在體單向腸灌流法研究胡黃連總苷中4個(gè)成分的大鼠腸吸收特性*

張琬靖 ，曹寧寧 ，李曉璇 ，裴帥 ，蔡楠 ，肖學(xué)鳳

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.成都先導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)股份有限公司研發(fā)化學(xué)中心，四川 610200；3.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開(kāi)發(fā)中心，天津 300410）

胡黃連總苷是從玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariiflora Pennll的干燥根莖，經(jīng)水提、大孔樹(shù)脂分離后得到的有效部位。胡黃連總苷主要含胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷等成分[1]，是天士力控股集團(tuán)研究院在研的中藥創(chuàng)新藥，于2012年6月取得臨床批件，臨床定位于治療非酒精性脂肪性肝炎。藥理研究表明，胡黃連總苷具有降血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)免疫、保肝抗炎等藥理作用[2-4]。目前，胡黃連總苷的腸吸收相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故本文對(duì)胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠的不同腸段吸收特性進(jìn)行探討，可為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

口服給藥是常用的給藥途徑，腸道為其主要吸收部位，藥物經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液而發(fā)揮藥效作用。考察藥物在腸道中的吸收特性，在一定程度上可反映藥物經(jīng)口服后整體的吸收情況[5-6]。因此，本研究采用大鼠在體單向腸灌流法，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)同時(shí)測(cè)定胡黃連總苷腸灌流液中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷共4個(gè)成分的濃度，以吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察4個(gè)成分分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收情況，闡明4個(gè)成分的腸吸收特性，旨在為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2030C高效液相色譜儀（包括LC-20AD二元泵，CTO-20AC柱溫箱，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，UV檢測(cè)器，LabSolutions工作站，日本島津公司）；EX-H3052百萬(wàn)分之一電子分析天平（上海贊維衡器有限公司）；TG16-WS高速離心機(jī)（湘儀CENCE公司）；KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；恒流蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；VORTEX 2渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；FE28 pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q型超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑與試藥 胡黃連總苷粉末由天士力控股集團(tuán)研究院提供（批號(hào)：20190101，胡黃連總苷中主要成分胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為38.32%）；胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：111727-201702，純度95.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：111596-201604，純度96.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；胡黃連苷Ⅲ對(duì)照品（批號(hào)：MUST-20090408，純度99.7%，成都曼斯特生物科技有限公司）；草夾竹桃苷對(duì)照品（批號(hào)：AF20100207，純度98.0%，成都埃法生物科技有限公司）；乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；冰醋酸（色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，體質(zhì)量 180～200 g，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：（22±2）℃，濕度（50±10）%，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和操作規(guī)程均遵守天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的相關(guān)規(guī)定（倫理審查編號(hào)：TCM-LAEC2022193）。

2 方法與結(jié)果

2.1 胡黃連總苷制備工藝 稱取適量胡黃連粗粉，加適量純水浸泡，以純水滲漉，收集滲漉液，濃縮至相當(dāng)于1 g/mL原藥材的濃縮液。經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，以純水、乙醇洗脫，收集洗脫液、濃縮、冷凍干燥，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮、真空干燥，得胡黃連總苷。

2.2 Kreb-Ringer’s（K-R）緩沖液的配制 精密稱取氯化鈣0.37 g，氯化鈉7.80 g，氯化鉀0.35 g，碳酸氫鈉1.37 g，磷酸二氫鈉0.32 g，加適量純水使其溶解，再加入氯化鎂0.02 g，葡萄糖1.40 g，充分混勻，加純水定容至1 000 mL，用1 mol/L磷酸調(diào)pH至6.8，即得K-R緩沖液。

2.3 空白灌流液的制備 取健康SD大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，沿腹腔中線打開(kāi)腹腔，于十二指腸上部和結(jié)腸下部?jī)啥饲锌?，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈后插管，結(jié)扎固定。傷口處用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕，紅外燈照射大鼠腹部保溫。

用預(yù)熱至37℃的K-R緩沖液以1 mL/min的流速灌流，待腸段內(nèi)充滿K-R緩沖液時(shí)，將流速降低至0.2 mL/min，灌流平衡30 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)。進(jìn)口瓶裝有K-R緩沖液，出口瓶用于收集流出灌流液，收集120 min的灌流液，流出灌流液離心半徑10 cm，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液，合并，即得空白灌流液。

