陸地棉泛素結(jié)合酶基因GhUBC4 調(diào)控開花時(shí)間機(jī)制探究

張子豪，李會(huì)敏，張競予，閻媛媛，馬峙英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071000）

棉花被認(rèn)為是研究多倍體植物的模式物種，為了解植物基因和基因組的進(jìn)化模式和機(jī)制提供了組織框架和系統(tǒng)發(fā)育的視角［1］。棉花異源四倍體栽培品種通過亞洲棉Gossypium arboreum（Ga, A2）和雷蒙德氏棉Gossypium raimondii（Gr, D5）2 個(gè)二倍體物種的種間基因組融合和加倍形成5 個(gè)異源四倍體種［2］，其中陸地棉（Gossypium hirsutumL.）是目前種植最廣泛的棉種。

泛素- 蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway）在調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，選擇性降解異常蛋白和短命調(diào)節(jié)蛋白，包括細(xì)胞周期蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄因子［3］。泛素結(jié)合酶E2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2）是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中關(guān)鍵組成部分之一，具有特殊的意義和功能［4］。擬南芥AtUBC2響應(yīng)脫水、高鹽和脫落酸（ABA）處理，正向調(diào)節(jié)滲透脅迫的耐 受 性［5］，綠 豆VrUBC1［6］、大 豆GmUBC9［7］和CmUBC［8］、花生AhUBC2［9］具有相同的功能。AtUBC32、AtUBC33和AtUBC34可以與干旱脅迫負(fù)調(diào)控因子PUB19相互作用，通過脫落酸的介導(dǎo)在干旱脅迫中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［10］，并且抑制種子萌發(fā)和初生根生長［11］。此外，AtUBC18通過改變AtERF1的豐度和下游基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控干旱和鹽脅迫的響應(yīng)［12］。橡膠樹Rad6和水稻OsRad6與擬南芥中AtUBC2的相似性超過96%，其表達(dá)可被乙烯（ET）和茉莉酸甲酯（MeJA）顯著誘導(dǎo)［13］。AtRCE1與人UBC12基因同源，其與泛素類蛋白RUB1 結(jié)合，影響SCF E3s 的功能，從而影響生長素應(yīng)答［14］。AtUBC24（pho2） 受microRNA399（miR399） 調(diào)控，控制無機(jī)磷酸鹽（Pi）的穩(wěn)態(tài)以及Pi 的易位和再活化［15］。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過全基因組關(guān)聯(lián)分析在陸地棉D(zhuǎn)03 染色體上挖掘到一個(gè)與棉花開花時(shí)間相關(guān)的候選基因GhUBC4［16］，本研究對該基因進(jìn)行了克隆與功能分析，由于不同陸地棉品種中單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的改變，GhUBC4具有不同的序列，將其命名為GhUBC4Ref和GhUBC4Alt，以期解析GhUBC14位點(diǎn)變異促進(jìn)棉花開花的機(jī)制，為早熟棉育種提供理論和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/Vh8qXc/models/） 預(yù) 測 蛋 白三級結(jié)構(gòu)；MEGA7.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；在線網(wǎng) 站CDD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）用于保守結(jié)構(gòu)域分析；在線網(wǎng)站Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）用于啟動(dòng)子順勢作用元件分析；NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和DNAMAN 軟件對氨基酸序列進(jìn)行比對。

1.2 植物培養(yǎng)及取樣方法

擬南芥種植于光照培養(yǎng)室（23 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗），在子葉展平后7 d 進(jìn)行取樣，用于基因表達(dá)分析。陸地棉TM-1 種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室（28 ℃，12 h 光照/ 8 h 黑暗），兩片真葉期開始取樣，到五片真葉期結(jié)束，每次選取長勢均勻一致的棉株葉片及頂端分生組織用于基因的實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析及相關(guān)基因克隆。所取材料立即投入液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

以‘Babshaw1’和‘中棉所16 號’的葉片cDNA為模板擴(kuò)增GhUBC4Ref和GhUBC4Alt的CDS 序列。擴(kuò)增產(chǎn)物利用雙酶切法構(gòu)建植物超表達(dá)35S:pGreen載體。利用農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究中使用的引物如表1 所示。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建目的基因與GFP 融合表達(dá)載體35S:GhUBC4Ref-GFP 和35S:GhUBC4Alt-GFP，采 用 電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28℃震蕩培養(yǎng)。當(dāng)煙草（Nicotiana bethamiana）長到五片真葉時(shí)，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600=1.0 ～1.2，離心收集菌液，將菌體重懸于緩沖液（10 mmol/L MES,10 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L AS），使用1 mL 無針頭注射器，將農(nóng)桿菌注射到煙草葉片背面。侵染后黑暗培養(yǎng)48 h，利用DAPI 進(jìn)行染色，使用智能激光共聚焦顯微鏡（FV1000）觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)位置。

