基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)麻黃治療小兒遺尿機制探討

唐有男，吳 濤，范 鵬，陳積豪，吳紅彥

（廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 羅湖 518000）

小兒遺尿癥（Infantile Enuresis，IE）是指5歲以上兒童，每周2次以上，不能從睡眠中醒來無意識地排尿，連續(xù)3個月以上[1-2]。據(jù)權(quán)威統(tǒng)計[3]在全球5歲兒童中大約有16%的兒童患有該病，在11～12歲兒童中大約有5%的兒童患有該病。中國醫(yī)師協(xié)會在2020年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)IE患病率大約為4.8%，而由于年齡、性別、農(nóng)村、城市等的差異，許多患兒同時還存在一定的心理問題[4]。長期得不到有效的治療就會致其憂郁、性格內(nèi)向，而焦慮、注意力不集中，學(xué)習和生活受到嚴重影響[5]。西醫(yī)對該病的治療主要以基礎(chǔ)、報警器、藥物等療法為主[6]，但臨床療效欠佳，且復(fù)發(fā)率高，更有甚者報道有副作用[7-8]。中藥以多成分、多靶點、多通路的獨特優(yōu)勢[9]。有研究表明麻黃治療小兒遺尿臨床療效顯著[10]。

麻黃，性味辛，微苦，溫，歸肺和膀胱經(jīng)，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，記載其功效為:“主中風，傷寒頭痛，溫瘧，發(fā)表汗，去邪熱氣，止咳逆上氣，除寒熱，破積聚”[11]。具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫等功效[12]。現(xiàn)代藥理研究麻黃堿在治療小兒遺尿療效顯著，可能增強了膀胱三角肌及膀胱括約肌的張力，減少膀胱儲藏的尿量[13]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過對中藥麻黃多成分、多靶點與小兒遺尿生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進行探究[14]，進一步探究麻黃防治 小兒遺尿的潛在機制并揭示其科學(xué)內(nèi)涵，為藥理研究和臨床運用提供理論支撐。

1 方法

1.1 活性成分篩選

中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）[15]（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），將口服生物利用度OB≥30%，類似度（DL）≥0.18設(shè)定為篩選條件[16]進行藥物化合物的篩選。

1.2 活性成分靶點的獲取

運用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）[17]（http：//www.uniprot.org/），將“human”設(shè)置為限定物種，利用Perl軟件校正靶點名稱。

1.3 疾病相關(guān)靶點基因獲取

以“小兒遺尿”為關(guān)鍵詞，在OMIM（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），GeneCards[18]（https://www.genecards.org/）獲取小兒遺尿的基因靶點，運用R軟件前，安裝Venny包，將麻黃主要有效活性成分、靶點和小兒遺尿基因靶點，獲得該藥與IE的交集靶點，即為藥物治療IE的核心靶點。

1.4 藥物-靶點-小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點上傳到Cytoscape[19]（http：//www.cytoscape.org），構(gòu)建“藥物-靶點-小兒遺尿”PPI圖。網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建并呈現(xiàn)藥物-靶點-小兒遺尿之間的聯(lián)系，進一步探究麻黃治療小兒遺尿的作用機制。通過中心度、節(jié)點度值進一步挖掘核心麻黃治療小兒遺尿的節(jié)點。

1.5 構(gòu)建PPI（Protein-ProteinInteraction）

將治療的核心靶點輸入STRING[20]數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）中，將篩選物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，將Mediumconfidence設(shè)定大于0.4，獲取蛋白靶點信息，構(gòu)建PPI圖，以txt文件保存。運用Cytoscape中的Network Analyzer 插件進行拓撲學(xué)分析，包括度值、介度值、中心度值分析，獲取核心靶點。

1.6 GO注釋及KEGG通路分析

運用R語言，將篩選條件P＜0.05，進行GO、KEGG富集分析，同時對結(jié)果可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

