經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后替格瑞洛及其代謝物濃度測定LC-MS方法的建立和應(yīng)用

秦 軍，王 楠，相 芳，初曉玲，李 祥，陳 群，初曉倩

0 引 言

隨著社會(huì)生活條件的日益提高，急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)也逐漸呈年輕化的趨勢，其中高血壓、糖尿病、血脂異常以及炎癥等均是導(dǎo)致ACS發(fā)病的危險(xiǎn)因素[1]。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂或侵蝕導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成，成為多數(shù)ACS發(fā)病的基礎(chǔ)[2]，血小板激活在其中起著重要作用[3]。有效的抗血小板治療成為預(yù)防ACS血栓事件的重要手段。近年來，P2Y12受體抑制劑聯(lián)合小劑量阿司匹林(75～150 mg)被認(rèn)為是ACS患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[4]。氯吡格雷受基因多態(tài)性影響，常產(chǎn)生氯吡格雷抵抗，繼而引起心血管不良事件風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。替格瑞洛作為一種可逆的、直接作用的P2Y12受體抑制劑，用于降低ACS患者的血栓事件(心肌梗死、中風(fēng))風(fēng)險(xiǎn)，具有比氯吡格雷更快、更強(qiáng)、更一致的特點(diǎn)，而不增加總體大出血率[6-7]。PLATO研究后，國內(nèi)外指南推薦替格瑞洛作為急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者首選的P2Y12血小板抑制劑。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，目前中國ACS患者PCI術(shù)后替格瑞洛的常規(guī)給藥劑量可能偏高，存在一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)，但尚缺乏相應(yīng)的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。有研究表明，替格瑞洛血藥濃度與出血事件成正相關(guān)[8]。ACS患者往往存在高齡、女性、腎功能不全、貧血、低BMI、合用口服抗凝劑等出血風(fēng)險(xiǎn)因素[9]，用藥風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加大，臨床需要關(guān)注替格瑞洛的用藥安全性，目前國內(nèi)有關(guān)ACS患者替格瑞洛血藥濃度及其與人群特征關(guān)系的研究較少。因此，本研究旨在建立ACS患者PCI術(shù)后定量測定替格瑞洛血漿濃度的LC-MS/MS方法并觀察其特征分布，為臨床建立可靠的監(jiān)測方法，為替格瑞洛的安全、有效應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究為隨機(jī)單中心研究，研究對象為2020年9月至2022年1月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)確診為ACS以及需要植入藥物洗脫支架的患者120例。所有受試者在參與前均提供書面知情同意書，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：81YY-KYLL-19-13)，且研究是根據(jù)臨床實(shí)踐協(xié)調(diào)準(zhǔn)則國際會(huì)議和赫爾辛基宣言進(jìn)行的。入組標(biāo)準(zhǔn)：①確診為ACS以及使用替格瑞洛的患者；②規(guī)律使用替格瑞洛的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對阿司匹林、替格瑞洛等藥物不耐受的患者；②急性心衰或心源性休克、心律失常的患者；③活動(dòng)性消化道潰瘍、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤的患者；④血液系統(tǒng)疾病、出血性疾病或有出血傾向的患者；⑤在研究過程中服藥依從性差，包括酒精濫用、精神疾病、藥物依賴的患者；⑥孕婦或者哺乳期婦女；⑦因合并其他疾病，預(yù)期生存期不超過 1 年的患者.

1.2 方法學(xué)的建立和濃度測定

1.2.1 血樣的采集符合入組要求的患者，入院后口服治療劑量替格瑞洛藥(90 mg，1天2次)，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后(約3～5個(gè)半衰期，約30～50 h)，于下次服藥前1 h左右采集靜脈血，2 h內(nèi)分離血漿并轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，-80 ℃保存，并由本單位完成濃度測定及數(shù)據(jù)采集。