1.5 病毒誘導(dǎo)基因沉默

擴(kuò)增GhUBC4目的基因的特異性片段，并連接到pTRV2 載體中。當(dāng)棉花植株2 片子葉展平時(shí)，將含有目的基因的pTRV2 農(nóng)桿菌與pTRV1 農(nóng)桿菌等體積混合后注射早熟棉花品種‘CCRI50’葉片背部。pTRV2:CLA1和pTRV1 分別用作陽性對照和陰性對照。當(dāng)陽性對照出現(xiàn)白化表型時(shí)，收獲葉片以評估基因的沉默效率，檢測開花促進(jìn)子GhFT、GhSOC1、GhLFY表達(dá)量，之后統(tǒng)計(jì)第一果枝節(jié)位、現(xiàn)蕾天數(shù)和開花時(shí)間。

1.6 RT-PCR

使用RNA prep Pure Plant Kit（天根，北京，中國）提取總RNA。使用PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis kit（索萊寶，美國）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包括前后引物各0.5 μL，5 μL 2×AugeGreen qPCR Master Mix (US Everbright)，1 μL 模板cDNA，2.9 μL ddH2O，0.1 μL ROX。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 5 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 50 s。棉花以GhUBQ14基因?yàn)閮?nèi)參，擬南芥以AtTUB2基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△CT法計(jì)算相對表達(dá)量。每個(gè)樣品進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花相關(guān)基因的鑒定

本課題組前期對419 份陸地棉核心種質(zhì)進(jìn)行了重測序，基于366 萬個(gè)SNPs 的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與開花天數(shù)相關(guān)的SNPs（1 199 個(gè)）位于強(qiáng)信號的D03 染色體上，在25.21 ～25.22 Mb 的位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)1 個(gè)UBC 基因與開花時(shí)間顯著關(guān)聯(lián)。該基因在早熟棉品種中基因型為GGA，而在晚熟棉品種中基因型為TTT，與同樣晚熟的陸地棉參考基因組TM-1基因型相同。

2.2 GhUBC4 基因克隆及生物信息學(xué)分析

為了分別克隆2 種基因型，以‘Babshaw1’和‘中棉所16 號’的葉片cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到450 bp 左右的特異性條帶，測序結(jié)果顯示2 序列氨基酸序列相似度高達(dá)99%，僅有1 個(gè)氨基酸發(fā)生改變（圖1A），分別命名為GhUBC4Ref和GhUBC4Alt。C 端氨基酸序列的差異導(dǎo)致2 個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)明顯不同（圖1B）。GhUBC4不同基因型并不影響基因結(jié)構(gòu)，均包含5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子。在NCBI 中對GhUBC4 蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對，發(fā)現(xiàn)GhUBC4 蛋白與多個(gè)物種均有較高的相似性，其生物功能存在一定的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，GhUBC4 蛋白與錦葵科棉屬的雷蒙德氏棉、海島棉、亞洲棉以及錦葵科木槿、榴蓮的親緣關(guān)系最近，說明這些物種的GhUBC4蛋白進(jìn)化于共同祖先（圖1C）。利 用Plant CARE 對GhUBC4上 游3 000 bp 序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測（圖1D）。結(jié)果顯示，GhUBC4除了含有TATA-box 和CAAT 核心啟動(dòng)子元件外，還檢測到多種光反應(yīng)順式作用元件AT1-motif、GTGGC-motif、GATA-motif、G-box、AE-box、GT1-motif、Box-4、TCT-motif，茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、TATCbox，低溫響應(yīng)的順式作用元件LTR 及厭氧誘導(dǎo)元件ARE，分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件CAT-box，及參與晝夜節(jié)律控制的順式作用調(diào)節(jié)元件Circadian，暗示該基因受多種信號通路調(diào)控。

圖1 陸地棉GhUBC4 基因克隆及生物信息學(xué)分析Fig. 1 Cloning and bioinformatics analysis of GhUBC4 in G. hirsutum

2.3 GhUBC4 基因表達(dá)模式分析

利用已發(fā)表的南京農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫［17］對GhUBC4表達(dá)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在棉花的各個(gè)組織中均表達(dá)，且表達(dá)量不具有組織特異性（圖2A）。為了探究GhUBC4是否參與棉花的生長發(fā)育過程，檢測該基因在陸地棉TM-1 二葉期到四葉期的頂端分生組織和葉片中的表達(dá)變化（圖2B）。結(jié)果顯示，隨著棉苗的生長發(fā)育，GhUBC4基因的表達(dá)量在葉片Leaf 和頂端分生組織SAM 中上調(diào)表達(dá)，該基因表達(dá)模式與開花促進(jìn)子一致。同時(shí)，選取了10 個(gè)早熟棉品種和10 個(gè)晚熟棉品種，在四葉期進(jìn)行取樣，檢測GhUBC4基因的表達(dá)量（圖2C），發(fā)現(xiàn)該基因在早熟棉花品種中的表達(dá)量普遍高于晚熟品種，表明該基因參與棉花開花調(diào)控。

圖2 陸地棉GhUBC4 基因表達(dá)模式分析Fig. 2 Expression analysis of GhUBC4 in G. hirsutum

2.4 GhUBC4 亞細(xì)胞定位

為了確定GhUBC4 在細(xì)胞中行駛功能的位置，我們將不含終止密碼子的編碼序列與GFP 載體N端融合，并在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示GhUBC4Ref-GFP 和GhUBC4Alt-GFP 兩 種 基 因 型的融合蛋白綠色熒光信號均定位在細(xì)胞核中，表明GhUBC4 在細(xì)胞核中行使功能。

圖3 GhUBC4 亞細(xì)胞定位Fig. 3 Subcellular localization of GhUBC4 in tobacco leaves

2.5 沉默GhUBC4 抑制開花

利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)在早熟棉‘CCRI50’中沉默GhUBC4，結(jié)果顯示當(dāng)沉默效率在80%以上時(shí)，沉默植株的果枝始節(jié)位、現(xiàn)蕾天數(shù)、開花天數(shù)顯著高于對照植株，沉默植株第一果枝位于第9 節(jié)，現(xiàn)蕾時(shí)間延遲約6 d，且對照植株開花時(shí)，沉默植株不開花（圖4）。表明GhUBC4表達(dá)的降低延遲了陸地棉開花時(shí)間，該基因具有促進(jìn)棉花開花的功能。

圖4 沉默GhUBC4 抑制開花Fig. 4 Silencing GhUBC4 inhibits flowering

2.6 超表達(dá)GhUBC4 促進(jìn)擬南芥早花

為了探究不同基因型GhUBC4調(diào)控開花時(shí)間的功能，構(gòu)建了超表達(dá)載體35S:GhUBC4Ref和35S:GhUBC4Alt，并將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中。在長日照條件下，超表達(dá)GhUBC4Ref和GhUBC4Alt均促進(jìn)擬南芥開花（圖5A），熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)GhUBC4Ref在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)豐富，且表達(dá)量越高，植株開花越早。但GhUBC4Alt的表達(dá)利用qPCR 檢測CT 值較大，表明其在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)較少，無法被qPCR 方法準(zhǔn)確檢測，因此我們用半定量法對其mRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能完整的轉(zhuǎn)錄GhUBC4Alt，且轉(zhuǎn)錄相對較多的#1和#2 株系開花時(shí)間早于株系#3（圖5B, 5C）。表明兩種GhUBC4基因型均具有促進(jìn)開花的功能，且GhUBC4促進(jìn)開花功能具有劑量效應(yīng)。

圖5 超表達(dá)GhUBC4 促進(jìn)擬南芥開花Fig. 5 Overexpression of GhUBC4 promotes flowering in Arabidopsis thaliana

2.7 GhUBC4 與開花促進(jìn)子作用關(guān)系初步探究

在復(fù)雜的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，開花促進(jìn)子FT、SOC1、LFY整合環(huán)境和內(nèi)源的各種信號，最終激活花芽分化，開啟生殖生長。因此我們進(jìn)一步檢測了轉(zhuǎn)基因擬南芥和沉默植株中3 個(gè)重要開花促進(jìn)子的表達(dá)。與野生型擬南芥相比，35S:GhUBC4Ref和35S:GhUBC4Alt擬 南 芥 中AtFT、AtSOC1、AtLFY的表達(dá)量均顯著增加（圖6A）。并且在35S:GhUBC4Alt植株中，開花促進(jìn)子的轉(zhuǎn)錄水平均高于35S:GhUBC4Ref，而GhUBC4Alt的轉(zhuǎn)錄豐度明顯低于GhUBC4Ref，說明GhUBC4Alt對開花促進(jìn)子的促進(jìn)功能更強(qiáng)。在早熟棉品種‘CCRI50’中沉默GhUBC4后，開花整合子GhFT、GhSOC1、GhLFY的表達(dá)量呈顯著下調(diào)表達(dá)（圖6B）。這些結(jié)果表明GhUBC4正調(diào)控開花整合子從而促進(jìn)擬南芥和棉花早花。

圖6 GhUBC4 與開花促進(jìn)子作用關(guān)系初步探究Fig. 6 Preliminary study on the relationship between GhUBC4 and flowering time integrons