運用TCMSP查找藥物主要有效活性成分，設(shè)定OB≥30%和DL≥0.18 為主要有效活性成分的篩選條件，獲得潛在有效活性成分15個，見表1。

表1 麻黃活性成分表

2.2 麻黃治療小兒遺尿的潛在作用靶點

獲得藥物主要有效成分為15個。在GeneCards、OMIM庫中共搜索小兒遺尿相關(guān)靶點，運用R語言安裝“VennDiagram”包，將藥物核心靶點和疾病靶點取交集，獲得麻黃有效活性成分治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點，得到韋恩圖（圖1）。獲得靶點27個，揭示了麻黃可能是調(diào)控多個靶點發(fā)揮治療小兒遺尿的作用。

圖1 麻黃有效成分作用靶點及小兒遺尿靶點交集

2.3 藥物-靶點-小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖

通過Cytoscape對藥物治療小兒遺尿的靶點網(wǎng)絡(luò)繪制和統(tǒng)計。揭示了藥物主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點的關(guān)系（圖2）。中心度、度值揭示了節(jié)點在PPI圖中核心度的高低，度值越高，說明該節(jié)點在圖中的作用越顯著。研究按Degree值和BC值大小排序篩選核心成分和靶點，結(jié)果顯示，山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等麻黃有效成分是網(wǎng)絡(luò)圖的核心節(jié)點，這些核心節(jié)點是麻黃治療小兒遺尿的主要靶點，見表2。

圖2 麻黃治療小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖

表2 麻黃治療小兒遺尿拓撲學(xué)特征

2.4 麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點

使用在線平臺STRING，導(dǎo)入麻黃治療小兒遺尿的靶點，設(shè)定篩選條件P＞0.9，將游離蛋白隱藏，獲得PPI圖（圖3）。該圖節(jié)點共27個，邊171條，平均值12.7。圖中的“節(jié)點”代表麻黃靶點，“邊”表示核心靶點的相互作用。邊數(shù)越多表示該節(jié)點對應(yīng)的靶點在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著。運用R語言繪制信息條形圖（圖4）。結(jié)果ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1等蛋白的度值較高，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶。

圖3 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點信息條形圖

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

進一步闡明靶點的可能性對靶點進行GO、KEGG分析。GO揭示麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點前5個生物學(xué)功能主要為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（8個靶點），核受體活性（5個靶點），配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性（5個靶點），RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（6個靶點），ATP酶結(jié)合（5個靶點）等,表明麻黃主要有效活性成分可以通過調(diào)控多種途徑而發(fā)揮治療小兒遺尿的作用（圖5）。運用KEGG富集分析，獲取31條信號通路圖，將P值＜0.01為篩選條件，得到17條通路。設(shè)置P值和相關(guān)基因的數(shù)量為篩選條件，獲取前4條通路進行相關(guān)分析，結(jié)果見圖6。分析發(fā)現(xiàn)，基因顯著富集在AGE/RAGE（6個位點基因）、HIF-1（5個位點基因）、Estrogen（8個位點基因）、Thyroid（5個位點基因）等信號通路上。

圖5 關(guān)鍵靶點注釋信息圖

圖6 KEGG富集分析圖

3 討論

本次研究出麻黃主要活性成分15個，獲得27個治療靶點，繪制成“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，麻黃主要有效活性成分為山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等藥物活性成分。獲得ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1蛋白，GO富集分析結(jié)果證實，麻黃治療小兒遺尿的基因功能主要體現(xiàn)在RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性，核受體活性，ATP酶結(jié)合等過程，KEGG 富集分析，共獲得31條通路，其中主要為4條通路，分別為AGE/RAGE、HIF-1、Estrogen、Thyroid等，因此，推測麻黃中的主要活性成分是通過上述通路基因來達到治療小兒遺尿的目的的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為探究麻黃治療小兒遺尿的一種新方法，同時也遵循了中醫(yī)的整體觀。從整體觀的角度去探究麻黃與小兒遺尿之間的關(guān)聯(lián)性，揭示麻黃是一種多成分、多途徑、多通路的協(xié)同作用，通過調(diào)控不同的靶標、不同的通路，發(fā)揮治療作用。借助該方法，探討了麻黃治療小兒遺尿的作用機制，同時也揭示了麻黃治療小兒遺尿多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為麻黃治療小兒遺尿的藥物研究提供了依據(jù)，為實驗和臨床的研究提供了新的思路。