肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙的作用機(jī)制探討*

謝凱放，陳永華，張智磊

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

威爾遜病[1]（Wilson disease， WD）又稱肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD），是一種銅代謝障礙性疾病，同時也是一種常染色體隱性遺傳疾病，現(xiàn)已明確[2]肝豆?fàn)詈俗冃允怯捎阢~轉(zhuǎn)運ATP7B酶功能缺陷，導(dǎo)致銅藍(lán)蛋白合成減少、銅排泄障礙，導(dǎo)致銅沉積于肝、腦、腎、角膜等臟器中，從而表現(xiàn)出進(jìn)行性肝損害、錐體外系癥狀、精神癥狀、角膜K-F環(huán)等。肝豆?fàn)詈俗冃訹3-7]發(fā)病常在青少年期，是迄今為止少數(shù)幾種可治療的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病之一，目前西醫(yī)治療的目的主要是減少銅的攝入和促進(jìn)銅排出，主要藥物有二巰丙磺酸鈉（sodium dimercaptosulphonate，DMPS）、二巰丁二酸鈉（sodium dimercaptosuccinate，Na-DMS）等金屬絡(luò)合劑；祖國醫(yī)學(xué)[8]相關(guān)文獻(xiàn)對WD缺乏明確記載，對其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識迄今尚未統(tǒng)一。根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸為“顫證”“肝風(fēng)”范疇，其病位為肝、腦，與脾、腎、膽相關(guān)，臨床分型[9]主要有濕熱內(nèi)蘊型、痰瘀互結(jié)型、肝腎虧虛型、脾腎陽虛型。

肝豆湯[10]為安徽省神經(jīng)病研究所楊任民教授首創(chuàng)，由黃芩、生大黃、黃連、綿萆薢、穿心蓮、半枝蓮六味中藥組成，臨床應(yīng)用隨證加減，其中[11]黃連、黃芩、生大黃清熱化濕，綿萆薢、穿心蓮、半枝蓮清熱解毒，諸藥合用發(fā)揮疏肝利膽、清熱化濕、排銅化濁的功效。二十余年來，眾多的學(xué)者對肝豆湯的臨床療效進(jìn)行了大量的臨床研究，陶莊、汪美霞等[11-12]臨床研究表明，肝豆湯能改善濕熱內(nèi)蘊型肝豆?fàn)詈俗冃酝萄使δ苷系K癥狀及吞咽評價量表評分，且療效顯著，但是具體作用機(jī)制目前尚不明確。

近些年來，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，中藥方劑的作用機(jī)制研究又有了新的方向，其可通過構(gòu)建中藥方劑與疾病間的“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)，最終我們從微小的分子層面解釋方劑與疾病之間的作用機(jī)制。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討肝豆湯治療威爾遜病病吞咽障礙的作用機(jī)制，希望為今后肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙的臨床試驗研究提供理論支撐。

資料與方法

1 肝豆湯化學(xué)成分篩選及潛在靶點預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（計算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)站），分別以肝豆湯組成的中藥的名稱（穿心蓮、半枝蓮、黃連、生大黃（按大黃檢索）、黃芩、綿萆薢）為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥ 30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥ 0.18為限定條件，篩選出肝豆湯組成的有效化學(xué)成分及相對應(yīng)的潛在靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將所獲潛在靶點名稱進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，最后得到肝豆湯對應(yīng)的基因靶點.

2 威爾遜病吞咽障礙相關(guān)的作用靶點收集

通過Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“dysphagia in wilson disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。

3 共同靶點的篩選和“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將肝豆湯的基因靶點和威爾遜病吞咽障礙的疾病靶點分別上傳至Veen在線作圖工具進(jìn)行Veen分析后，得到其共同靶點的名稱。 利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建肝豆湯與威爾遜病吞咽障礙之間的“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出其核心化學(xué)成分。

4 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將肝豆湯與威爾遜病吞咽障礙的共同靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI分析，限定物種為Homo Sapiens，最低置信度設(shè)置為0.9，同時隱藏游離的點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載對應(yīng)的tsv文件，將文件代入到R4.2.0中，制作條形圖，并得出核心靶點。

