不同成熟期草莓果實風(fēng)味指紋圖譜構(gòu)建及差異分析

蔡冰冰，李 寧，李 成，薛占軍，李青云

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北省蔬菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）屬薔薇科草莓屬的多年生草本植物［1］，因其酸甜可口、營養(yǎng)價值高而深受大眾的喜愛，享有“水果皇后”的美譽［2］。果實香氣是人們通過嗅覺可以感覺到的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，它與水果的品質(zhì)、加工特性及營養(yǎng)價值密切相關(guān)［3］，既是衡量草莓品質(zhì)的重要指標(biāo)，又是吸引消費者和增強市場競爭力的重要因素［3-4］。由于消費需求和栽培模式的差異，不同國家選育和主栽的草莓品種在品質(zhì)特性方面存在差異。歐美品種產(chǎn)量高、抗性強，但是香味淡；而日本品種香味濃、甜度高，但抗性較差、不耐儲運［5］。根據(jù)我國消費者的消費需求，我國草莓生產(chǎn)多引自日本，近年來隨著我國草莓研究的不斷深入，也陸續(xù)培育出眾多產(chǎn)量高、果形好、香味濃郁的國產(chǎn)品種，并備受消費者好評［6］。河北省保定市是全國重要的草莓種植基地，因此分析草莓果實的香氣成分，可以為改良草莓香氣品質(zhì)、培育新品種以及種質(zhì)資源的保存和利用提供理論依據(jù)［8］。目前，在草莓果實中檢測并鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)360 余種，主要為酯類、醇類、醛類、酮類、萜烯類、呋喃類及含硫化合物等［9-12］，其中酯類物質(zhì)含量最多?；蛐褪怯绊懝麑崜]發(fā)性香氣成分的主要因素，另外，果實成熟度、氣候條件、栽培方式、采后處理等也會影響水果香氣成分的組成和含量［13-19］。

氣象色譜-離子遷移譜（Gas Chromatography-Ion mobility spectrometry，GC-IMS）是20 世紀(jì)60年代末70 年代初發(fā)展起來的一種氣體分離和快檢技術(shù)，該技術(shù)基于氣相中不同離子在電場中遷移速度的差異，從而對化學(xué)離子物質(zhì)進(jìn)行表征［20］。該技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的分離能力和遷移離子譜快速響應(yīng)的優(yōu)勢［21］，克服了離子遷移譜技術(shù)分離度差的局限性［22］，具有分辨率高、靈敏度高、選擇性強、分析高效、操作簡便等特點，已經(jīng)應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測等多個領(lǐng)域［23-29］。

但是，目前缺少基于GC-IMS 技術(shù)分析不同品種草莓不同成熟期揮發(fā)性有機物質(zhì)的研究。因此，本試驗以滿城區(qū)沃土現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)的3 個不同草莓品種為試材，采用GC-IMS 技術(shù)，結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、模型驗證及重要變 量 投 影（Variable importance in the projection，VIP）值分析等化學(xué)計量學(xué)方法，構(gòu)建指紋圖譜及成分含量變化熱圖，討論不同草莓品種揮發(fā)性香氣成分差異及不同成熟期果實揮發(fā)性化合物含量的變化，為草莓優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)、品質(zhì)鑒定、貯藏保鮮和風(fēng)味育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓‘香野’‘圣誕紅’‘紅顏’草莓于 2022年 1 月 12 日采自保定市滿城區(qū)沃土現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)，草莓在磚墻日光溫室內(nèi)采用高架椰糠基質(zhì)栽培，追施‘圣誕樹’牌水溶肥和氨基酸肥，并于當(dāng)日送達(dá)實驗室。選用大小均勻、無病蟲害、無機械損傷的草莓白果期、粉色轉(zhuǎn)色期（50% 粉色）、紅色成熟期果實，對揮發(fā)性有機物含量進(jìn)行檢測。

2- 甲 基-3 庚 酮 購 自 德 國 Dr.Ehrenstorfer 公司。Flavour spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 購自德國G.A.S 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 GC-IMS 分析條件 參考王福成等［30］的方法。

