預(yù)電針心俞穴對急性心肌缺血大鼠心肌保護(hù)作用的研究

董亞琴 萬隆 黃倩茹 薩喆燕 許金森

摘要：目的 探討預(yù)電針心俞穴對急性心肌缺血大鼠心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法 選用雄性清潔級SD大鼠18只，隨機(jī)分成生理鹽水對照組、急性心肌缺血組、預(yù)電針心俞穴組。急性心肌缺血組、預(yù)電針心俞穴組用背部皮下多點位注射鹽酸異丙腎上腺素（ISO）制備急性心肌缺血大鼠模型，預(yù)電針心俞穴組在造模前電針雙側(cè)心俞穴3 d。采用蘇木精-伊紅染色法（HE染色法）觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化;q PCR檢測心肌組織SP mRNA 和CGRP mRNA表達(dá)。結(jié)果 與急性心肌缺血組相比，預(yù)電針心俞穴組可改善大鼠心肌組織病理學(xué)變化，抑制心肌組織SP mRNA 和CGRP mRNA的表達(dá)，心肌缺血損傷程度減輕。結(jié)論 預(yù)電針心俞穴對大鼠急性心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用，可能通過調(diào)節(jié)SP及CGRP表達(dá)對心肌缺血損傷起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：預(yù)電針;心俞穴;急性心肌缺血;SP;CGRP

中圖分類號：R246?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）01-0072-04

Study on the Myocardial Protective Effect of Pre-electroacupuncture at Xinshu Pointson Acute Myocardial Ischemia Rats

DONG Ya-qin， WAN Long， HUANG Qian-ru， SA Zhe-yan， XU Jin-sen

（Fujian Academy of Chinese Medical Science， Fuzhou 350003， China）

【Abstract】Objective： To explore the possible mechanism of pre-electroacupuncture at Xinshu points on myocardial protection in rats with acute myocardial ischemia. Methods： 18 male clean SD rats were randomly divided into normal saline control group， acute myocardial ischemia group， and pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group.? The acute myocardial ischemia group and the pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group was prepared by subcutaneous injection of isoproterenol hydrochloride （ISO） at multiple points in the back to make rat models of acute myocardial ischemia. The Xinshu acupoint group was given electroacupuncture at Xinshu points on both sides for 3 days before modeling. Hematoxylin-eosin staining method （HE staining method） was used to observe the pathological changes of rat myocardial tissue and q PCR was used to detect the expression of SP mRNA and CGRP mRNA in myocardial tissue. Results： Compared with the acute myocardial ischemia group， the pre-electroacupuncture at Xinshu acupoint group can improve the pathological changes of rat myocardial tissue， inhibit the expression of SP mRNA and CGRP mRNA in myocardial tissue， and reduce the degree of myocardial ischemia injury. Conclusion： The pre-electro-acupuncture at Xinshu points has a certain protective effect on acute myocardial ischemia injury in rats， and may play a protective effect on myocardial ischemia injury by regulating the expression of SP and CGRP.

【Key words】Pre-Electroacupuncture; Xinshu Acupoint; Acute Myocardial Ischemia; SP; CGRP

冠心病是心血管疾病死亡的重要原因，又稱缺血性心臟病[1]。它嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。針灸在預(yù)防和治療缺血性心臟病的研究中得到了肯定。早在2002 年，世界衛(wèi)生組織在《針灸臨床研究報告的回顧與分析》中肯定了冠心病是推薦針灸治療病種之一。

急性心肌缺血可以激活心肌的傷害性感受器，引起傷害性神經(jīng)信號向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)，同時心肌組織內(nèi)的感覺神經(jīng)末梢受刺激引起P物質(zhì)（SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等神經(jīng)肽的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，加重心肌損傷[2-4]。研究表明，心俞穴針刺預(yù)防冠心病心肌缺血在臨床中應(yīng)用比較廣范，有研究發(fā)現(xiàn)心俞穴預(yù)處理對心肌缺血可以發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用[5]。但其客觀作用機(jī)理，目前仍不明確。本研究擬觀察預(yù)電針心俞穴對急性心肌缺血大鼠血清SOD濃度、心肌組織SP和CGRP表達(dá)的影響，旨在探討其減輕心肌缺血損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠18只，清潔級，上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，體重250±20g。實驗前7d適應(yīng)性飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12h明暗交替，自由進(jìn)食與飲水。隨機(jī)分為生理鹽水對照組、急性心肌缺血組和預(yù)電針心俞穴組，每組6只。

1.1.2 主要試劑 異丙腎上腺素（ISO）（美國Sigma公司）;HE染液套裝（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1003）;SYBR premix ExTaq TM（日本TakaRa公司）;Trizol Reagent（美國invitrogen 公司）;PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TakaRa公司），引物由日本TakaRa公司合成。

1.1.3 主要儀器 Powerlab多導(dǎo)數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司）;小動物麻醉呼吸系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）;SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;JB-P5型石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），LEICA RM2016切片機(jī);7500 Fast Real-Time PCR System（美國 Applied Biosystems 公司），梯度熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems 公司），ALLEGRA 64R型臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），微量加樣槍（德國Eppendorf公司），NanoDrop 2000 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作[6] 按每日60 mg /kg的劑量（40mg/mL 溶于生理鹽水中）于背部皮下多部位注射異丙腎上腺素，連續(xù)注射2 d，間隔24 h。生理鹽水對照組：于背部皮下多部位注射與急性心肌缺血組等量的生理鹽水，連續(xù)注射2 d，間隔24 h。心肌缺血大鼠模型制模成功的心電圖出現(xiàn)S-T段下移，異常Q波。