1.2.2 替格瑞洛及其他心血管藥物L(fēng)C-MS/MS方法學(xué)的建立①試劑(規(guī)格，廠家，批號)：空白血清(NA，東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)，NA)，甲醇(MS級，F(xiàn)isher，201603)，乙腈(HPLC級，F(xiàn)isher，196024)，甲酸(MS級，F(xiàn)isher，193068)，純水(MS級，Honeywell，DY616)。②標(biāo)準(zhǔn)品名稱(純度，來源，批號)：替格瑞洛(97%，TRC，2-AGE-110-1)；替格瑞洛-d7(96%，TRC，4-AKT-180-5)；去羥乙氧基替格瑞洛(98%，TRC，27-MJC-49-1)；去羥乙氧基替格瑞洛-d7(99.75%，TRC，3-MSI-60-2)；藥品信息：替格瑞洛片90 mg/片(商品名：倍林達(dá)，廠家：阿斯利康制藥有限公司，批號：2005047、2007087、200834及2009063)。③儀器(型號，廠家)：液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY HPLC-MS-Class，Waters corporation)，高速冷凍離心機(jī)(Heraeus FRESC021，日立(日本))，純水儀(Unique-R10，銳思捷(廈門)純化技術(shù)公司)，渦旋混合儀(G560E，美國Scientific Industries)，移液器(2-20、10-100、20-200、100-1000 μL，Thermo)，電子天平(XSR205(十萬分之一)，METTLER TOLEDO)，超聲波清洗機(jī)(SB-3200DTD，寧波新芝生物科技公司)，醫(yī)用保存箱(2～8 ℃)(MPR-312DCN-PC，Panasonic Appliances Cold(大連))，低溫保存箱(-20 ℃)(DW-YL270，美菱生物醫(yī)藥(安徽))，超低溫保存箱(-70 ℃)(MDF-U54V，Panasonic Healthcare(上海))，量筒(100、500 mL，博美、金正)。④色譜條件：流動(dòng)相A：0.1% 甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；色譜柱：Kinetex 2.6 μm XB C18，50mm×3 mm。⑤質(zhì)譜條件：質(zhì)譜離子源參數(shù)，Capillary(V)：3000(ESI+)4000(ESI-)；Nozzle Voltage(V)：200(ESI+)500(ESI-)；Gas Temp(℃)：300；Gas Flow(L/min)：7；Nebulizer(psi)：45；Sheath Gas Temp(℃)：300；Sheath Gas Flow(L/min)：11。⑥檢測對象：替格瑞洛(Ticagrelor，TIC)、去羥乙氧基替格瑞洛(Deshydroxyethoxy Ticagrelor，DHTIC)。⑦標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取各藥物標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱取純度分別為97%及98%的替格瑞洛和活性代謝物，加入1.808和0.979 mL的溶劑，渦旋均勻得到濃度分別為2 mg/mL和1 mg/mL的化合物儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取母液濃度2000 μg/mL的替格瑞洛及濃度1000 μg/mL的其活性代謝物10 μL，各自加入80%乙腈溶液443 μL，充分混勻得到0.5 mL濃度分別為40 000及20 000 ng/mL混合標(biāo)溶液(S0)。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取純度分別為96%的TIC-d7及99.75%的DHTIC-d7，加入0.959 mL和0.998 mL溶劑，渦旋均勻得到濃度分別為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的藥物同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取體積為5 μL的TIC-d7及DHTIC-d7的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，分別加入80%乙腈溶液440 μL，充分混勻得到2種0.5 mL濃度均為1500 ng/mL的10倍內(nèi)標(biāo)SI溶液，使用時(shí)用乙腈稀釋10倍，可得到濃度均為150 ng/mL的2種內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 血漿樣品的處理用移液器準(zhǔn)確移取待測標(biāo)本50 μL于標(biāo)記好的1.5 mL EP管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液(IS-1)，加入180 μL乙腈，渦旋均勻；振蕩5 min，14 800 r/min，4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)移EP管中的上清液80 μL待進(jìn)樣，進(jìn)樣量為3 μL。

1.4 相關(guān)參數(shù)考察分別對樣品的特異性、回收率、準(zhǔn)曲線制備及定量下限測定、基質(zhì)效應(yīng)、批內(nèi)、批間精密度試驗(yàn)、準(zhǔn)確度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行考察，確保符合樣本定量檢測的要求。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 特異性在實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，DHTIC、DHTIC-d7、TIC、TIC-d7各目標(biāo)藥物及同位素內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間分別為3.5、3.48、3.51、3.51 min。目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測定血漿中的替格瑞洛及其活性代謝物的濃度，靈敏度較高。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限TIC歸方程為Y=0.022615X+0.008650(R2=0.99922869)；DHTIC直線回歸方程為Y=0.028250+0.028721(R2=0.99920823)；目標(biāo)物在合適范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。另外，各藥物在在血漿中的定量下限見表1。

表1 替格瑞洛及其活性代謝物的定量下限(n=6)

2.1.3 回收率試驗(yàn)(絕對回收率)及基質(zhì)效應(yīng)不同濃度的2種藥物其回收率均在80%～110%之間，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)均小于10%，符合回收率的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。不同濃度的各種藥物(高、中、低)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子平均值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性代謝物在5、100、800 ng/mL及150 ng/mL內(nèi)標(biāo)中其ME平均值均在合理范圍內(nèi)，替格瑞洛在10、200、1600 ng/mL及內(nèi)標(biāo)150 ng/mL中其ME平均值也均在合理范圍內(nèi)。

