湛江高橋紅海欖群落樣方遺傳相似性特征研究

謝秀琴 黃劍堅(jiān)

遺傳多樣性，又稱為基因多樣性，開展遺傳多樣性的研究對(duì)森林可持續(xù)管理、保護(hù)生物多樣性、維護(hù)森林生態(tài)服務(wù)功能有積極的意義[1～2]。遺傳多樣性賦予樹木必要的適應(yīng)性，使其能夠在時(shí)間和空間上可變的環(huán)境中可持續(xù)存在[3]。研究者指出，雜合子頻率的增加有利于該物種的管理，維持具有高雜合性水平的繁殖個(gè)體的種群有利于種群動(dòng)態(tài)和結(jié)構(gòu)的維持[4]。有研究者建議采取措施促進(jìn)維護(hù)遺傳多樣性，將其作為生態(tài)系統(tǒng)的組成部分[5～7]。而選擇性伐木可能導(dǎo)致特定基因和整體遺傳多樣性的喪失，影響森林穩(wěn)定性[8]，主要原因?yàn)榭撤?dǎo)致有效種群數(shù)量減少，從而導(dǎo)致等位基因的喪失并限制了交配的可能性[5]。可見，遺傳多樣性的研究對(duì)于森林經(jīng)營(yíng)和生態(tài)恢復(fù)至關(guān)重要。

紅樹林泛指在熱帶與亞熱帶地區(qū)的海岸潮間帶灘涂上生長(zhǎng)的木本植物群落，其消浪護(hù)岸、生物多樣性保護(hù)等多種生態(tài)服務(wù)功能是陸地森林所不可取代的[9]。目前，個(gè)體層次的紅樹林遺傳多樣性研究多從大尺度和中尺度層面開展[10～11]，小尺度的研究較為少見。紅海欖Rhizophora stylosa屬紅樹科的紅樹植物，為常綠灌木或小喬木，支柱根極為發(fā)達(dá)，通常形成純林，主要分布于廣西、廣東和海南等地，是沿海紅樹林生態(tài)恢復(fù)的優(yōu)選樹種[12]。本項(xiàng)目擬選擇廣東湛江紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)高橋紅樹林區(qū)中的紅海欖作為研究對(duì)象，從遺傳多樣性的重要指標(biāo)——遺傳相似性角度出發(fā)，開展紅海欖群落樣方遺傳相似性特征研究，旨在為完善生物多樣性保護(hù)、維護(hù)森林生態(tài)服務(wù)功能、開展紅樹林生態(tài)恢復(fù)等提供新的參考。

1 研究區(qū)域

高橋紅樹林區(qū)是廣東湛江紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的核心區(qū)，其位于廉江市高橋鎮(zhèn)紅樹林大道，面積超過1 200 hm2，是我國(guó)最大的紅樹林自然保護(hù)區(qū)。其中有高等植物19 種，浮游植物97種，底棲硅藻159種，魚類85種，貝類91種，蝦蟹62種，浮游動(dòng)物27種，鳥類170多種[13]。該紅樹林小區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年降水量1 550 mm左右[13]。

2 材料與方法

2.1 樣地調(diào)查與植物葉片樣品采集

對(duì)高橋紅樹林區(qū)20 m×20 m 天然紅海欖純林樣地進(jìn)行植物群落調(diào)查。先用GPS 測(cè)量樣地西南角的地理坐標(biāo)，再以該點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)，用鋼尺測(cè)量每株樹木在樣地內(nèi)的坐標(biāo)（x，y），在樣木位置圖上標(biāo)記調(diào)查木的編號(hào)。然后，對(duì)樣地內(nèi)樹木進(jìn)行每木調(diào)查，記錄樹種、樹高、胸徑、距離等林分因子，起測(cè)胸徑3 cm。隨機(jī)采集樣方內(nèi)的每一株紅海欖的健康葉片10 片，裝進(jìn)密封袋，做好標(biāo)記，放進(jìn)裝有冰袋的保溫箱，帶回放在溫度-80℃冰箱保存待測(cè)。

群落樣方位于鳳地村，樣方僅有26 株古老的紅海欖，平均樹高5.12 m，平均地徑5.43 cm，平均冠幅7.47 m，處于群落演替的后期。

2.2 測(cè)試方法

選取紅海欖嫩葉為基因組DNA提取材料，采用經(jīng)改進(jìn)的CTAB法[14]提取紅海欖基因組DNA，溫度-20℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)紅海欖基因組DNA質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)采用的均是上海生工公司合成的引物。ISSR（Inter-simple sequence repeat）引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)所公布的第9套ISSR引物。從70 個(gè)ISSR 引物篩選出擴(kuò)增效果好、條帶清晰、具有多態(tài)性的引物。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）引物參照LI G[15]已開發(fā)的引物序列。引物按照完全隨機(jī)組合的原則，共組合120對(duì)。隨機(jī)選取4個(gè)材料的DNA進(jìn)行引物篩選，利用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行引物初選，較好的引物組合利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行復(fù)選。

本實(shí)驗(yàn)采用的均是10 μL的PCR反應(yīng)體系，其中包括5 μL 2×PCR StarMix、3 μL ddH2O、1 μL紅海欖模板DNA和1μL引物。ISSR-PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，58℃復(fù)性35 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min；20℃保存。SRAP-PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；隨后94℃變性30 s，49 ℃復(fù)性50 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min；20 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后利用銀染法顯影固定出清晰的條帶。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)清晰可重復(fù)的原則，按照同一遷移位置的條帶的有無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立二元數(shù)據(jù)矩陣，輸入Excel表格中，利用NTSYS 2.02軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），遺傳距離指數(shù)則為D=1-GS。對(duì)樣方內(nèi)26 株紅海欖單株進(jìn)行UPGMA聚類分析，然后建立系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)UPGMA聚類分析來分析群落樣方紅海欖的基因流圖。

2.4 遺傳一致性評(píng)價(jià)方法

GS<0.20 代表同個(gè)樹種不同單株間遺傳相似度極低，親緣關(guān)系極遠(yuǎn)；0.20

GS最大值和最小值的差值為遺傳相似極差（genetic similarity range，簡(jiǎn)稱GSR），GSR 表示遺傳相似變動(dòng)的最大范圍。GSR<0.20 代表分子林分整體遺傳相似變動(dòng)度極低；0.20

GS的平均值（genetic similarity average，簡(jiǎn)稱GSA）表示分子林分整體遺傳相似度，GSA<0.20 代表分子林分遺傳相似度極低；0.20

2.5 種群分布格局測(cè)度方法

聚集度指標(biāo)主要采用包括擴(kuò)散系數(shù)C、叢生指數(shù)I、Cassie.R.M.指標(biāo)CA、負(fù)二項(xiàng)參數(shù)K、平均擁擠度m*、聚塊性指數(shù)指標(biāo)m*/，詳細(xì)計(jì)算方法見文獻(xiàn)[16]。

3 研究結(jié)果

3.1 紅海欖多態(tài)性位點(diǎn)分析

將種內(nèi)個(gè)體間有堿基差異的位點(diǎn)定義為多態(tài)性位點(diǎn)（polymorphic site），作為種內(nèi)多態(tài)性的標(biāo)志。從70個(gè)ISSR引物中篩選出10個(gè)多態(tài)性好、條帶清晰的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中具有多態(tài)性的位點(diǎn)有60個(gè)（表1，圖1），多態(tài)性位點(diǎn)百分率為82.2%，平均每個(gè)引物產(chǎn)生6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。從120對(duì)SRAP引物中篩選出14對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中具有多態(tài)性的位點(diǎn)有88個(gè)（表2，圖2），多態(tài)位點(diǎn)百分率為79.3%，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生6.3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。擴(kuò)增出的片段大小均在1 000 bp以下，個(gè)別片段在50 bp以下。

圖1 ISSR引物880的PCR擴(kuò)增

圖2 SRAP引物組合M11E10的PCR擴(kuò)增

表1 ISSR引物序列及多態(tài)性位點(diǎn)

表2 SRAP引物組合及多態(tài)性位點(diǎn)

3.2 紅海欖遺傳相似性特征分析

利用NTSYS 2.02軟件將ISSR和SRAP標(biāo)記合并的多態(tài)信息計(jì)算出遺傳相似系數(shù)，對(duì)樣方內(nèi)26株紅海欖單株進(jìn)行遺傳相似性分析。由表3可得，供試材料兩兩間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.327～0.741，表明樣方內(nèi)26株紅海欖單株之間的親緣關(guān)系為遠(yuǎn)和較近的分布區(qū)間；平均值為0.563，說明分子林分遺傳相似度中等；差值為0.414，說明分子林分遺傳相似變動(dòng)度中等。紅海欖14和紅海欖16間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.741，說明兩者在樣方中親緣關(guān)系最近；紅海欖15和紅海欖10間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.327，說明兩者間具有較大的遺傳分化，在樣方中親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 紅海欖分子林分遺傳相似系數(shù)

對(duì)樣方內(nèi)26 株紅海欖單株進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到親緣關(guān)系樹狀圖（圖3）。由此可得，在相似系數(shù)0.55 的水平下，26 株紅海欖單株主要分為3個(gè)類群：1）紅海欖2、11和12 聚為一個(gè)類群，遺傳相似極差為0.17，遺傳相似變動(dòng)度極低；遺傳相似平均值為0.624，遺傳相似度高。2）1、3、5、9、10、19、26為一個(gè)類群，遺傳相似極差為0.183，種群遺傳相似變動(dòng)度極低；遺傳相似平均值為0.589，種群遺傳相似度中等。3）其余4、13、14等16株紅海欖單株為第三類群，遺傳相似變動(dòng)度極低和遺傳相似度高。遺傳相似變動(dòng)度為第三類群>第二類群>第一類群；遺傳相似度為第一類群>第二類群>第三類群。群落樣方以第三類群為優(yōu)勢(shì)種，占據(jù)環(huán)境資源更多，第一類群最少，為弱勢(shì)類群?？傮w上3個(gè)類群之間存在一定的基因交流。

圖3 基于ISSR和SRAP的紅海欖UPGMA聚類圖

在相似系數(shù)0.60的水平上可分為8類：紅海欖單株2和單株26各單獨(dú)為一類，1和3為一類，5、9、10與19為一類，6、18、21和22為一類；20、24和25為一類，11與12為一類，其余4、13、14等9株為一類。同個(gè)樣方內(nèi)的紅海欖不同單株分屬于不同的類群。

3.3 紅海欖不同種群遺傳相似性分布特征

相似系數(shù)0.55的水平下紅海欖類群分布格局有所不同（表4）。結(jié)合紅海欖遺傳相似性特征分析結(jié)果可知，聚集程度越強(qiáng)，種群遺傳相似度越高，種群遺傳相似變動(dòng)度越低。

表4 相似系數(shù)0.55水平不同紅海欖類群的分布格局

4 討論

生物遺傳多樣性是物種適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化和長(zhǎng)期生存下來的重要遺傳基礎(chǔ)。目前紅樹林遺傳多樣性的研究多從大尺度和中尺度的角度研究不同地理種源的遺傳多樣性[10，17]。本文從小尺度通過ISSR和SRAP兩種標(biāo)記方法開展紅海欖遺傳相似性研究，并結(jié)合了分布格局開展了不同類群遺傳相似性分布規(guī)律分析。初步研究結(jié)果表明，廣東高橋紅樹林區(qū)樣方內(nèi)的紅海欖具有較高的多態(tài)性位點(diǎn)百分率，遺傳多樣性較為豐富，紅海欖單株之間處于親緣關(guān)系為遠(yuǎn)和親緣關(guān)系為較近的分布區(qū)間，遺傳相似度中等，遺傳相似變動(dòng)度中等。高橋紅海欖純林為成熟林，樹齡為70～80 年，處于群落演替的中后期，林下更新幼苗較少，紅海欖群落樣方的平均遺傳相似度為0.563，遺傳相似度中等，是合理的。

在相似系數(shù)0.55的水平下紅海欖群落樣方類群分為3大類，說明可能有來自其他區(qū)域的紅海欖種群，樣方內(nèi)的紅海欖類群在遺傳上有較大差異。在三大紅海欖類群的交叉影響下，紅海欖群落樣方遺傳相似度中等，遺傳相似變動(dòng)度中等，結(jié)果可信。肖蘭[18]和鄒禎[19]等開展了紅樹林小尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果表明紅樹林樹種秋茄樹Kandelia obovata、白骨壤Avicennia marina和紅樹Rhizophora apiculata等純林和混交林具有高水平的遺傳多樣性，純林并未因?yàn)槲锓N單一而出現(xiàn)遺傳上的負(fù)面效應(yīng)。本文研究結(jié)果與肖蘭[18]和鄒禎[19]對(duì)比，直接驗(yàn)證了即使是紅樹林純林也具有較大遺傳分化的研究結(jié)果，這可能得益于其他區(qū)域的紅海欖種群的胎生繁殖體漂流到廣東高橋紅海欖區(qū)域，建立了目前3個(gè)紅海欖類群的純林群落樣方。有研究[20]指出，生境破壞和破碎化提高了親緣關(guān)系相近物種之間的交配，長(zhǎng)期發(fā)展可能會(huì)導(dǎo)致近交衰退，進(jìn)而降低種群的適合度。由于紅樹林為陸海潮間帶的森林，不同地區(qū)種源的胎生繁殖體能通過漂流進(jìn)行交流和定植[11]，即使是純林或者小群落，也不一定因生境破壞和破碎化而提高親緣關(guān)系相近物種之間的交配。

與前人的研究對(duì)比，本文提出了遺傳相似性結(jié)合了種群分布格局的研究方法，更深入分析了群落樣方內(nèi)紅海欖不同種群遺傳相似性與樹種分布格局之間的關(guān)系。本文研究結(jié)果表明，三大種群呈現(xiàn)出聚集程度越強(qiáng)，種群遺傳相似度越高，種群遺傳相似變動(dòng)度越低的規(guī)律。這是目前大部分紅樹林遺傳多樣性研究并未報(bào)道的研究結(jié)果，該結(jié)果可為紅樹林的經(jīng)營(yíng)管理以及生態(tài)恢復(fù)提供重要的參考。本文只研究了一個(gè)20 m×20 m 的高橋紅海欖純林典型樣方，可能還存在樣本不足的問題。以后的研究將在不同區(qū)域、不同紅樹林樹種的不同樣帶設(shè)置3個(gè)以上樣方，開展不同潮帶小尺度紅樹林遺傳多樣性的分布規(guī)律和影響機(jī)制等相關(guān)研究。同時(shí)，本研究采用ISSR和SRAP兩種標(biāo)記方法開展研究，相對(duì)于基因測(cè)序技術(shù)，ISSR 和SRAP擴(kuò)增得到的數(shù)據(jù)非常有限。但是，ISSR和SRAP兩種標(biāo)記方法較為簡(jiǎn)單，方法更為成熟，不需借助昂貴的儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室可以快速以更低的成本初步開展紅海欖遺傳相似性的研究，驗(yàn)證最初的猜測(cè)，得到較為理想的結(jié)果，以便開展往后的深入研究。往后的研究需要借助測(cè)序技術(shù)，完成紅海欖全基因組的測(cè)序，以及開展重測(cè)序，更深入了解中國(guó)紅海欖的遺傳多樣性特征。

5 結(jié)論

高橋紅海欖分子林分具有較為豐富的遺傳多樣性，分屬于不同的類群，在遺傳上有差異性，存在一定的基因交流；親緣關(guān)系為遠(yuǎn)和較近之間，遺傳相似度和變動(dòng)度中等，以第三種群為優(yōu)勢(shì)種，第一種群為弱勢(shì)種群，而一個(gè)區(qū)域或者同個(gè)采樣地的同個(gè)樹種可能存在多個(gè)種群。初步證明紅海欖種群聚集度與遺傳相似度成正比，與種群遺傳相似變動(dòng)度成反比。因此，在當(dāng)前高橋紅海欖林的ISSR/SRAP分子標(biāo)記方法研究基礎(chǔ)上，將采用重測(cè)序的方法，在天然林和人工林開展下一步的遺傳多樣性分析工作，為營(yíng)造近自然的人工生態(tài)林，調(diào)整單一種群的紅海欖人工林提供有效的理論指導(dǎo)。

注：圖片均為作者自攝自繪