1.2.2 干預(yù)措施 預(yù)電針心俞穴組的取穴方法參照《實驗針灸學(xué)》動物標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[7]。心俞穴：背部，第5胸椎棘突下旁開約1.5 cm處。選雙側(cè)心俞穴，選用0.25 mm×13 mm 華佗牌無菌毫針，直刺0.1cm，連接SDZ-Ⅱ電針儀，電壓1～2 V，以針體輕微抖動為度，斷續(xù)波，頻率2/10Hz，每次20min，每天1次。第1次注射ISO前3 d開始治療，連續(xù)3d。急性心肌缺血組和生理鹽水對照組給予同等條件抓取，不做任何治療。

1.2.3 病理學(xué)切片檢測 切取大鼠左心室，常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞病理改變[8]。

1.2.4 RNA的提取和質(zhì)量檢測 實驗結(jié)束后，大鼠腹腔注射10% 的水合氯醛麻醉后斷頸處死，立即取出心臟組織，用PBS沖洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鮮凍存心臟組織，將左心室剪成所需大小組織，用Trizol一步法提取細(xì)胞中的總RNA，NanoDrop 2000 分光光度計測檢測RNA純度和濃度。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。NanoDrop 2000分光光度計測定RNA在260 nm和280 nm波長的吸光度值，評估RNA量和質(zhì)量。

1.2.5 實時熒光定量PCR 每個樣本分別取2μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA于-80℃保存。引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR premix ExTaq TM 10μL，primer-F：0.4μL，primer-R：0.4μL，ROX II：0.4μL，ddH2O 6.8μL，cDNA 2μL，20μL 體系。反應(yīng)條件：（1）預(yù)變性 95℃ 30 s。（2） 變性：95℃5 s。（3）退火，延伸，60℃ 30 s，40個循環(huán)。采用 ABI 7500 Real time PCR儀檢測各樣本中mRNA的表達(dá)情況。實驗采用ΔΔCt 法。見表1。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量數(shù)據(jù)采用（x±s）表示。針刺前后比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 由圖1可以看出生理鹽水對照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。急性心肌缺血組心肌組織中可見較多心肌纖維輕度水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），周圍間質(zhì)可見水腫，結(jié)締組織排列疏松（紅色箭頭），伴有少量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤（藍(lán)色箭頭）。預(yù)電針心俞穴組心肌組織中可見少量心肌纖維輕度水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），細(xì)胞間隙略有增寬，伴有少量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞點狀浸潤（藍(lán)色箭頭）。與急性心肌缺血組相比，預(yù)電針心俞穴組改善了大鼠心肌組織病理學(xué)變化，心肌缺血損傷程度減輕。

2.2 各組大鼠心肌組織SP mRNA和CGRP mRNA表達(dá) 由表2可見，急性心肌缺血組心肌組織SP mRNA和CGRP mRNA表達(dá)較生理鹽水對照組明顯升高，有顯著性意義（P<0.05）;預(yù)電針心俞穴可以使兩者都有所下降，但SP mRNA無顯著性差異。

3 討論

心俞穴是手少陰心經(jīng)的背俞穴，在心肌缺血治療中占有重要地位。據(jù)穴位解剖資料，心俞穴其下有第4、5對胸神經(jīng)分支通過，心臟疾病常在此處出現(xiàn)牽扯痛、敏感點或“陽性反應(yīng)物”，刺激該處可調(diào)整心臟功能，寬胸寧心安神。大量臨床和實驗研究表明，電針心俞穴可顯著改善急性心肌缺血心功能，對缺血性心臟病的心肌細(xì)胞亦有保護(hù)作用[9-11]。

HE染色切片可以形象直觀地觀察組織形態(tài)學(xué)改變。急性心肌缺血組出現(xiàn)較多心肌纖維輕度水腫，結(jié)締組織排列疏松等，反映了注射ISO后，大鼠心肌組織在形態(tài)學(xué)方面會出現(xiàn)不同程度的病理改變。預(yù)電針心俞穴改善了心肌組織的病理改變，提示預(yù)電針心俞穴可改善大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，對心肌具有保護(hù)作用。

本實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水對照相比，急性心肌缺血組心肌組織SP mRNA和CGRP mRNA水平顯著升高，表明急性心肌缺血確實能夠誘發(fā)強(qiáng)烈的心肌局部和全身炎癥反應(yīng)，提示神經(jīng)源性炎癥機(jī)制可能參與心肌缺血的病理學(xué)過程。預(yù)電針心俞穴組大鼠心肌組織SP mRNA和CGRPmRNA水平均較急性心肌缺血組都有下降，CGRP mRNA有顯著性差異，提示電針心俞穴預(yù)處理可能通過激活脊髓背角α2-腎上腺素能受體，抑制周圍Aδ和C類傳入纖維的疼痛沖動，從而抑制傷害性神經(jīng)元放電，抑制傷害性神經(jīng)遞質(zhì)SP和CGRP等炎癥介質(zhì)釋放[12-13]，從而有效地減輕心肌缺血損傷。

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（收稿日期：2021-04-12）