5 GO生物功能和基因組KEGG通路富集分析

借助Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物功能和KEGG通路富集分析（選取條件為P＜0.01），并利用R4.2.0軟件所獲結(jié)果進(jìn)行可視化，繪制出條形圖及氣泡圖，結(jié)合富集分析結(jié)果，從生物功能和信號通路的角度分析肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙可能的作用機(jī)制。

結(jié) 果

1 肝豆湯化學(xué)成分篩選及潛在靶點預(yù)測結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索得到肝豆湯的化學(xué)成分121個，其中黃芩36個、生大黃16個、黃連14個、綿萆薢2個、穿心蓮24個、半枝蓮29個，表1列出OB值排名前20位的有效化學(xué)成分，對應(yīng)潛在靶點1807個，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將所獲潛在靶點名稱進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，最后合并去重共得到肝豆湯的基因靶點764個。

表1 中藥有效成分表

2 疾病相關(guān)靶點篩選結(jié)果

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，以“dysphagia in wilson disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索得到其基因靶點，然后將得到的基因靶點合并去重，最后共得到與威爾遜病吞咽障礙相關(guān)的作用靶點3250個。

3 共同靶點篩選及“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將764個肝豆湯的基因靶點和3250個威爾遜病吞咽障礙的疾病靶點分別上傳至Veen在線作圖工具分析后，共得到共同靶點68個（見圖1）。 利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建肝豆湯與威爾遜病吞咽障礙之間的“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)（見圖2），結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)共包含120個節(jié)點及517條邊，其中肝豆湯化學(xué)成分節(jié)點52個，交集靶點節(jié)點68個。最后以節(jié)點度值篩選得出槲皮素（quercetin）、漢黃岑素（wogonin）、木犀草素 （luteolin）為度值排名前3的化學(xué)成分，這3個成分在肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙中可能起著關(guān)鍵作用。

圖1 肝豆湯成分基因靶點與威爾遜病吞咽障礙基因靶點Veen圖

圖2 肝豆湯化學(xué)成分與威爾遜病吞咽障礙間“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果

將68個肝豆湯與威爾遜病吞咽障礙的共同靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI分析，限定物種同樣為Homo Sapiens，最低置信度設(shè)置為0.9，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，同時將網(wǎng)絡(luò)中游離的2個點隱藏。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)共包含66個節(jié)點及1356條邊，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載對應(yīng)的tsv文件并將文件代入到R4.2.0中，將度值排名前30制作成條形圖（見圖4），得出ESR1、MYC、CASP3為度值排名前3的靶點，提示這3個靶點可能是肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙的核心靶點。

圖4 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙靶點圖

5 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果借助Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物功能富集分析，結(jié)果得到 GO 條目 91個（選取條件為P＜0.05），考慮到圖像輸出的完整性，選取中P值最小的前15個條目，利用R4.2.0軟件制作成GO生物功能富集分析條形圖及氣泡圖（見圖5、圖6）。結(jié)果顯示，肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙GO生物功能主要富集在DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（Ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（泛素蛋白連接酶結(jié)合）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）；借助Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果得到KEGG條目118個（選取條件為P＜0.05），選取中P值最小的前21個條目，利用R4.2.0軟件制作成KEGG通路富集分析條形圖及氣泡圖（見圖7、圖8）。結(jié)果顯示，肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙的信號通路主要富集在化學(xué)致癌-受體激活信號通路（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝細(xì)胞癌通路（Hepatocellular carcinoma）等。

