長角血蜱巨噬細(xì)胞移動抑制因子的克隆表達及酶活分析

王玉儉，代紹密，李曉燕，黃冰冰，宋冠華，鐘平生

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

蜱是一類常見的寄生于脊椎動物體表的吸血節(jié)肢動物，它們侵襲哺乳動物、鳥類、爬行類，甚至兩棲類，廣泛分布于世界各地。蜱隸屬蛛形綱，蜱螨亞目，蜱總科。蜱總科包括硬蜱科，軟蜱科和納蜱科；硬蜱科是常見的且危害最大的一種，其次是軟蜱科，納蜱科則不太常見且影響不大。蜱的危害不僅是作為動物外寄生蟲，更重要的是作為許多人和動物重要疾病的傳播媒介。蜱是世界范圍內(nèi)僅次于蚊子的第二大疾病傳播媒介，可以傳播病毒、細(xì)菌、真菌和原蟲等多種病原體。蜱是人森林腦炎、Q 熱和萊姆病等傳染病的主要傳播媒介，給公眾衛(wèi)生的安全帶來嚴(yán)重的危害。蜱及蜱傳病對畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟損失也十分巨大，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，僅硬蜱給畜牧業(yè)造成的損失，每年高達70億美元以上［1］。

巨噬細(xì)胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一個重要的哺乳動物炎癥介質(zhì)［2］。MIF 在哺乳動物中有著廣泛和恒定的表達，它們被發(fā)現(xiàn)表達在許多組織和細(xì)胞類型中，包括：T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞［3-4］。缺乏通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的經(jīng)典分泌途徑所需的N端信號肽，MIF 通過無需信號肽介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑分泌［5］。MIF 是一個在進化上較為古老的分子，與哺乳動物同源的MIF 同系物基因被發(fā)現(xiàn)存在于許多原核（如細(xì)菌）和真核（如植物，魚類、兩棲類、鳥類和哺乳動物等脊椎動物，及原蟲、蠕蟲、線蟲、軟體動物和節(jié)肢動物等無脊椎動物）生物。許多寄生生物的MIF 同系物先后被鑒定，一些研究表明它們的功能可能是通過操縱宿主的免疫系統(tǒng)以幫助寄生蟲逃避宿主的免疫應(yīng)答，最終幫助寄生蟲成功的入侵和定殖于宿主。

不同蜱種的MIF 同系物陸續(xù)被鑒定［6-11］，然而它們確切的生物學(xué)功能仍需要進一步的研究。本研究克隆和表達長角血蜱這一巨噬細(xì)胞移動抑制因子基因（HlMIF），生產(chǎn)重組蛋白并測定其互變異構(gòu)酶活性，為更好地理解HlMIF的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、pMD19-T 載體連接試劑盒和2×Taq Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司；DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自南京擎科生物技術(shù)有限公司；卡那霉素、氨芐霉素、IPTG 和鹽酸左旋多巴甲酯購自Sigma 公司；His 色譜層析柱購自Novagen 公司；pET-28a 質(zhì)粒保存于實驗室。

1.2 HlMIF基因的克隆

采用Trizol法進行長角血蜱半飽血成蟲總RNA的提取，然后按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成模板cDNA。根據(jù)HlMIF（GenBank 登錄號：AB255601.1）的核苷酸序列信息，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計擴增其開放閱讀框（ORF）的特異性引物，HlMIF F：5′-GCGAATTCATGCCAACTCTCACGATT-3′；HlMIF R：5′- GACTCGAGCCCAGCAAATGTTTTTCC -3′，并引入酶切位點EcoR I和Xho I（下劃線），引物由安徽通用生物公司合成。以合成的半飽血雌蜱cDNA為模板，F(xiàn)與R 為引物進行HlMIF 基因的PCR 擴增。反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA 模板2 μL，dd H2O 7.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃34 s，53 ℃34 s，72 ℃1 min 共35 個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，經(jīng)雙酶切鑒定和測序，陽性克隆命名為pMD19-T-HlMIF。

1.3 HlMIF原核表達體系的構(gòu)建

將重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-HlMIF 和表達載體pET-28a 分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。PCR 和測序確認(rèn)陽性克隆，將其命名為pET-28a-HlMIF。取含正確重組表達質(zhì)粒的菌液100 μL接種到10 mL含卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min振蕩培養(yǎng)2.5 h左右使菌液OD值達到0.4~0.6，取出1 mL菌液后加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）進行誘導(dǎo)，期間每隔1 、2、3、4 、5 h 各取1 mL 菌液，制備樣品，進行SDS-PAGE，確定重組蛋白的最佳誘導(dǎo)時間。

1.4 重組蛋白的表達純化

參照說明書使用His 蛋白純化柱對重組蛋白質(zhì)進行純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測后，將純化好的重組蛋白在PBS緩沖液中透析24 h，PEG 20 000濃縮后，測定濃度，過濾除菌分裝，-70 ℃凍存。

1.5 HlMIF重組蛋白互變異構(gòu)酶活性分析

為制備L 多巴色素甲酯（L-dopachrome methyl ester），將8 mmol/L的高碘酸鈉與4 mmol/L的鹽酸左旋多巴甲酯（L-3，4-dihydroxyphen ylalanine methyl ester）等體積混合，室溫放置5 min，然后冰浴20 min。加入180 μL 上述混合液至96 孔板中，加入5 μmol/L（終濃度）的rHlMIF，立即送至酶標(biāo)儀，在25 ℃下讀取475 nm波長的吸光度值15 min（30 s間隔一次）。

