長(zhǎng)鏈非編碼RNA與膽囊癌發(fā)生和發(fā)展以及化療耐藥的研究進(jìn)展

胡小強(qiáng)，陳 煒,

膽囊癌是膽囊上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤，位居消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第6 位[1]，全球膽囊癌發(fā)病率約為2/10 萬(wàn)[2]，中國(guó)2014 年膽囊癌發(fā)病率為3.82/10 萬(wàn)[3]。雖然膽囊癌的發(fā)病率并非最高，但其惡性程度較高，5 年生存率僅為5%～15%[4]。手術(shù)切除仍是目前可治愈膽囊癌的唯一方法。大樣本回顧性臨床研究的結(jié)果顯示，可手術(shù)切除膽囊癌患者的5 年生存率為39.6%，不可手術(shù)切除的晚期膽囊癌患者以及接受姑息性手術(shù)的膽囊癌患者的5 年生存率分別為5.4%和4.7%[4]。由于膽囊癌的早期癥狀不典型，因此不易被發(fā)現(xiàn)，常導(dǎo)致喪失最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)。此外，針對(duì)中晚期膽囊癌的治療方法有限，并且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和多藥耐藥[5]。因此，研究膽囊癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的機(jī)制尤為重要。

人類全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在人類基因組中，僅有2%的序列是編碼蛋白質(zhì)的序列，其余98%的序列是不翻譯蛋白質(zhì)的非編碼序列，而其中絕大多數(shù)可轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA 是指長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的由RNA 聚合酶Ⅱ從獨(dú)立啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA（盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些lncRNA 可以編碼小分子肽）。與蛋白編碼基因類似，lncRNA 的基因組位置以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的H3K4 三甲基化富集以及整個(gè)基因體富集H3K36 三甲基化為特征。lncRNA 轉(zhuǎn)錄本由多個(gè)外顯子組成，這些外顯子通過(guò)典型機(jī)制剪接成熟，通常包括3’poly(A)和5’帽結(jié)構(gòu)[6]。lncRNA 具有多種功能：（1）一些lncRNA 可與鄰近基因相互作用，招募染色質(zhì)修飾因子以增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄，也可以影響其他染色體上基因的轉(zhuǎn)錄；（2）一些lncRNA 會(huì)形成亞核結(jié)構(gòu)域，將某些蛋白質(zhì)招募至這些位點(diǎn)，形成的結(jié)構(gòu)域作為多功能基因調(diào)控結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；（3）還有一些lncRNA 被輸出至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中與特定的蛋白質(zhì)相互作用，影響信號(hào)通路，調(diào)節(jié)特定mRNA 的翻譯或充當(dāng)“miRNA 海綿（miRNA spong）”，與miRNA 形成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）關(guān)系[7]。隨著高通量測(cè)序和微陣列芯片等技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在大量異常表達(dá)的lncRNA，其中一些高表達(dá)且促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的lncRNA 被稱為促癌lncRNA；相應(yīng)地，低表達(dá)且抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的lncRNA 被稱為抑癌lncRNA。目前有關(guān)膽囊癌相關(guān)lncRNA 的功能學(xué)和機(jī)制學(xué)研究正不斷深入，但仍有許多異常表達(dá)的lncRNA 的功能尚未厘清，有待進(jìn)一步研究。本文圍繞膽囊癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNA 以及化療耐藥相關(guān)lncRNA 的功能和作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為臨床診治膽囊癌提供新的思路。

1 與膽囊癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA

逃避細(xì)胞凋亡、無(wú)限自我復(fù)制以及轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)是惡性腫瘤的3 大基本特征[8]。隨著研究的逐漸深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，多種lncRNA 在膽囊癌組織中表達(dá)異常，并且可以介導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程。多種lncRNA 與miRNA形成ceRNA 關(guān)系，共同調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)，從而影響膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展（圖1）。

1.1 HOTAIR

HOTAIR 是首個(gè)被證明具有反轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的基因間區(qū)lncRNA，其在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。TANG 等[9]通過(guò)應(yīng)用shRNA 敲低胰腺癌細(xì)胞系中HOTAIR 的表達(dá)，可以抑制Wnt/β-cantein 信號(hào)通路，從而削弱上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。DENG 等[10]研究證實(shí)，HOTAIR 可以通過(guò)抑制miR-34a 而激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。由此提示，HOTAIR 可能通過(guò)多種不同的機(jī)制影響胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

