消腫止痛合劑在骨傷科疾病中作用機制研究進展＊

馬歲錄，何志軍，劉 濤，何元旭，王海剛，何 波，李 巖，陳 文

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院足踝骨科，甘肅 蘭州 730050）

消腫止痛合劑是李盛華教授在臨床工作中，根據(jù)多年經(jīng)驗所研制的一種具有活血化瘀、消腫止痛的藥物，已在臨床應(yīng)用多年[1]。該合劑主要是由當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地黃、三七、木香、青皮、澤蘭、甘草等藥物結(jié)合現(xiàn)代工藝加工而成[2]。在臨床應(yīng)用中，對于關(guān)節(jié)炎、骨折、韌帶或者軟組織損傷、皮瓣移植、關(guān)節(jié)置換等都有很好的療效。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑治療骨傷科疾病的作用機制可能與調(diào)控VEGF-Dll4/Notch信號通路、AMPK/mTOR信號通路、PI3K/Akt信號通路以及抑制炎癥因子有關(guān)。

1 通過VEGF-Dll4/Notch信號通路治療血管損傷

創(chuàng)傷后組織器官會出現(xiàn)不同程度的血管損傷，從而造成局部組織血液循環(huán)不佳，引起局部缺氧，很大程度上影響創(chuàng)傷后傷口的愈合。因此，促進損傷組織周圍血管的恢復(fù)，對于治療外周血管損傷類顯得尤為重要。

血管的生成有賴于尖細(xì)胞（頂端細(xì)胞）和莖細(xì)胞（柄細(xì)胞）參與，而這兩種細(xì)胞都受血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的調(diào)控[3]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是由VEGR基因控制的，是當(dāng)今公認(rèn)的促進血管再生的細(xì)胞生長因子，也是刺激促血管生成途徑的始動因子。Notch信號通路是由Notch基因所調(diào)控的一種可以調(diào)節(jié)真核生物胚胎發(fā)育，細(xì)胞分化以及組織發(fā)生的高度原始的信號通路，對控制人體胚胎發(fā)育，組織生長以及維持體內(nèi)平衡起到重要作用[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)：Notch信號通路主要由4種Notch受體以及5種Notch配體以及相應(yīng)信號傳遞過程中的一些下游分子構(gòu)成，其中Notch受體主要包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4；Notch配體主要包括Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4等[5]。

Notch1、Notch4受體以及Dll1和Dll4配體在新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞都可以表達。但是有研究表明：Notch信號通路中的配體Dll4在血管內(nèi)皮上的尖細(xì)胞高度表達，在其他細(xì)胞中幾乎不表達，故而認(rèn)為Dll4在血管內(nèi)皮細(xì)胞生成過程中具有重要作用，并且，其在血管的生成以及穩(wěn)態(tài)的維持中起到關(guān)鍵作用[6]。Notch1、Notch4受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞中都可以表達，共同參與維持血管的形成以及血管的穩(wěn)定。因此，諸多學(xué)者認(rèn)為：VEGF-Dll4/Notch信號通路在新生血管生成過程以及穩(wěn)態(tài)血管維持中均重要的作用。

VEGF-Dll4/Notch信號通路在血管形成的過程中有諸多作用機制。已有研究證明，機體在缺氧狀態(tài)下，會釋放出大量的VEGF，激活Notch信號通路，上調(diào)Notch受體以及Dll4配體血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達，從而加快新生血管的建立[7]。其次，VEGF的在體內(nèi)的釋放也受到Dll4/Notch的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)機體中Dll4/Notch信號過度表達之后，會反饋性的下調(diào)VEGFR-2的釋放，上調(diào)VEGFR-1的釋放，從而防止血管的過度增生[8]。此外，VEGF-Dll4/Notch信號通路在血管形成中對于血管生成的諸多因子有一定的調(diào)控作用。

諸多臨床研究觀察到消腫止痛合劑對于外傷后機體的損傷、術(shù)后皮瓣的愈合均有很好的治療效果。趙萍[9]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑不僅可以提高VEGF在損傷機體中的表達，加快骨折部位新生血管的形成，還可以作為一種自分泌因子，調(diào)節(jié)骨折后骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化，從而促進骨折的愈合，但是該研究并沒有很好地表述消腫止痛合劑通過VEGF促進機體修復(fù)的潛在的作用機制。在此基礎(chǔ)上，何志軍等[10]、姚興章等[11]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑可以上調(diào)VEGFA、Notch和Dll4 mRNA的表達，激活VEGF-Dll4/Notch信號通路，從而加快大鼠損傷皮瓣部位新生血管的形成，減輕大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，以避免局部組織的缺氧壞死，促進皮瓣的修復(fù)，說明消腫止痛合劑可以改善大鼠皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，其作用機制可能與激活VEGF-Dll4/Notch信號通路有關(guān)。