2 結(jié)果

2.1 HlMIF的克隆

以半飽血成蜱cDNA為模板擴增HlMIF基因，獲得351 bp左右的目的片段（圖1），與預(yù)期大小一致。

圖1 HlMIF RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

構(gòu)建pMD19-T-HlMIF重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定正確，通過測序，與參考序列（GenBank登錄號：AB255601.1）同源性為100%。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HlMIF推導(dǎo)的氨基酸序列中存在保守的互變異構(gòu)酶活性位點（圖2）。

圖2 HlMIF核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 HlMIF的原核表達

將HlMIF 基因片段克隆至pET-28a 載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG 誘導(dǎo)后經(jīng)SDSPAGE 檢測。結(jié)果顯示，重組蛋白大小約為17.4 kDa，IPTG誘導(dǎo)后在5 h后表達量達到最大（圖3）。

圖3 SDS-PAGE分析pET-28a-HlMIF的時相表達

2.3 HlMIF重組蛋白的純化

誘導(dǎo)表達的菌體超聲破碎后通過Ni2+親和層析純化重組蛋白。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，rHlMIF 融合蛋白以上清的形式存在；經(jīng)鎳柱純化后，得到了較純凈的融合蛋白rHlMIF（圖4）。

圖4 SDS-PAGE分析重組蛋白rHlMIF的純化結(jié)果

2.4 HlMIF重組蛋白互變異構(gòu)酶活性分析

以L多巴色素甲酯為底物對HlMIF重組蛋白的互變異構(gòu)酶活性進行分析。結(jié)果顯示，HlMIF 重組蛋白具有對底物L(fēng)多巴色素甲酯的互變異構(gòu)酶活性（圖5）。

圖5 HlMIF重組蛋白的互變異構(gòu)酶活性

3 討論與結(jié)論

不同于軟蜱的重復(fù)多次的較短時間（數(shù)分鐘）吸血，硬蜱在每一發(fā)育階段需要對同一宿主長時間的吸血（數(shù)天到數(shù)周）。在這一長時間的吸血過程中，勢必會激發(fā)宿主一系列的防御機制：（1）血管收縮和啟動凝血途徑防止血液的流失；（2）觸發(fā)炎癥反應(yīng)和補體的激活等先天性免疫反應(yīng)以應(yīng)對隨之而來的微生物感染和幫助受損組織的重塑；（3）再次被同一蜱種叮咬的宿主可觸發(fā)抗原特異性獲得性免疫。在與宿主長期的共進化中，蜱獲得了突破宿主這些防御機制的能力［12］。在蜱的唾液腺中存在一系列具有抗凝血、抗炎癥和具有免疫調(diào)節(jié)特性的生物活性分子。為了完成持續(xù)的吸血，含有這些生物活性分子的唾液會被蜱釋放到宿主體內(nèi)，以對抗宿主的各種防御機制［13］。許多研究表明，在克服宿主的凝血和免疫防御反應(yīng)方面，蜱唾液中的這些生物活性分子發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用，最終幫助蜱蟲完成吸血和發(fā)育［14-17］。蜱唾液的組分是相當(dāng)復(fù)雜的，且在功能上具有冗余性；這也正對映了宿主防御機制的復(fù)雜和冗余性。一些蜱唾液分子已被鑒定，對它們的功能也有所研究，然而絕大多數(shù)的蜱唾液分子的功能仍保持未知［18-19］。

鑒于蜱唾液分子具有廣泛的生物學(xué)活性，它們在醫(yī)藥生物制劑開發(fā)上表現(xiàn)出的價值顯著提升。許多蜱唾液分子被期待開發(fā)為緩解和治療如凝血功能紊亂、腫瘤和自身免疫性疾病等疾病的生物制劑。重組白毛鈍緣蜱TAP（Tick anticoagulant peptide）蛋白已被用于許多靜脈和動脈粥樣硬化實驗動物模型的治療中，研究發(fā)現(xiàn)都可取得不同程度的效果［20-24］。肩突硬蜱的Ixolaris（一個組織因子抑制劑）被認(rèn)為具有治療人惡性膠質(zhì)瘤的潛在價值，它可以在惡性膠質(zhì)瘤模型中抑制原發(fā)性腫瘤的增長和血管生成［25］。血紅扇頭蜱的Evasin-1，一個可高親和度與宿主的CCL3 和CCL4 特異性結(jié)合的趨化因子結(jié)合蛋白。在CCL3 依賴的博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷模型中，Evasin-1 可顯著降低白細(xì)胞滲出、組織纖維化程度及致死率［26-27］。該蜱種的另一個趨化因子結(jié)合蛋白Evasin-3，可結(jié)合小鼠和人的CXCR2 配體（IL-8）。在由抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，Evasin-3可顯著減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)中性粒細(xì)胞的滲出及局部TNF-α 的分泌水平［28］。作為蜱蟲這一體外寄生蟲所表達的哺乳動物宿主細(xì)胞因子同系物，HlMIF 可能在其自身和宿主體內(nèi)都發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。

本研究成功克隆和表達了HlMIF基因并獲得純度較高上清表達的重組蛋白?；プ儺悩?gòu)酶活性分析結(jié)果顯示，rHlMIF 具有對底物L(fēng) 多巴色素甲酯的互變異構(gòu)酶活性，表明表達的重組HlMIF 蛋白具有很好的生物學(xué)活性，為更好地理解HlMIF的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。