2.4 胡黃連總苷灌流液的配制 精密稱取胡黃連總苷粉末0.10 g，置于200 mL容量瓶，用K-R緩沖液溶解并定容，配制成濃度為0.5 mg/mL的胡黃連總苷灌流液。

2.5 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷對(duì)照品適量，分別用50%乙腈溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的各對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加空白灌流液稀釋，配制成胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷濃度分別為 200、200、50、50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.6 色譜條件 WondaSilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（15.5∶84.5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性 分別取空白灌流液、混合對(duì)照品溶液和胡黃連總苷灌流液適量，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖，如圖1所示。結(jié)果顯示，空白灌流液對(duì)胡黃連總苷中4個(gè)成分的測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 胡黃連總苷中4個(gè)成分的專屬性Fig.1 Specificity of 4 components of TGPS

2.7.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限 精密移取“2.5”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用空白灌流液稀釋，分別配制成胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ濃度均為200、160、80、40、20、10 μg/mL，胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷濃度均為 50、40、20、10、5、2.5 μg/mL 的對(duì)照品溶液。按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，以信噪比（S/N）為3時(shí)的濃度作為各成分的檢測(cè)限，S/N為10時(shí)的濃度為各成分的定量限。胡黃連總苷中4個(gè)成分的線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4個(gè)成分的線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限Tab.1 Investigation results of linear relationship of 4 components

結(jié)果表明，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.7.3 精密度 精密稱取6份胡黃連總苷粉末，按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，并按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算胡黃連總苷中4個(gè)成分峰面積RSD，以考察其精密度。結(jié)果顯示，胡黃連總苷中4個(gè)成分峰面積的RSD分別為：胡黃連苷Ⅰ0.87%、胡黃連苷Ⅱ0.52%、胡黃連苷Ⅳ0.92%、草夾竹桃苷0.98%，表明該儀器精密度良好。

2.7.4 加樣回收率 精密稱取6份胡黃連總苷粉末，每份約0.1 g，精密加入胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下配制方法，配制供試品溶液，并按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率、平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4個(gè)成分的加樣回收率Tab.2 Recovery test of 4 components

結(jié)果顯示，胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷的平均加樣回收率分別為99.82%、99.16%、99.74%、99.51%，加樣回收率RSD均小于0.89%，表明該方法加樣回收率良好。

2.7.5 穩(wěn)定性 精密稱取胡黃連總苷粉末適量，按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，置37℃水浴中，分別于第 0、2、4、8、12、24 h 取樣，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，胡黃連總苷中4個(gè)成分的峰面積RSD分別為：胡黃連苷Ⅰ0.89%、胡黃連苷Ⅱ0.74%、胡黃連苷Ⅳ0.90%、草夾竹桃苷0.83%，表明各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.6 耐用性 精密稱取胡黃連總苷粉末適量，按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液。在“2.6”色譜條件基礎(chǔ)上，改變色譜柱、柱溫、流速及流動(dòng)相比例，測(cè)定供試品溶液中各成分含量，并計(jì)算RSD，以考察該方法的耐用性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4個(gè)成分的耐用性Tab.3 Durability test of 4 components

結(jié)果顯示，胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷含量RSD均小于0.93%，表明測(cè)定條件小的變動(dòng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，該方法具有較好的耐用性。

2.8 大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)

2.8.1 在體單向腸灌流法 為保證大鼠腸道良好的吸收狀態(tài)，每只大鼠僅使用單一腸段進(jìn)行單次試驗(yàn)。取健康SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組，分別為十二指腸組、空腸組、回腸組和結(jié)腸組，每組6只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，自由飲水，腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，沿腹腔中線打開(kāi)腹腔，選取需要考察的腸段約10 cm（不同腸段區(qū)間：十二指腸為距幽門(mén)1 cm處開(kāi)始，空腸為距幽門(mén)15 cm處開(kāi)始，回腸為距盲腸上行20 cm處開(kāi)始，結(jié)腸為距盲腸后端開(kāi)始）。于所選腸段兩端切口，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈后插管，結(jié)扎固定。傷口處用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕，紅外燈照射大鼠腹部保溫。