Fig.1 Potential mechanism of kinds of long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC).A: LncRNA,as a miRNA spong,regulates target gene expression via interacting with miRNA;B and C:Transcription factor binds to the promoter region of lncRNA gene and induces its transcription,and c-Myc and SP1 bind to the promoter region of HOTAIR and LINC00152 genes and induce their transcription respectively;D: FOXD2-AS1 could potentially recruit methyltransferase DNMT1 to the promoter region of the MLH1 gene and induce the resultant MLH1 transcription inhibition.CeRNA: Competing endogenous RNA.圖1 膽囊癌相關(guān)lncRNA 的作用機(jī)制

通過(guò)檢測(cè)65 例膽囊癌組織及其癌旁組織，MA 等[11]發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在膽囊癌組織中高表達(dá)，并且與T 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)；通過(guò)在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)HOTAIR 可能受轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 的直接調(diào)節(jié)，在GBC-SD 細(xì)胞中敲低c-Myc 的表達(dá)或使其過(guò)表達(dá)，HOTAIR 在RNA 水平的表達(dá)與c-Myc 的表達(dá)呈正相關(guān)；進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和ChIP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)c-Myc 可以直接結(jié)合至HOTAIR 啟動(dòng)子區(qū)域，從而上調(diào)HOTAIR 的表達(dá)（圖1B）；此外，在下游機(jī)制方面，HOTAIR 的促膽囊癌活性是通過(guò)直接負(fù)性調(diào)節(jié)miR-103a 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

1.2 LINC00152

LINC00152 又被稱為細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)RNA（cytoskeleton regulator RNA，CYTOR），其 在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在乳腺癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)LINC00152 可以直接結(jié)合KLF5 并增強(qiáng)其穩(wěn)定性；同時(shí)，KLF5 也可以直接結(jié)合至LINC00152 啟動(dòng)子區(qū)以激活后者轉(zhuǎn)錄，形成正反饋關(guān)系[12]。在胃癌中，LINC00152 通過(guò)結(jié)合EZH2 以調(diào)節(jié)CXCL9/CXCR3 軸介導(dǎo)的腫瘤組織中CD8+T 淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)[13]。在食管癌中，LINC00152 同樣與EZH2 互相作用，通過(guò)提高ZEB1 的表達(dá)，增強(qiáng)食管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及對(duì)奧沙利鉑的耐藥[14]。

有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00152 在膽囊癌中的表達(dá)水平顯著升高，并且與腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LINC00152 能夠明顯促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，LINC00152 可以通過(guò)PI3K/AKT 通路以發(fā)揮促癌作用，并且轉(zhuǎn)錄因子SP1 可誘導(dǎo)其過(guò)表達(dá)[15]（圖1C）。

1.3 H19

H19 基因位于11 號(hào)染色體靠近胰島素樣生長(zhǎng)因子2 基因的印跡區(qū)，在膀胱癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中均為高表達(dá)，不僅與惡性腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)，還參與化療耐藥。H19 不僅與p53 以及基因組的穩(wěn)定性有關(guān)，還與惡性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[16]。LUO 等[17]發(fā)現(xiàn)H19 在膀胱癌組織中高表達(dá)，可與EZH2 相互作用，抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，H19 在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中均為高表達(dá)，敲低H19 的表達(dá)可以在體內(nèi)外水平增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性，并且證實(shí)H19是通過(guò)SAHH/DNMT3B 軸誘導(dǎo)自噬以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥[18]。在三陰性乳腺癌中，H19 通過(guò)拮抗p53，提高腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白8 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。在獲得性表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑耐藥的肺癌體外模型和組織標(biāo)本中，研究人員發(fā)現(xiàn)H19 是一種表達(dá)顯著下調(diào)的lncRNA，同時(shí)證實(shí)表達(dá)下調(diào)的H19 通過(guò)上調(diào)丙酮酸激酶M2 的表達(dá)且與之相互作用，促進(jìn)AKT磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的耐藥[20]。