（1）自動進(jìn)樣條件：準(zhǔn)確稱取2.5 g 草莓樣品置于20 mL 頂空瓶中；將頂空瓶中的樣品進(jìn)行孵化，孵化溫度為40 ℃；振蕩器轉(zhuǎn)速為500 r/min；孵化時間為10 min；使用加熱的進(jìn)樣針抽取瓶內(nèi)的頂空組分，進(jìn)樣針溫度為85 ℃；進(jìn)樣體積為1.0 mL；以2-甲基-3 庚酮（色譜純）作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過GC-IMS 分析揮發(fā)性有機物。

（2）GC 條件：色譜柱溫度為 60 ℃；運行時間40 min；載氣為氮氣（≥99.999%）；載氣流量：0 ～2 min：2 mL/min；2 ～10 min：2 ～15 mL/min；10 ～25 min：15 ～100 mL/min；25 ～30 min：100 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GC-IMS 儀器配套的VOCal 軟件（內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫）對樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行定性分析，利用Reporter 和Gallery Plot 插件對比指紋圖譜的差異；借助Dynamic PCA插件對樣品進(jìn)行聚類分析，以確定未知樣品的種類；采用SIMCA 14.1 進(jìn)行PLS-DA 分析；應(yīng)用TBtools軟件繪制相關(guān)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓樣品中揮發(fā)性有機物定性分析

為了分析不同品種草莓在不同成熟期揮發(fā)性化合物的含量變化，使用 GC-IMS 中 Library Search內(nèi)置的 NIST 2014 數(shù)據(jù)庫和 IMS 數(shù)據(jù)庫對檢測出的揮發(fā)性有機物進(jìn)行定性分析。共檢測出有機物 54 種，可以定性的有機物 53 種。其中，酯類 16 種，醇類11 種，醛類 9 種，酮類 8 種，醚類 3 種，吡嗪類 2 種，酸類、烯烴類、硫類各 1 種。各化合物的定性信息如表 1 所示。

表1 揮發(fā)性有機物定性信息Table 1 Qualitative information of volatile organic compounds

續(xù)表：

2.2 不同品種草莓果實中的香氣物質(zhì)種類及含量

從整體來看，酯類物質(zhì)在 3 個品種草莓果實中的含量最高，其在 3 個品種中的含量按照從大到小的順序排列為：‘圣誕紅’＞‘紅顏’＞‘香野’，分別為172.02、170.10 和 169.37 μg/g，可能是草莓果實呈現(xiàn)香氣的主要揮發(fā)性物質(zhì)，醇類、醛類、酮類、醚類物質(zhì)含量相對較高，吡嗪類、酸類、烯烴類、硫類含量較小。

表2 不同品種草莓香氣物質(zhì)種類及含量比較Table 2 Comparison of aroma substance and content of different strawberry varieties

2.3 不同品種草莓果實中的香氣成分分析

在 3 個品種的草莓果實中共鑒定出定性的揮發(fā)性香氣物質(zhì) 53 種。在酯類物質(zhì)中，己酸甲酯、丁酸乙酯在 3 個品種草莓果實中含量最高，品種間無顯著性差異，丁酸甲酯在 3 個品種草莓果實中含量較高，且‘香野’和‘圣誕紅’中得含量顯著高于‘紅顏’；醇類物質(zhì)中，乙醇在 3 給品種草莓果實中得含量均大于5.0 μg/g，且品種間無顯著性差異，另外，甲基苯甲醇、5-甲基-2-呋喃甲醇在‘香野’和‘圣誕紅’中的含量較高，且顯著高于‘紅顏’；在醛類物質(zhì)中，3 個品種中丁醛的含量最高，且品種間無顯著性差異；在酮類物質(zhì)中，3-戊酮在‘香野’和‘圣誕紅’中含量最高，且顯著高于‘紅顏’；醚類物質(zhì)中，甲基叔丁基醚在‘香野’中含量最高，與‘紅顏’無顯著性差異，顯著高于‘圣誕紅’。另外，3個草莓品種果實中均檢測到未定性的化合物。

2.4 不同品種草莓在不同成熟期揮發(fā)性有機物指紋圖譜差異

揮發(fā)性有機物的指紋圖譜可以更直觀的展示揮發(fā)性有機物組分的差異。結(jié)果表明，隨著果實成熟度增加，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了明顯的變化。結(jié)合聚類熱圖及數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大部分有機物含量均隨著果實成熟度的增加，而顯著增加。

表3 不同品種草莓中揮發(fā)性有機物含量Table 3 Content of volatile organic compounds in different varieties strawberries