用預(yù)熱至37℃的胡黃連總苷灌流液以1mL/min的流速灌流，待腸段內(nèi)充滿胡黃連總苷灌流液時(shí)，將流速降低至0.2 mL/min，灌流平衡30 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)。進(jìn)口瓶裝有胡黃連總苷灌流液，為流入灌流液；出口瓶用于收集流出灌流液，進(jìn)口瓶和出口瓶均提前稱重，每隔15 min更換進(jìn)口瓶和出口瓶，同時(shí)記錄進(jìn)口瓶和出口瓶的質(zhì)量，共收集8個(gè)時(shí)間段的流出灌流液，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)長(zhǎng)120 min，流出灌流液離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，剪下所考察腸段，測(cè)量不同腸段長(zhǎng)度（L）和周長(zhǎng)，由3次周長(zhǎng)測(cè)量值求得平均半徑（R）。

2.8.2 腸吸收參數(shù)計(jì)算 采用重量法對(duì)流入灌流液和流出灌流液體積和密度進(jìn)行校正，消除灌流液體積和密度變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響[7]。精密吸取1.0 mL流入灌流液，置于已知質(zhì)量的玻璃瓶中，稱量液體質(zhì)量，計(jì)算流入灌流液密度ρin；精密吸取1.0 mL流出灌流液，置于已知質(zhì)量的玻璃瓶中，稱量液體質(zhì)量，計(jì)算流出灌流液密度ρout。按下列公式計(jì)算腸吸收參數(shù)吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff），以此分析胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的腸吸收特性。

其中Vin、Vout分別為流入灌流液體積、流出灌流液體積（mL）；Min、Mout分別為流入灌流液質(zhì)量、流出灌流液質(zhì)量（g）；Cin、Cout分別為流入灌流液中各成分濃度、流出灌流液中各成分濃度（μg/mL）；R、L為被考察腸段的半徑、長(zhǎng)度（cm）；Q為灌流速度（0.2 mL/min）。

2.8.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.8.4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收特性 取濃度為0.5 mg/mL的胡黃連總苷灌流液，采用在體單向腸灌流法進(jìn)行灌流，以腸吸收參數(shù)Ka和Peff為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷共4個(gè)成分分別在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收特性。其中Ka代表成分從吸收部位進(jìn)入體循環(huán)的速度，反映成分在不同腸段中的吸收快慢，Ka越大，表明成分在該腸段中的吸收越快；Peff代表成分透過(guò)生物膜的滲透能力，反映成分在不同腸段中的吸收能力的強(qiáng)弱[8]。一般當(dāng)Peff>2.0×10-5cm/min 時(shí)，表明成分在該腸段中吸收良好[9]。胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)見(jiàn)表4和表5，4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)比較Fig.2 Compare with Kaand Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments

表4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)（±s，n=6）Tab.4 Kaof 4 components of TGPS in different intestinal segments（±s，n=6）

表4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)（±s，n=6）Tab.4 Kaof 4 components of TGPS in different intestinal segments（±s，n=6）

注：與十二指腸比較，*P＜0.05；與空腸比較，#P＜0.05；與回腸比較，△P＜0.05。

成分Ka（×10-2/min）十二指腸 空腸 回腸 結(jié)腸胡黃連苷Ⅰ 1.91±0.11 1.97±0.33 1.79±0.16 1.98±0.13胡黃連苷Ⅱ 2.24±0.16 1.76±0.26* 1.84±0.38* 1.65±0.21*△胡黃連苷Ⅳ 2.10±0.26 2.41±0.14* 2.17±0.15# 1.73±0.17*#△草夾竹桃苷 2.28±0.16 2.72±0.21* 3.83±0.31*#4.97±0.36*#△

表5 胡黃連總苷4個(gè)成分在不同腸段的有效滲透系數(shù)（±s，n=6）Tab.5 Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments（±s，n=6）

表5 胡黃連總苷4個(gè)成分在不同腸段的有效滲透系數(shù)（±s，n=6）Tab.5 Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments（±s，n=6）

注：與十二指腸比較，*P＜0.05；與空腸比較，#P＜0.05；與回腸比較，△P＜0.05。

成分Peff（×10-3cm/min）十二指腸 空腸 回腸 結(jié)腸胡黃連苷Ⅰ 2.04±0.11 2.11±0.13 1.99±0.20 2.19±0.17△胡黃連苷Ⅱ 2.46±0.22 1.83±0.17* 2.22±0.25*#1.79±0.18*△胡黃連苷Ⅳ 2.27±0.22 2.65±0.28* 2.29±0.26# 2.12±0.14#草夾竹桃苷 2.47±0.31 2.91±0.24* 5.05±0.43*#6.23±0.27*#△

由表可知，胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段均 Ka＞1.65×10-2/min，Peff＞2.0×10-5cm/min，表明各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好，即各成分在不同腸段均易吸收，但各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異。通過(guò)比較不同腸段的Ka、Peff值，結(jié)果顯示：1）胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋航Y(jié)腸＞空腸＞十二指腸＞回腸，其中，除結(jié)腸與回腸的Peff值有顯著性差異（P＜0.05），其余參數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），因此，胡黃連苷Ⅰ無(wú)主要吸收部位。2）胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅱ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋菏改c＞回腸＞空腸＞結(jié)腸，其中，十二指腸和回腸、結(jié)腸、空腸的Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此，十二指腸為胡黃連苷Ⅱ的主要吸收部位。3）胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅳ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋嚎漳c＞回腸＞十二指腸＞結(jié)腸，其中，空腸和回腸、十二指腸、結(jié)腸的Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此，空腸為胡黃連苷Ⅳ的主要吸收部位。4）胡黃連總苷中草夾竹桃苷在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋航Y(jié)腸＞回腸＞空腸＞十二指腸，其中，結(jié)腸和回腸、空腸、十二指腸的 Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此，結(jié)腸為草夾竹桃苷的主要吸收部位。

比較胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的Ka、Peff值，結(jié)果顯示，各成分的 Ka、Peff值大小順序?yàn)椋涸谑改c中，草夾竹桃苷＞胡黃連苷Ⅱ＞胡黃連苷Ⅳ＞胡黃連苷Ⅰ；在空腸中，草夾竹桃苷＞胡黃連苷Ⅳ＞胡黃連苷Ⅰ＞胡黃連苷Ⅱ；在回腸中，草夾竹桃苷＞胡黃連苷Ⅳ＞胡黃連苷Ⅱ＞胡黃連苷Ⅰ；在結(jié)腸中，草夾竹桃苷＞胡黃連苷Ⅰ＞胡黃連苷Ⅳ＞胡黃連苷Ⅱ。值得注意的是，在不同腸段中，草夾竹桃苷與其他3個(gè)成分比較，Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且其在不同腸段的吸收均最佳。

3 討論

3.1 腸吸收研究方法的選擇 影響口服藥物的藥效因素眾多，除藥物的化學(xué)成分復(fù)雜外，其在體內(nèi)的吸收過(guò)程也是重要影響因素[10]。腸吸收作為口服藥物的主要吸收途徑，目前對(duì)其的研究方法主要有3種，分別為體外法、體內(nèi)法和在體法[11]。體外法主要有2種研究方法，分別為外翻腸囊法和Caco-2細(xì)胞模型法，其操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短，可用于藥物早期高通量篩選，但體外環(huán)境無(wú)法保證血液的正常供應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)的完整性，生物活性較差，不能反映藥物在腸道環(huán)境中的真實(shí)吸收情況[12-13]；體內(nèi)法主要研究方法為血藥濃度法，采用整體動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，能真實(shí)地反映藥物經(jīng)口服后在體內(nèi)的吸收情況，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，影響因素較多，無(wú)法特異性地反映藥物在腸道的吸收特性[14]；在體法主要研究方法為循環(huán)腸灌流法和單向腸灌流法，前者灌流時(shí)間長(zhǎng)、流速快，易損傷腸黏膜，而單向腸灌流法由于具有灌流時(shí)間短、流速低等特點(diǎn)，對(duì)腸黏膜的影響較小，可模擬真實(shí)的腸道環(huán)境，且此方法已被美國(guó)FDA認(rèn)可，應(yīng)用廣泛[15-16]，因此，本課題采用在體單向腸灌流法研究胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性，整體反映藥物在腸道的吸收情況。