WANG 等[21]檢測(cè)了35 例膽囊癌以及正常膽囊組織中H19 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H19 的表達(dá)水平升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H19 可以通過(guò)ceRNA 作用，負(fù)性調(diào)節(jié)miR-342-3p，共同作用于靶基因FOXM1 以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。

1.4 MINCR

MINCR 即Myc 誘導(dǎo)的lncRNA，最早于Myc 陽(yáng)性淋巴瘤中被鑒定出來(lái)。研究人員利用Myc 誘導(dǎo)的細(xì)胞系以及有或無(wú)基因突變所致Myc 過(guò)表達(dá)的B 細(xì)胞淋巴瘤樣本開(kāi)展交叉RNAseq，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13 種差異表達(dá)的lncRNA，其中一種在Myc 陽(yáng)性淋巴瘤中與Myc 表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)的lncRNA 被命名為MINCR。敲低MINCR 的表達(dá)后，包括細(xì)胞因子調(diào)節(jié)激酶AURKA/B 和CDT1 等在內(nèi)的細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)均下調(diào)，因此MINCR 被認(rèn)為是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展[22]。在非小細(xì)胞肺癌中，MINCR 扮演著ceRNA 的作用，與miR-126 競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)靶基因SLC7A5 的表達(dá)，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且抑制細(xì)胞凋亡[23]。在結(jié)腸癌中，MINCR 與miR-708-5p 構(gòu)成ceRNA上調(diào)靶基因CTNNB1的表達(dá)，并且激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展[24]。

研究人員發(fā)現(xiàn)，MINCR 在膽囊癌中同樣為高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率均密切相關(guān)；敲低MINCR 的表達(dá)可以顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，MINCR 與miR-26a-5p 可形成ceRNA 作用，調(diào)節(jié)EZH2 的表達(dá)，進(jìn)而影響膽囊癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[25]。

1.5 PVT1

PVT1 在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤中均表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)或拷貝數(shù)增加，是一種候選癌基因（candidate oncogene）。研究發(fā)現(xiàn)，PVT1 可以通過(guò)穩(wěn)定核仁蛋白NOP2 以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，并且獲得干細(xì)胞樣特性[26]。在胃癌中，KONG 等[27]證實(shí)PVT1 與EZH2 相關(guān)，通過(guò)表觀調(diào)節(jié)p15 和p16 基因的表達(dá)以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在胰腺癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)PVT1 通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和競(jìng)爭(zhēng)miR-619-5p 以調(diào)節(jié)Pygo2 和ATG14 軸的自噬途徑，從而促進(jìn)胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥[28]。

通過(guò)對(duì)GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PVT1 在膽囊癌中同樣高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與TNM 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后均密切相關(guān)。敲低PVT1 的表達(dá)后可以抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PVT1 通過(guò)結(jié)合miR-143 并且抑制其表達(dá)，共同調(diào)節(jié)HK2 的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)膽囊癌細(xì)胞的糖代謝[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PVT1可以通過(guò)結(jié)合EZH2，將DNMT1 招募至miR-18b-5p 基因啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)DNA 甲基化抑制miR-18b-5p 基因轉(zhuǎn)錄；PVT1 與miR-18b-5p 相互競(jìng)爭(zhēng)，共同調(diào)節(jié)HIF1α 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膽囊癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[30]。

1.6 FOXD2-AS1

FOXD2-AS1 是FOXD2 基因反義鏈形成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中，F(xiàn)OXD2-AS1 與AKT/E2F1 形成負(fù)反饋環(huán)。FOXD2-AS1與TRIB3 啟動(dòng)子區(qū)形成RNA-DNA 復(fù)合物，抑制TRIB3 基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)E2F1 的表達(dá)，而E2F1 是細(xì)胞周期中G/S 期轉(zhuǎn)變的重要轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，E2F1 可與FOXD2-AS1 啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，增強(qiáng)FOXD2-AS1 的轉(zhuǎn)錄活性[31]。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)OXD2-AS1 通過(guò)與miR-185-5p 相互作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[32]。

利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，F(xiàn)OXD2-AS1 在膽囊癌組織中明顯高表達(dá)，而敲減FOXD2-AS1 的表達(dá)后，可抑制膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD2-AS1 通過(guò)招募DNMT1 以促進(jìn)MLH1 啟動(dòng)子區(qū)甲基化，從而抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膽囊癌的進(jìn)展[33]（圖1D）。

