有22個(gè)氨基酸，占6.81%(圖3)。以2c29.1.A為模板，利用同源建模法構(gòu)建白三葉DFR蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)，三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋含量最多，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.3.2TrDFR基因啟動(dòng)子順式作用元件分析TrDFR基因序列中共找出38個(gè)順式作用元件，其中

M. DL 2000 Marker；1.目的片段M. DL 2000 Marker；1. Target product圖2 TrDFR克隆產(chǎn)物Fig.2 Clone product of TrDFR

紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲;藍(lán)色表示α-螺旋;紅色表示延伸鏈;綠色表示β-折疊Purple indicates random coil; Blue indicates alpha helix; Red indicates the extended strand; Green represents beta turn圖3 DFR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary structure prediction of DFR protein

藍(lán)色表示α-螺旋;黃色表示無(wú)規(guī)則卷曲；紅色表示延伸鏈；綠色表示β-折疊Blue indicates alpha helix; Yellow indicates random coil; Red indicates the extended strand; Green represents beta turn圖4 DFR蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of DFR protein

11處順式作用元件在白三葉和其他物種中均沒有相關(guān)研究，有27處順式作用元件在其他物種中有發(fā)現(xiàn)或相關(guān)的功能分析。分析結(jié)果(圖5)表明，TrDFR基因啟動(dòng)子序列包含多種與光響應(yīng)和抗逆性相關(guān)的順式作用元件，如典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件TATA-box和CAAT-box；光響應(yīng)元件AE-box、Box 4、G-box、GARE-motif、LAMP-element；醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件O2-site；缺氧特異性誘導(dǎo)的增強(qiáng)子作用元件GC-moyif；脅迫響應(yīng)元件MYB、W box、MYB-like sequence；茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif；低溫響應(yīng)元件MYC；脫落酸響應(yīng)元件ABRE；植物防御響應(yīng)元件as-1。

2.3.3 TrDFR氨基酸同源性及進(jìn)化分析 在NCBI上對(duì)白三葉DFR氨基酸的同源序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)白三葉DFR氨基酸序列與紅三葉(XP_045791829.1)相似度最高，為93.64%，與蒺藜苜蓿(XP_013466134.1)的相似度為88.35%，與野大豆(Glycinesoja，XP_028199701.1)、鷹嘴豆(XP_004499179.2)、百脈根(Lotusjaponicus，AFK35141.1)、絲莖黃耆(Lotusfilicaulis，ATI97621.1)、密花豆(Spatholobussuberectus，TKY57696.1)、大豆(Glycinemax，NP_001238612.2)、黑種豇豆(Vignaradiatavar. Radiata，XP_014503836.1)和赤小豆(Vignaumbellata，XP_047160387.1)的相似度分別為86.36%、85.90%、85.90%、85.58%、83.33%、83.13%、81.42%和80.12%，多序列比對(duì)后，采用鄰接法構(gòu)建白三葉與近源物種氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果表明，11個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹聚合為2大支，其中白三葉、紅三葉、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆在一個(gè)大支；剩下七個(gè)物種所在的一個(gè)大支又分為2個(gè)小支。白三葉和紅三葉的遺傳距離最近，因此他們之間的相似度更高，其次是蒺藜苜蓿，和NCBI中的序列相似度基本一致，說(shuō)明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。進(jìn)化樹逐級(jí)分支，具有較多層級(jí)，說(shuō)明DFR蛋白的進(jìn)化具有保守性和物種特異性。

2.4 TrDFR基因表達(dá)分析

如圖7所示，TrDFR基因在不同基因型白三葉中表達(dá)水平差異明顯，在野生型的葉柄和花梗中大量表達(dá)，而根、莖、葉和花瓣中表達(dá)量很低；在突變體花瓣、莖、花梗和葉柄中有大量表達(dá)，根和葉中幾乎不表達(dá)。方差分析表明，TrDFR在紅花突變體莖和花瓣中表達(dá)量顯著高于野生型(P<0.01)，但在花梗中的表達(dá)量顯著低于野生型(P<0.01)。前期研究表明，紅花白三葉花瓣和莖中的矢車菊素含量比野生型花瓣中高[20]，而矢車菊素是形成紅色的主要色素。所以TrDFR基因可能參與白三葉花瓣花色素苷的生物合成，但相關(guān)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3 討 論

DFR基因在不同物種中的開放閱讀框長(zhǎng)度、氨基酸個(gè)數(shù)、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量都相差不大，說(shuō)明DFR基因在進(jìn)化上具有保守性，比如在明日葉(Angelicakeiskei)中，AkDFR序列含有1131 bp的開放閱讀框，編碼合成376個(gè)氨基酸，蛋白大小為42.42 kD[21]；刺葡萄(Vitisdavidii)中VdDFR開放閱讀框長(zhǎng)1014 bp，編碼合成337個(gè)氨基酸，分子量為37.59 kD[22]；本研究結(jié)果表明，白三葉TrDFR基因開放閱讀框長(zhǎng)969 bp，編碼合成322個(gè)氨基酸，分子量為36.59 kD。DFR基因在明日葉[21]、蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)[23]和白三葉中均是穩(wěn)定的非分泌蛋白，說(shuō)明DFR蛋白在發(fā)揮功能時(shí)其構(gòu)象不會(huì)發(fā)生改變，而且不分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。DFR蛋白的進(jìn)化關(guān)系和物種種類有關(guān)，說(shuō)明DFR蛋白的進(jìn)化具有物種特異性和保守性。

圖5 順式作用元件分布位點(diǎn)Fig.5 Cis-acting element distribution site

圖6 TrDFR系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of TrDFR

**表示1%水平差異顯著** indicates significant different at 0.01 level圖7 TrDFR基因在野生型和突變體白三葉不同部位的表達(dá)Fig.7 Expression of TrDFR gene in different parts of wild-type and mutant white clover

調(diào)控DFR基因的MYB轉(zhuǎn)錄因子與花青素的合成有關(guān)。在淫羊藿(Epimediumsagittatum)[24]、梨(PyrusComms)[25]、李(Prunussalicina)[26]和葡萄(Vitisvinifera)[27]等物種中，MYB通過(guò)激活DFR基因的啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)植物中花青素積累。白三葉中也檢測(cè)到了MYB啟動(dòng)子順式作用元件，故而預(yù)測(cè)TrMYB對(duì)TrDFR基因有調(diào)控作用。

DFR基因在不同物種中的表達(dá)水平有組織特異性。在紅花(Carthamustinctorius)的花瓣中表達(dá)量最高，其次是葉和苞片，在根和莖中檢測(cè)不到該基因的表達(dá)[28]；在葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)花瓣組織中表達(dá)較高，根、莖和葉中微量表達(dá)[29]。本研究結(jié)果表明，TrDFR基因在開白花的野生型白三葉葉柄、花梗中大量表達(dá)，而在根、莖、葉和花瓣中低表達(dá)甚至不表達(dá)；但在開紅花的突變體白三葉中的莖和花瓣中高表達(dá)，顯示出顯著的組織表達(dá)特異性。同時(shí)，TrDFR在不同基因型白三葉同一組織部位的表達(dá)也有差異，本研究中紅花白三葉突變體的花瓣和莖中，其表達(dá)水平顯著高于野生型白三葉(P<0.01)；這一現(xiàn)象在其他物種中也有發(fā)現(xiàn)，如紫葉羽衣甘藍(lán)葉片中BoDFR基因的表達(dá)量最高，而白葉羽衣甘藍(lán)心葉中僅微量表達(dá)[28]，這可能與不同基因型材料的花色素含量有關(guān)，白三葉紅花突變體花瓣比野生型白色花瓣具有更高的矢車菊素含量[18]，而紫葉羽衣甘藍(lán)葉片中花青素含量最高[30]。因此，TrDFR基因可能參與白三葉花瓣色素的合成，這與在葡萄風(fēng)信子[31]、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)[32]和牽?；?Toreniahybrida)[33]中的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

白色葉TrDFR蛋白分子量為36.59 kD，屬于不穩(wěn)定的親水非分泌蛋白；其氨基酸序列和紅三葉的進(jìn)化關(guān)系最近。TrDFR基因在白三葉花、葉柄和花梗中大量表達(dá)，且紅花突變體莖和花中的表達(dá)量顯著高于野生型(P<0.01)。TrDFR基因可能與白三葉花瓣中花色素苷的合成有重要關(guān)系。