圖1 3 種草莓品種果實不同成熟期揮發(fā)性有機物指紋圖譜Fig. 1 Finger print of volatile organic compounds in different varieties strawberries

2.5 不同品種草莓在不同成熟期時的揮發(fā)性有機物的主成分分析

PCA 是多元統(tǒng)計分析中常見的數(shù)據(jù)分析方法，PCA 可以根據(jù)不同樣本中的主要成分因子的貢獻(xiàn)率來評估樣品之間的規(guī)律性和差異性。將試驗測定的54 種揮發(fā)性有機物進(jìn)行 PCA 分析，結(jié)果表明，第一主成分的貢獻(xiàn)率為 48.44%，第二主成分貢獻(xiàn)率為23.54%，這2 個主成分累計貢獻(xiàn)率為 71.99%。組內(nèi)各樣品相對距離較近，說明樣品的重復(fù)性較好。不同成熟期，3 個草莓品種基本分布在不同區(qū)域，表明樣品之間的揮發(fā)性有機物存在差異。其中，在白果期和粉果期，揮發(fā)性有機物含量差異較??；在紅果期，草莓果實中揮發(fā)性有機物含量變化最為明顯。說明紅果成熟期，草莓果實的風(fēng)味變化最大。

圖2 不同成熟期草莓果實中揮發(fā)性有機物的 PCA 得分圖Fig. 2 PCA scores of volatile organic compounds in strawberry fruits in different maturity stages

2.6 不同品種草莓不同成熟期果實中揮發(fā)性有機物的偏最小二乘法判別分析

PLS-DA 通過降維將復(fù)雜數(shù)據(jù)直觀化，PLS-DA具有監(jiān)督分析的功能，屬于模型方法，可以預(yù)設(shè)分類，彌補 PCA 方法的不足，強化組間的差異。相同處理樣品分布點距離越近，說明這些樣品中所含有的化合物的組成和含量越接近。為進(jìn)一步分析草莓果實不同成熟期的差異性揮發(fā)性有機物，基于已測定的54 種揮發(fā)性有機物，采用 PLS-DA 方法分析不同成熟期對揮發(fā)性有機物含量的影響。結(jié)果如圖 3 所示，數(shù)據(jù)的分類算法效果較好，可以將不同成熟期樣本點分開，其中紅果期區(qū)分最明顯。說明不同成熟期的草莓果實內(nèi)在有機物成分存在一定差異，其中紅果期差異最明顯。

圖3 不同成熟期草莓果實中揮發(fā)性有機物 PLS-DA 得分圖Fig. 3 PLS-DA scores of volatile organic compounds in strawberry fruits in different stages

2.7 不同品種草莓果實不同成熟期的特征揮發(fā)性有機物分析

變量投影重要性（Variable Important for the Projection, VIP）可以量化PLS-DA 的每個變量對分類的貢獻(xiàn)，通常認(rèn)為 VIP 大于 1 表示在判別過程中有重要貢獻(xiàn)。如圖 4 所示，共得到 29 種 VIP 值大于 1 的揮發(fā)性有機物。除去未定性的化合物，并結(jié)合方差分析，雖然己酸甲酯和丁酸乙酯在3 個品種草莓果實種含量均較高，但是品種間無顯著性差異（P＞0.05），因此得出 26 種可以用來判別不同品種草莓果實的特征風(fēng)味物質(zhì)，分別為丁酸丁酯、己酸甲酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、異戊酸甲酯、乳酸乙酯、丙烯酸乙酯、醋酸異丙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、2-己烯醇、3-甲基-1-戊醇、反式-2-己烯-1-醇、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醛、異丁醛、己醛、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、3-羥基-2-丁酮、3-戊酮、二乙二醇二甲醚、2-蒎烯和二烯丙基二硫。結(jié)合不同品種果實不同成熟期揮發(fā)性有機物含量變化熱圖，丁酸丁酯、己酸甲酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸甲酯、丙烯酸乙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、二乙二醇二甲醚、二烯丙基二硫在3 個品種草莓果實的紅果期，含量均顯著增加。