3.2 灌流液體積校正方法的選擇 在體單向腸灌流過(guò)程中，腸道不僅吸收藥物，同時(shí)也會(huì)吸收或分泌水分，導(dǎo)致直接測(cè)得的藥物濃度與實(shí)際藥物濃度之間有偏差。此外，由于在腸灌流過(guò)程中，可能會(huì)引起腸壁細(xì)胞溶蝕破裂、腸黏膜脫落等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致流出灌流液密度發(fā)生變化，故需通過(guò)校正流出灌流液的體積和密度，以校正藥物濃度，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[17]。灌流液體積和密度的校正方法主要有2種，分別為標(biāo)示物法和重量法[18]。標(biāo)示物法是指在灌流液中加入不易被腸道吸收的物質(zhì)作為標(biāo)示物，以標(biāo)示物為參照量對(duì)藥物濃度進(jìn)行校正，常用的標(biāo)示物為酚紅和14C-PEG[19]，但研究顯示，腸道對(duì)酚紅存在一定程度的吸收，且酚紅可能干擾某些成分的轉(zhuǎn)運(yùn)和分析測(cè)定，不適于對(duì)所有成分的腸吸收研究[20]；14C-PEG具有放射性，安全性和檢測(cè)方法的復(fù)雜性制約其在普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[21]。重量法通過(guò)計(jì)算流入和流出腸道的灌流液質(zhì)量比對(duì)藥物濃度進(jìn)行校正，可節(jié)省檢測(cè)標(biāo)示物濃度的過(guò)程，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，同時(shí)可真實(shí)地反映藥物在腸道的吸收情況[22]。因此，本課題采用重量法對(duì)灌流液體積和密度進(jìn)行校正，消除灌流液體積和密度的變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

3.3 胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性 本研究以Ka和Peff為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察胡黃連總苷中4個(gè)成分分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收情況，以闡明胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好，即4個(gè)成分在不同腸段均易吸收。但在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異，推測(cè)可能與各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，胡黃連總苷中4個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

圖3 胡黃連總苷中4個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of 4 components of TGPS

胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷1、胡黃連苷3均為環(huán)烯醚萜苷類成分，其中，胡黃連苷I為肉桂酸與糖酯化生成的一種環(huán)烯醚萜苷，其苯環(huán)上無(wú)酚羥基等酸性基團(tuán)和甲氧基等供電子基團(tuán)，故胡黃連苷Ⅰ顯中性，推測(cè)此可能為胡黃連苷Ⅰ無(wú)主要吸收部位的原因。胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅳ均在胡黃連苷Ⅰ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入酚羥基，酚羥基顯酸性，但由于其它基團(tuán)的存在導(dǎo)致各成分的酸性程度有所差異。其中，胡黃連苷Ⅱ酸性最強(qiáng)，主要吸收部位在十二指腸；胡黃連苷Ⅱ中酚羥基對(duì)位為碳氧雙鍵，而胡黃連苷Ⅳ中酚羥基對(duì)位為碳碳雙鍵，碳碳雙鍵的吸電子能力弱于碳氧雙鍵，導(dǎo)致胡黃連苷Ⅳ酸性減弱，其吸收部位向后移動(dòng)，故胡黃連苷Ⅳ主要吸收部位在空腸；草夾竹桃苷為苯乙酮苷類成分，苯乙酮母核呈中性，但由于其酚羥基鄰位為甲氧基，甲氧基作為供電子基團(tuán)可減弱草夾竹桃苷的酸性[23]，導(dǎo)致其吸收部位后移，主要在結(jié)腸被吸收。此外，與胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ相比，草夾竹桃苷在不同腸段中吸收最好，可能與其分子量較小，較易透過(guò)生物膜有關(guān)。因此，初步推斷，胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收程度不同與各成分中酚羥基、碳碳雙鍵、甲氧基等基團(tuán)位置和分子量大小有關(guān)。

綜上，本研究考察了胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收特性，結(jié)果表明，胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好，但各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異。其中，胡黃連苷Ⅰ無(wú)主要吸收部位；胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷的主要吸收部位分別為十二指腸、空腸和結(jié)腸；草夾竹桃苷與其他3個(gè)成分比較，在不同腸段中吸收均最佳，為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供明確參考。