2 與膽囊癌化療耐藥相關(guān)的lncRNA

以吉西他濱為代表的一線化療藥物是局部進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性膽囊癌患者的主要治療方法，但是往往化療后不久即發(fā)生腫瘤迅速進(jìn)展，或是出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，與膽囊癌對(duì)吉西他濱耐藥有關(guān)。腫瘤細(xì)胞耐藥包括固有耐藥和獲得性耐藥[34]，涉及耐藥基因突變、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和表觀遺傳學(xué)等機(jī)制[35]。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA 在多種惡性腫瘤中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥[36]。在膽囊癌中已發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的lncRNA，包括GBCDRlnc1 和SSTR5-AS1，其在膽囊癌的化療耐藥中扮演重要角色。

2.1 GBCDRlnc1

GBCDRlnc1 是一種新命名的lncRNA。研究人員首先構(gòu)建了多柔比星耐藥的膽囊癌細(xì)胞株，與多柔比星敏感細(xì)胞株同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，獲得差異表達(dá)的lncRNA，其中GBCDRlnc1（ENST00000425894）是增強(qiáng)自噬活性以及與耐藥潛能最相關(guān)的lncRNA，并且GBCDRlnc1 在膽囊癌中明顯高表達(dá)，與預(yù)后顯著相關(guān)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，GBCDRlnc1 與PGK1 直接相互作用，通過(guò)抑制PGK1 泛素化而上調(diào)其蛋白的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以增強(qiáng)化療耐藥[37]（圖2A）。

2.2 SSTR5-AS1

SSTR5-AS1 是SSTR5 基因反義鏈的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。研究發(fā)現(xiàn)，SSTR5-AS1 在膽囊癌組織和細(xì)胞系中均表達(dá)升高，尤其是在吉西他濱耐藥的膽囊癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，并且其表達(dá)水平與膽囊癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。研究證實(shí)，SSTR5-AS1 通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以促進(jìn)吉西他濱耐藥，而敲低SSTR5-AS1 的表達(dá)可以增強(qiáng)膽囊癌耐藥細(xì)胞株對(duì)吉西他濱的敏感性。SSTR5-AS1 可與NONO 蛋白特異性結(jié)合，而NONO蛋白是一種參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和RNA 剪接的RNA 結(jié)合蛋白，可以通過(guò)蛋白酶體途徑降解。SSTR5-AS1 通過(guò)與NONO 蛋白結(jié)合后抑制其降解，從而升高NONO 蛋白的水平，參與膽囊癌細(xì)胞的化療耐藥[38]（圖2B）。

Fig.2 The potential mechanism of chemoresistance-associated long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC).A: GBCDRlnc1 promotes drug-resistance by interacting with PGK1 and inhibiting its ubiquitin-mediated degradation;B: SSTR5-AS1 enhances gemcitabine resistance via binding to NONO protein and inhibiting its degradation.圖2 膽囊癌相關(guān)lncRNA 耐化療機(jī)制

3 小結(jié)與展望

lncRNA 在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有不可忽視的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA不僅在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化以及胚胎發(fā)育等生理現(xiàn)象中扮演重要角色，也在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

lncRNA 在膽囊癌中的定位、表達(dá)、作用機(jī)制和功能的總結(jié)見(jiàn)表1。盡管數(shù)十年來(lái)的非編碼基因研究已揭示出許多重要的lncRNA，但尚有大量潛在的lncRNA 有待發(fā)現(xiàn)和研究。膽囊癌是惡性程度極高的惡性腫瘤，目前治療方法有限，治療效果差。鑒于當(dāng)前包括lncRNA 在內(nèi)的非編碼RNA 的高質(zhì)量研究還較少，研究的深度和廣度均不足，因此今后迫切需要開(kāi)展更多高質(zhì)量的研究以揭示膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制以及轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥的機(jī)制，提高膽囊癌的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期。

表1 lncRNA 在膽囊癌中的定位、表達(dá)、作用機(jī)制和功能Table 1 The localization,expression,mechanism and function of long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC)