新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞極化的影響

趙磊 萬(wàn)磊 劉健 黃傳兵 馬熙檬 朱子衡

摘要：目的 觀察新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞極化的影響。方法 將大鼠隨機(jī)均分為正常（NC）組、模型（MC）組和新風(fēng)膠囊（XFC）組，每組10只，除正常組外，MC組和XFC組構(gòu)建成AA大鼠模型。致炎后第12 d開(kāi)始給藥，給藥30 d后，檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI），電鏡觀察滑膜超微結(jié)構(gòu)，ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血炎癥極化標(biāo)志物CD86+細(xì)胞、CD206+細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果 與NC組相比，MC組大鼠AI、IL-1、CD86+細(xì)胞的表達(dá)升高，IL-10、CD206+細(xì)胞的表達(dá)降低差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與MC組大鼠相比，XFC組大鼠AI、IL-1、CD86+細(xì)胞的表達(dá)降低，IL-10、CD206+細(xì)胞的表達(dá)升高差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 新風(fēng)膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥。

關(guān)鍵詞：佐劑關(guān)節(jié)炎;巨噬細(xì)胞極化;新風(fēng)膠囊

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2022）01-0062-05

Effect of Xinfeng Capsule on Polarization of Synovial M1/M2 Macrophagesin Rats with Adjuvant Arthritis

ZHAO Lei1， WAN Lei2， LIU Jian1， HUANG Chuan-bing1， MA Xi-meng1， ZHU Zi-heng1

（1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China;2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Anhui 230031， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Xinfeng Capsule on the polarization of synovial M1/M2 macrophages in adjuvant arthritis （AA） rats. Methods： The rats were randomly divided into normal （NC） group， model （MC） group and Xinfeng Capsule （XFC） group， 10 rats per group. Except for the normal group， the MC group and XFC group were made into AA rat models. The administration was started on the 12th day after the inflammation， and 30th day after the administration， and the arthritis index （AI） of each group was measured. The ultrastructure of the synovial membrane was observed under electron microscope， the expression of serum cytokines was measured by ELISA， and the expression of CD86+ cells and CD206+ cells in the peripheral blood of the rats was measured by flow cytometrym， which are markers of inflammatory polarization. Results： Compared with that of the NC group， the expression of AI， IL-1 and CD86+ cells of the MC group increased， and the expression of IL-10 and CD206+ cells decreased， and the difference was statistically significant （P<0.05， P<0.01） and compared with that of the MC group， the expression of AI， IL-1， and CD86+ cells of the XFC group decreased， and the differences of the increased expression of IL-10 and CD206+ cells were statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion： Xinfeng Capsule may improve the joint inflammation of adjuvant arthritis rats by regulating the polarization of M1/M2 macrophages.

【Key words】Adjuvant Arthritis; Macrophage Polarization; Xinfeng Capsule

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見(jiàn)的慢性風(fēng)濕性炎癥性疾病，估計(jì)在成年人群中的患病率為 0.24%-1.25%，其特征是明顯的滑膜增生和關(guān)節(jié)滑膜炎，這是炎癥細(xì)胞因子顯著過(guò)量產(chǎn)生引起的骨和軟骨破壞的結(jié)果。未經(jīng)治療，RA 可能導(dǎo)致嚴(yán)重的進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞[1-2]。M1 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物為CD80+細(xì)胞，參與炎癥的誘導(dǎo)和惡化，并表達(dá)包括IL-1在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子。另一方面，M2 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物為CD206+細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生IL-10在內(nèi)的抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)參與抗炎反應(yīng)[3]。IL-1是炎癥區(qū)域的有效細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的交互方面很重要，并在炎癥反應(yīng)的激活和調(diào)節(jié)等機(jī)制中發(fā)揮核心作用，通過(guò)激活破骨細(xì)胞導(dǎo)致骨侵蝕，從而造成骨破壞，加速RA的進(jìn)展[4-5]。IL-10 被稱為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，IL-10可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，同時(shí)極化的M2型巨噬細(xì)胞會(huì)分泌更多的 IL-10，促進(jìn)血管生成、組織重塑和修復(fù)，減輕炎癥反應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，新風(fēng)膠囊（XFC）能調(diào)控炎性細(xì)胞因子，通過(guò)下調(diào)IL-1、上調(diào)IL-10的表達(dá)，明顯改善RA患者臨床癥狀，也能降低佐劑關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥極化狀態(tài)，從而抑制免疫、炎癥反應(yīng)，抑制軟骨破壞，達(dá)到治療RA的作用。本文通過(guò)研究新風(fēng)膠囊對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、滑膜超微結(jié)構(gòu)、滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞分泌因子（IL-1、IL-10）及滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的影響，探討新風(fēng)膠囊調(diào)節(jié)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞極化的的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（190±20）g。由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：Lscxk（皖）2017-001。動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-rats-2021022。

1.1.2 藥物與試劑 新風(fēng)膠囊（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，批號(hào)：191015）;IL-1、IL-10試劑盒（武漢基因美公司，貨號(hào)分別為JYM0419Ra、JYM0651Ra）;CD86-PE、CD206-AF647試劑（美國(guó)santa cruz生物技術(shù)公司，貨號(hào)分別為SC-19617、SC-20060）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 按照隨機(jī)對(duì)照表將將30只大鼠隨機(jī)分為正常（NC）組、模型（MC）組和新風(fēng)膠囊（XFC）組，每組10只。除NC組外，MC組和XFC組大鼠構(gòu)建成佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型[9]。致炎后第12 d開(kāi)始給藥，XFC組（0.034 g/mL）：大鼠按1 mL/100 g灌胃，1次/d;NC組及MC組：生理鹽水1mL/100 g灌胃，1次/d。各組連續(xù)用藥30 d。

1.2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)定 在造模后1 d、給藥后30 d測(cè)量各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)[10]。

1.2.3 電鏡觀察大鼠滑膜超微結(jié)構(gòu) 大鼠滑膜組織固定、脫水、包埋，組織進(jìn)行超薄切片，透射電鏡觀察攝片。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)大鼠血清細(xì)胞因子IL-1、IL-10的表達(dá) 腹主動(dòng)脈采血，離心取上清液，操作步驟依照ELISA試劑盒說(shuō)明。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血炎癥極化標(biāo)志物CD86+細(xì)胞、CD206+細(xì)胞的表達(dá) 大鼠新鮮血液100μL，按每106個(gè)細(xì)胞/管分別加入抗鼠M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD86-PE）、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD206-AF647）（0.25μg）/抗鼠。按照說(shuō)明書操作，上EPICS型流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新風(fēng)膠囊對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 與NC組相比，MC組AA大鼠Al表達(dá)顯著升高;與MC組比較，XFC組Al表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01，表 1）。

2.2 新風(fēng)膠囊對(duì)AA大鼠滑膜超微結(jié)構(gòu)影響 電鏡下NC組滑膜細(xì)胞線粒體無(wú)變形、腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，核膜邊界清楚，染色質(zhì)分布均勻，嵴突排列規(guī)整;MC組滑膜細(xì)胞呈變形、腫脹，線粒體腫脹肥大并破壞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、破壞，核膜不完整，邊界不清，染色質(zhì)分布不均，嵴突排列不規(guī)整、部分消失;XFC組滑膜細(xì)胞線粒體少量呈變形、腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，核膜邊界較清楚，染色質(zhì)較均勻，大部分嵴突排列完整（圖1）。

2.3 新風(fēng)膠囊對(duì)AA大鼠滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞分泌因子（IL-1、IL-10）的影響 與NC組相比，MC組細(xì)胞因子IL-1表達(dá)升高，IL-10表達(dá)降低;與MC組比較，XFC組IL-1表達(dá)降低，IL-10 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01，表2）。

2.4 新風(fēng)膠囊對(duì)AA大鼠滑膜M1/M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物影響 與NC組相比，MC組AA大鼠M1表面標(biāo)志物CD86+細(xì)胞表達(dá)升高，CD206+細(xì)胞表達(dá)降低;與MC組比較，XFC組CD86+細(xì)胞表達(dá)降低，CD206+細(xì)胞表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01，表3，圖2，圖2）。

3 討論

RA是一種自身免疫性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，巨噬細(xì)胞在RA的滑膜中聚集，巨噬細(xì)胞可在不同因素的誘導(dǎo)下由M1型和M2型之間相互轉(zhuǎn)換，這就是巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象。在RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，M1和M2型巨噬細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，M1型促炎巨噬細(xì)胞的比例高于M2型抗炎巨噬細(xì)胞，造成比例失衡，導(dǎo)致IL-1等炎癥細(xì)胞因子的分泌和炎癥反應(yīng)的加劇，加速機(jī)體炎癥反應(yīng)，造成局部和全身性骨丟失，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕和破壞[11-13]。

在炎癥反應(yīng)的早期階段，在應(yīng)對(duì)微生物挑戰(zhàn)以及各種炎癥因子的刺激下，巨噬細(xì)胞能極化形成M1巨噬細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞可分泌大量促炎性細(xì)胞因子（如IL-1），滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的 IL-1信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致降解軟骨的基質(zhì)金屬蛋白酶的上調(diào)和分泌，此外，當(dāng)存在T細(xì)胞衍生的核因子-κB受體活化因子配體時(shí)，IL-1會(huì)發(fā)揮促破骨細(xì)胞作用，激活成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞，加速機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨侵蝕，造成關(guān)節(jié)破壞和進(jìn)一步的關(guān)節(jié)損傷[14-15]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞是具有抗炎和抗凋亡特性的特殊細(xì)胞，這些細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制減少炎癥引起的組織損傷并創(chuàng)造適當(dāng)?shù)拿庖呶h(huán)境，同時(shí)通過(guò)IL-10影響巨噬細(xì)胞極化來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[16]。IL-10是一種關(guān)鍵的抗炎細(xì)胞因子，由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生，IL-10誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞具有減輕炎癥、吞噬功能、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分、血管生成和趨化因子產(chǎn)生的作用，同時(shí)能調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，可以起到抗炎作用[17]。IL-10 可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞生成來(lái)維持骨骼健康，在 IL-10 缺陷小鼠中進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了IL-10的重要性，其中觀察到骨質(zhì)疏松癥的所有標(biāo)志，即骨量減少、機(jī)械脆性增強(qiáng)和骨形成減少[18]。

中藥新風(fēng)膠囊（黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成）具有健脾益氣、化濕通絡(luò)功效，應(yīng)用于臨床療效確切[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)新風(fēng)膠囊治療后，AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)得到顯著改善，炎性細(xì)胞因子IL-1水平及CD80+細(xì)胞顯著降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10水平及CD206+細(xì)胞表達(dá)顯著升高，說(shuō)明新風(fēng)膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而下調(diào)IL-1、上調(diào)IL-10水平的表達(dá)，從而改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥。

綜上所述，新風(fēng)膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥。

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（收稿日期：2021-10-29）