3 討論

水稻CsUBC24與花發(fā)育調(diào)控因子CsSEPs 和花藥開裂調(diào)控因子CsICE1 互作，通過下調(diào)CsSEPs和CsICE1破壞花分生組織調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致花的發(fā)育異常及雄性不育［18］。番茄E2 基因LeUBC的轉(zhuǎn)錄水平在衰老葉組織和發(fā)育中的果實(shí)中增加，并在果實(shí)成熟開始時(shí)達(dá)到峰值［19］。GhUBC1/2選擇性降解葉片和花衰老過程的蛋白［3］。本研究發(fā)現(xiàn)1 個(gè)調(diào)控開花時(shí)間的泛素化結(jié)合酶基因GhUBC4，該基因編碼區(qū)的變異與棉花熟性相關(guān)，且在早熟品種中普遍高表達(dá)，這與其促進(jìn)擬南芥早花的表型一致，說明該基因具有促進(jìn)開花的功能。

一般認(rèn)為，植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括光周期途徑、溫度途徑、春化途徑、赤霉素途徑和年齡途徑。目前對UBC基因參與開花調(diào)控機(jī)制的研究均為其對FLC及其同源基因的調(diào)控。與野生型擬南芥相比，hub1和hub2單突變體，以及ubc1和ubc2雙突變體中FLC 的表達(dá)顯著降低，表明FLC位點(diǎn)組蛋白H2B 的單泛素化和去泛素化是FLC適當(dāng)表達(dá)所必需的［20-21］。此外，在低溫條件下，轉(zhuǎn)錄因子WRKY34結(jié)合到E3 連接酶復(fù)合體組分CUL3A的啟動(dòng)子上增加其轉(zhuǎn)錄，使FRIGIDA（FRI）降解，從而抑制FLC的表達(dá)［22］。GmUBC9正調(diào)控FLC基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因擬南芥晚花［7］。這些結(jié)果均表明UBC基因抑制開花時(shí)間。與之相似，對E3 基因參與開花時(shí)間調(diào)控的研究也表明泛素化抑制開花時(shí)間。RING 蛋白FRRP1 是HUB2 在水稻中的同源基因，F(xiàn)RRP1 通過泛素化組蛋白H2B 抑制Hd3a 的表達(dá)［23］。擬南芥光周期路徑CO 蛋白的豐度受泛素化的周期調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控FT 的表達(dá)［24］。SCF E3s 連接酶復(fù)合物成員FKF1 藍(lán)光下與COP1 互作，阻止其泛素化CO［25］。水稻環(huán)型E3 連接酶HAF1 通過26S 蛋白酶復(fù)合體降解OsELF3，從而調(diào)節(jié)OsELF3 蛋白晝夜節(jié)律性累積［26］。然而，GhUBC4促進(jìn)開花，這拓寬了我們對泛素化功能的認(rèn)識。與此類似，磷脂乙醇胺結(jié)合 基 因（Phosphatidyl ethanolamine-binding gene）家族中TFL1抑制AP1和LFY基因的表達(dá)［27］，而陸地棉GhTFL1a基因作為TFL1的同源序列，其功能與TFL1相反，并參與了光周期路徑［28］。突變型GhUBC4蛋白結(jié)構(gòu)在C 端發(fā)生變化，可能影響其與蛋白的互作。功能分析表明，GhUBCAlt盡管在擬南芥中表達(dá)水平顯著低于GhUBCRef，但其對開花促進(jìn)子的促進(jìn)作用更強(qiáng)，說明不僅在轉(zhuǎn)錄水平上，早熟棉中GhUBC4Alt大量積累，其蛋白的功能也相對增強(qiáng)。

多個(gè)棉花基因組的測序與組裝拓寬了我們在基因組水平對棉花多倍體進(jìn)化事件、變異與適應(yīng)的認(rèn)識，同時(shí)推進(jìn)棉花研究進(jìn)入后基因組時(shí)代。與模式植物不同，在棉花不存在春化途徑，因此基因組中也缺失FLC基因［29］，陸地棉UBC基因調(diào)控開花時(shí)間的機(jī)制不同。并且在棉花中，開花促進(jìn)子GhFT、GhLFY在A、D 亞組各存在一個(gè)拷貝，然而SOC1和AP1同源序列較多，其功能的冗余性和多樣性增加了棉花開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。本研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GhUBC4顯著促進(jìn)SOC1和FT的轉(zhuǎn)錄，而LFY表達(dá)量的升高不如FT和SOC1。表明GhUBC4可能通過降解調(diào)控FT和SOC1上游共同的調(diào)控因子進(jìn)而調(diào)控開花。受限于棉花開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究，目前對開花抑制子的認(rèn)識尚淺，制約著我們對該基因調(diào)控機(jī)制的解析。挖掘其互作的蛋白及調(diào)控的靶基因?qū)ι钊肓私釭hUBC4基因如何調(diào)控開花時(shí)間具有重要意義，也是今后研究的重點(diǎn)。