2 通過AMPK/MTOR、PI3K/Akt信號通路治療KOA

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨損害為主的最常見的關(guān)節(jié)疾病，一般主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛，僵硬以及活動受限，由于關(guān)節(jié)軟骨的損害一般不可逆，故而在治療上主要以緩解癥狀、延緩病情發(fā)展等為主。膝關(guān)節(jié)是人體下肢主要的負(fù)重關(guān)節(jié)，所以膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）在臨床上較為多見，因此，預(yù)防膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)的進展對于患者功能的恢復(fù)尤為重要。有研究表明：通過調(diào)節(jié)AMPK/MTOR信號通路以及PI3K/Akt信號通路來提高機體的自噬能力，抑制細(xì)胞的凋亡過程，對骨與關(guān)節(jié)軟骨的有一定的保護作用[12－13]。

單磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK)是一種異源三聚體蛋白，是細(xì)胞能量代謝過程中的“調(diào)節(jié)器”以及“中繼站”，其可以通過相關(guān)通路調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）以及下游的相關(guān)因子（如ULK1，Beclin1、LC3等）的磷酸化，來調(diào)控細(xì)胞的能量代謝、自噬以及凋亡的過程，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。MTOR是細(xì)胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵蛋白，其可以通過調(diào)節(jié)自噬過程中下游分子的磷酸化，如：ULK1、Beclin1、AKT等分子來抑制細(xì)胞的自噬，加快細(xì)胞的凋亡。PI3K作為一種膜蛋白，起著接受、傳遞信號的作用，可以通過調(diào)節(jié)AKT以及下游分子調(diào)控細(xì)胞的凋亡以及自噬。AKT的激活可以調(diào)控細(xì)胞過程中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡[14]。

自噬是主要依賴溶酶體參與的，可以清除、降解體內(nèi)受損或衰老細(xì)胞，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的降解途徑。細(xì)胞凋亡是指由相關(guān)基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，一般處于動態(tài)平衡之中，當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)，凋亡過程就會加快，進一步加重機體的損傷。近幾年的研究表明，自噬存在于多種組織器官中，對于維持人體健康狀態(tài)以及抑制疾病的進展至關(guān)重要。細(xì)胞的自噬與凋亡是一個涉及到多種信號通路的過程，研究證實：細(xì)胞的自噬能力與其凋亡能力呈負(fù)相關(guān)。自噬的啟動主要依賴于ULK1-Atg13-FIP200激酶復(fù)合物形成并激活，當(dāng)機體處于一種應(yīng)激狀態(tài)，如缺氧、損傷等，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP比值升高，激活A(yù)MPK，活化的AMPK可以抑制MTOR的磷酸化，使其活性受到抑制，間接激活ULK1；并且，活化的AMPK可以使ULK1上的一些位點激活，直接激活ULK1，最終使得ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物形成并激活，啟動自噬[15]。在自噬的小體膜形成階段以及招募下游分子階段，Beclin1-Atg14L-VPS34激酶復(fù)合體的形成與激活十分重要，該復(fù)合體的形成過程受到AMPK、ULK1、AKT的調(diào)節(jié)，AMPK/ULK1可以通過磷酸化Beclin1來促進該復(fù)合體的形成，而PI3K、AKT的作用則正好相反[16]。

諸多臨床研究證明消腫止痛合劑在骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)置換、軟骨損傷等方面有很好的臨床效果。在此基礎(chǔ)上，李金鵬等[17]、敬勝偉等[18]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑可以顯著上調(diào)實驗動物軟骨內(nèi)的AMPK、Beclin1、LC3的表達，下調(diào)MTOR、AKT、PI3K以及MMPs的表達，從而提高實驗動物應(yīng)激狀態(tài)下軟骨細(xì)胞的自噬能力，減少軟骨細(xì)胞的凋亡，促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，延緩KOA的進展。

3 通過抑制NOS、MMP9治療ASCI

急性脊髓損傷（Acute Spinal Cord Injury,ASCI）是一種具有高致殘率的嚴(yán)重的損傷。在治療上主要以早期減輕脊髓神經(jīng)元繼發(fā)性損傷為主，研究表明，ASCI的患者早期體內(nèi)會出現(xiàn)大量的一氧化氮（NO），從而加重脊髓的損傷，并且，在炎癥因子的刺激下，細(xì)胞會啟動凋亡程序，進一步加重脊髓的損傷[19]。因此，如何減輕ASCI后體內(nèi)NO、炎癥因子的水平，以及防止細(xì)胞凋亡對于治療該疾病有重要意義。

NO在生理狀態(tài)下，可以防止血管痙攣，防止血小板聚集、黏附，調(diào)節(jié)機體血流量，對組織是一種保護的作用，這取決于一氧化氮合成酶（NOS）是處于一個相對于穩(wěn)定的水平。當(dāng)發(fā)生ASCI時，由于應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)的NOS的表達會顯著升高，產(chǎn)生大量NO調(diào)節(jié)局部血流，防止血栓形成，但是過量的NO可激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而升高cGMP，造成脊髓的水腫。此外，過量的NO還可以通過與超氧陰離子自由基（O2-）結(jié)合，形成過氧化硝基陰離子（OONO-）和羥自由基（OH-），造成脂質(zhì)過氧化，并且破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[20]。這些更加重了ASCI患者的病情。

抑制細(xì)胞凋亡可以防止ASCI的進一步加重。Caspase-3與caspase-9是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，caspase-9作為細(xì)胞凋亡的起始因子之一，可以最先將受損細(xì)胞中的死亡信號轉(zhuǎn)化為水解蛋白，并且激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子Caspase-3等，從而啟動細(xì)胞凋亡程序?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是MMP家族中較為重要的一種，可降解內(nèi)皮基底膜,使血腦屏障開放，有研究表明MMP-9參與細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)的過程[21]。

鄧強等[22]通過體外動物實驗研究發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑可以顯著下調(diào)ASCI模型大鼠體內(nèi)的NOS的水平，減輕NO引起的受損脊髓細(xì)胞的水腫以及局部炎癥因子的浸潤，并且消腫止痛合劑可以抑制脊髓受損部位Caspase-9、MMPs的表達，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡，對脊髓神經(jīng)元發(fā)揮一定的保護作用。

4 對TNF、IL-6等炎癥因子的影響

在創(chuàng)傷早期，由于應(yīng)激反應(yīng)，機體內(nèi)的腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1（IL-1）等促炎因子都會顯著升高。在這些炎癥因子的作用下，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)會被誘發(fā)，加快清除受損細(xì)胞，提高細(xì)胞凋亡的過程，不利于創(chuàng)傷后的恢復(fù)。

TNF是病理狀態(tài)下最早出現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，主要是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，其可以激活中性粒細(xì)胞及其淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)，如IL-1β、IL-6，從而產(chǎn)生“瀑布”效應(yīng)，加快炎癥反應(yīng)的進程[23]。IL-6、IL-1β是由多種炎癥細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的炎癥因子。IL-6不僅可以激活炎癥細(xì)胞、加快炎癥細(xì)胞的聚集與黏附，進而參與炎癥反應(yīng)，還可以促進受損細(xì)胞的凋亡，有研究表明：IL-6升高可以提高創(chuàng)傷或者術(shù)后疼痛感以及其他并發(fā)癥出現(xiàn)的概率[24]。IL-1β是IL-1細(xì)胞因子家族中具有促炎效果的細(xì)胞因子，其除了可以促進炎癥反應(yīng)，還可以破壞受損細(xì)胞線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞因能量代謝紊亂而死亡，從而加快凋亡的進程[25]。因此，在創(chuàng)傷后如何減輕體內(nèi)的炎癥因子的水平，在治療過程中尤為重要。

李玉吉等[26]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑可以顯著降低骨折后軟組織損傷患者血清中的TNF－α、IL-6水平，減少壞死的發(fā)生率，促進組織的修復(fù)。在此基礎(chǔ)上，李金鵬、鄧強等通過動物試驗研究發(fā)現(xiàn)：消腫止痛合劑可以顯著降低ASCI以及OA試驗動物血清中的TNF-α、IL-6、IL-1水平，減少炎癥細(xì)胞的黏附以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而大大提高損傷細(xì)胞的生存率。

5 小結(jié)

機體在挫傷、骨折以及開放性損傷等情況下，均會引起氣血損傷，血液溢于脈外，形成“離經(jīng)之血”，從而導(dǎo)致受損部位腫脹、疼痛、出血，嚴(yán)重者引起局部壞死。消腫止痛合劑具有活血化瘀、行氣止痛之效，方中桃仁、紅花、川芎可活血化瘀；赤芍、生地、當(dāng)歸可養(yǎng)血養(yǎng)陰活血，使得活血而不傷血；木香、青皮可行氣以活血，并有止痛之效；三七可化瘀止血、活血定痛，使得活血而不留淤；甘草可緩急止痛，亦可調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏活血化瘀、消腫止痛之效。已有研究證明：紅花、川芎、赤芍等藥物可以降低病理狀態(tài)下機體的炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，增強血管的穩(wěn)定性，促進血管的生成。近年來隨著科技的不斷發(fā)展，對于創(chuàng)傷后出現(xiàn)的血管損傷、軟組織壞死、缺血再灌注等并發(fā)癥的研究越來越深入，主要通過諸多信號通路探求其發(fā)病機制以及干預(yù)治療。與此同時，中醫(yī)藥在臨床上治療骨科疾病的療效日益突出，消腫止痛合劑作為一種院內(nèi)制劑，在臨床已使用多年，臨床效果顯著，可以很好地改善患者的病理狀態(tài)。

綜上所述，消腫止痛合劑通過作用于不同信號通路緩解炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡、提高自噬水平、促進新生血管的形成以及穩(wěn)定，從而產(chǎn)生治療效果，但消腫止痛合劑是否具有更廣泛的治療作用及臨床應(yīng)用價值，需要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進一步對該藥的作用機制進行深入研究。