圖4 揮發(fā)性有機物 VIP 得分圖Fig. 4 VIP score of volatile organic compounds

3 討論

草莓是香味物質(zhì)種類最豐富的水果之一，成熟草莓果實中含有多種揮發(fā)性的香氣成分，果實的香氣也是由若干種芳香類物質(zhì)共同發(fā)揮作用，并且當(dāng)含量超過感知閾值時形成的［31-32］。本試驗通過對 3種不同草莓品種成熟期果實中揮發(fā)性有機物檢測及主成分分析，發(fā)現(xiàn)酯類在所有品系中種類最多，己酸甲酯和丁酸乙酯在 3 個品種中的相對濃度最高；醇類、醛類、酮類和醚類化合物在果實香味形成中也有重要作用。高含量的酯類物質(zhì)可以呈現(xiàn)出令人愉悅的果香味［33］。

趙娜［34］對‘章姬’‘甜查理’‘隋珠’‘圣誕紅’‘紅顏’和‘艷麗’ 6 個品種草莓進(jìn)行香氣成分測定，發(fā)現(xiàn)香氣物質(zhì)種類及相對含量以酯類化合物最多；王娟等［35］測定了‘京桃香’‘白雪公主-15’‘白雪公主-6’‘香山公主’‘玫瑰公主’‘玉泉公主’‘紅顏’‘甜查理’ 8 個草莓品種的揮發(fā)性化合物種類及相對含量，得到了與之一致的結(jié)論。張運濤等［36］對‘紅顏’‘章姬’‘櫪乙女’‘甜查理’‘卡姆羅莎’5 個草莓品種進(jìn)行香氣成分測定，結(jié)果顯示酯類物質(zhì)含量最多，與本試驗的結(jié)果一致。由此可以判斷，酯類物質(zhì)是草莓果實的主要香氣物質(zhì)，且其含量占總含量的 50% 以上。

趙娜［34］研究測定了‘圣誕紅’‘紅顏’中的香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)‘圣誕紅’的主要特征香氣物質(zhì)是3-己烯-1-醇乙酸酯，‘紅顏’中的主要特征香氣物質(zhì)是2-己烯-1-醇乙酸酯、丁酸、2-己烯酯和丁酸己酯，2 個品種中的香氣物質(zhì)相似性較大；王娟等［35］分析了‘紅顏’草莓的風(fēng)味和香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)‘紅顏’具有花香味，在‘紅顏’中未檢測到2-甲基丁酸乙酯、2-庚醇。本試驗在 3 個品種中均檢測到了相對含量較高的乙酸乙酯。張運濤［36］測定‘紅顏’草莓的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的相對含量最高。但是一般認(rèn)為乙酸乙酯具有較高的味閾值［37］，所以該物質(zhì)對草莓香味的作用仍不明確。另外，己酸乙酯和己酸甲酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯在紅顏品種的香味中同樣起重要作用［36］。本試驗同樣在 3個草莓品種中均檢測到較高的己酸甲酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯，而且這3 種物質(zhì)在 3 種品種草莓的成熟期含量均顯著增加，表明這3 種物質(zhì)可能是草莓主要的香氣物質(zhì)。(E)- 2-己烯醛的青綠葉味對‘紅顏’品種形成特有的茉莉和玫瑰清爽香味也有作用［35-36］，本試驗在 3 個品種草莓中均檢測到反式-2-己烯醛，但該物質(zhì)的含量在 3 個品種中差異較大，并且在 3 個品種草莓果實的成熟期含量均顯著降低，這可能是引起 3 個品種風(fēng)味差異的原因之一。另外，丁醛的含量在‘鄉(xiāng)野’和‘圣誕紅’成熟期顯著增加。酸類物質(zhì)在一定范圍內(nèi)具有果香味［38］，而 3 個品種中的酸類物質(zhì)含量均較低，所以 3 個品種的甜度較高，這可能會使其他風(fēng)味體現(xiàn)的更濃郁。甲基叔丁基醚的含量在 3 個品種草莓的成熟期顯著增加，這可能是影響草莓香氣的重要有機物。

4 結(jié)論

通過對 3 個品種草莓果實的分析檢測，酯類物質(zhì)種類最多，含量最高，在 3 個品種草莓香氣形成中發(fā)揮重要作用。草莓香味不僅取決與酯類物質(zhì)，還與醛類、酸類、醚類等有關(guān)。丁酸丁酯、己酸甲酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸甲酯、丙烯酸乙酯、芳樟醇、3-甲硫基丙醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮、二乙二醇二甲醚、二烯丙基二硫是影響草莓香氣的重要有機物。