圖5 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙GO富集分析條形圖

圖6 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙GO富集分析氣泡圖

圖7 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙KEGG通路富集分析條形圖

圖8 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙KEGG通路富集分析氣泡圖

討 論

圖3 肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙的PPI圖

中藥方劑具有藥物組成多、成分多樣、作用靶點復(fù)雜等特點，目前單純的依靠傳統(tǒng)臨床研究很難說明其作用機(jī)制。然而，近些年興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)就給我們探究中藥方劑的作用機(jī)制提供了可行的方法。肝豆湯作為威爾遜病的經(jīng)典用方，且不良反應(yīng)少，近年來，越來越多的研究表明肝豆湯治療威爾遜病療效確切，張靜等[13]通過回顧性分析分析了85例威爾遜病患者，發(fā)現(xiàn)肝豆湯聯(lián)合二巰基丙磺酸鈉可顯著改善威爾遜病認(rèn)知功能， 血清SOD， Hcy水平顯著改善， 驅(qū)銅效果明顯， 不良反應(yīng)輕微， 安全有效。方向等[14]通過臨床隨機(jī)對照研究了60例威爾遜病患者，發(fā)現(xiàn)肝豆湯聯(lián)合驅(qū)銅治療可有效改善濕熱內(nèi)蘊型威爾遜病患者平衡障礙，緩解臨床癥狀，提高生活質(zhì)量。陶莊等[11]研究了80例威爾遜病吞咽障礙患者，結(jié)合中醫(yī)癥候、吞咽評價等評分，發(fā)現(xiàn)肝豆湯能明顯改善威爾遜病吞咽障礙患者吞咽功能障礙癥狀；由此可見，肝豆湯具有改善威爾遜病患者臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量的作用。

根據(jù)Cytoscape3.9.1構(gòu)建的“化學(xué)成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，我們可以得出肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙具有多成分、多靶向的特點，其中槲皮素、漢黃芩素、木犀草素可能在肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙中起著關(guān)鍵作用。槲皮素是一種黃酮類化合物， 現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，槲皮素[15]具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗黏附、免疫調(diào)節(jié)等功效，孫軍等[16]研究葉顯示，槲皮素可能是通過激活PI3K/Akt信號通路對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用；現(xiàn)代藥理學(xué)表明漢黃芩素[17]是黃芩的主要的生物活性化合物，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和保護(hù)神經(jīng)活性，Huynh DL等[18]研

究顯示在炎癥性疾病中，漢黃芩素抑制炎癥細(xì)胞因子/趨化因子（IL-6，IL-1β，ifn-γ，tnf-α，RANTES，eotaxin）的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激介質(zhì) （COX-2，PGE2，NO，iNOS）通過調(diào)節(jié)ROS/ MAPK/Nrf2/AP1/nf-κb信號通路；木犀草素[19]是一種重要的黃酮，存在于多種植物產(chǎn)品中，包括西蘭花、胡椒、百里香和芹菜等，大量研究表明，木犀草素[20-21]在體內(nèi)和體外都具有有益的神經(jīng)保護(hù)作用；基于以上，我們可以相信本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出來的肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙有效成分是可靠的。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，我們可以得出ESR1、MYC、CASP3等可能為肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙的核心靶點。ESR1[22]即雌激素受體α，是一種核內(nèi)受體，與其它類固醇激素受體一樣，雌激素受體有雌激素結(jié)合域、DNA結(jié)合域及轉(zhuǎn)錄激活域，參與生殖系統(tǒng)的生長、分化，有研究顯示ESR1能調(diào)節(jié)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能；MYC[23]是一種原癌基因，研究表明其在細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用；CASP3[24]編碼的蛋白質(zhì)是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用，趙雯[25]等研究顯示肝豆湯可以通過抑制CASP3的表達(dá)來減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

GO生物富集分析結(jié)果表明，肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙主要是通過調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（Ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（泛素蛋白連接酶結(jié)合）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）等發(fā)揮作用。KEGG信號通路富集分析表明，肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙的的信號通路主要有化學(xué)致癌受體活化（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝細(xì)胞癌通路（Hepatocellular carcinoma）等發(fā)揮作用，體現(xiàn)了肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙是多通路干預(yù)的。

肝豆湯是中醫(yī)臨床上治療威爾遜病吞咽障礙的常用藥物，具有很大的應(yīng)用前景。以上研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究，發(fā)現(xiàn)了肝豆湯的主要活性成分槲皮素、漢黃芩素、木犀草素等可能作用于ESR1、MYC、CASP3等核心靶點，并通過化學(xué)致癌受體活化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt等多條信號通路發(fā)揮其抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、排銅化濁、改善吞咽功能的作用，體現(xiàn)了肝豆湯干預(yù)威爾遜病吞咽障礙具有多成分、多靶點、多通路的特點，當(dāng)然，由于本研究采用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)整理、軟件分析的方法，還需要更多的證據(jù)來證明肝豆湯治療威爾遜病吞咽障礙的作用機(jī)制，因此相關(guān)結(jié)論還需臨床試驗進(jìn)一步論證。