2.1.4 精密度與準(zhǔn)確度以高、中、低3個(gè)濃度對連續(xù)5批次各藥物樣品的批件和批內(nèi)RSD進(jìn)行考察，結(jié)果顯示各藥物樣品批內(nèi)及批間RSD均在15%以內(nèi)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品分析方法的要求。見表2。

表2 不同濃度對連續(xù)5批次各藥物樣品HPLC-MS/MS法的批內(nèi)、批間精密度考察

2.1.5 穩(wěn)定性考察不同濃度的2種藥物(高、中、低)樣品立刻進(jìn)樣，室溫放置6 h，4 ℃冰箱放置24 h，以及-80 ℃條件下反復(fù)凍融下測定，RE值均在合理范圍之內(nèi)，表明2種藥物在上述條件下均保持穩(wěn)定。見表3。

表3 人體血漿中替格瑞洛及其活性代謝物穩(wěn)定性

2.2 臨床特征

2.2.1 患者基本資料入組120例行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)的急性冠脈綜合征患者根據(jù)性別將其分組，納入年齡、體重、心血管危險(xiǎn)因素、臨床分型、合并用藥等臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)2組患者在年齡(P=0.001)、吸煙(P=0.000)、飲酒(P=0.000)、PCI術(shù)后(P=0.000)及合并用地爾硫卓(P=0.004)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 替格瑞洛及活性代謝物穩(wěn)態(tài)谷濃度在不同年齡段的分布特征和相關(guān)性通過上述LC-MS/MS方法學(xué)的建立，并根據(jù)WHO對年齡段的劃分，對入組患者藥物穩(wěn)態(tài)谷濃度進(jìn)行監(jiān)測并分析了濃度與年齡之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)替格瑞洛及其活性代謝物3組之間濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.078)，但替格瑞洛谷濃度在≤50歲與>60歲2組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，替格瑞洛血藥濃度與年齡呈正比。見表4。

表4 不同年齡段之間的替格瑞洛及其活性代謝物谷濃度的差異性

3 討 論

根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，替格瑞洛及ARC-124910XX的離子掃描模式正、負(fù)離子模式均有[10-11]。實(shí)驗(yàn)前期，我們比對了目標(biāo)物在正負(fù)離子模式下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下存在干擾峰而最終選擇負(fù)離子掃描模式；另外本實(shí)驗(yàn)參考了柯東升等[12]研究，發(fā)現(xiàn)采用0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相保留時(shí)間，峰形等均良好。本研究成功建立了測定臨床心血管抗血小板藥物替格瑞洛的LC-MS/MS法。經(jīng)考察，該方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定且簡便。

一項(xiàng)亞洲人群ACS患者的薈萃分析結(jié)果顯示[13]，相比于氯吡格雷的雙聯(lián)抗血小板方案，雖然替格瑞洛致命性出血的發(fā)生率沒有差異，卻顯著增加了其他出血事件(如非致命性大出血、輕微出血等)的風(fēng)險(xiǎn)。除增加出血風(fēng)險(xiǎn)外，隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)[14]，接受PCI并服用替格瑞洛長達(dá)1年的ACS患者中，呼吸困難風(fēng)險(xiǎn)也有顯著增加。

本研究對入組患者的基本資料分析發(fā)現(xiàn)，2組患者(以性別分組時(shí))在年齡、吸煙、飲酒、PCI術(shù)后及合并用藥等方面可能存在差異性。另外，在對年齡進(jìn)行分段研究發(fā)現(xiàn)替格瑞洛血藥濃度隨著年齡增加而增加，且在≤50歲與>60歲2組之間存在顯著性差異，表明年齡段與谷濃度可能存在相關(guān)性，且呈正相關(guān)，但仍需進(jìn)一步的臨床研究。一項(xiàng)對40名健康人群的研究發(fā)現(xiàn)[15]，接受200 mg替格瑞洛后，年齡≥65歲患者較年輕者AUC和Cmax分別增加52%和63%；女性比男性患者的AUC和Cmax分別高37%和52%，證實(shí)了年齡、性別對藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)的影響；因所有入組患者血小板聚集抑制率均達(dá)標(biāo)，因此研究者認(rèn)為年齡、性別對療效影響沒有臨床意義。這可能與替格瑞洛本身抑制血小板聚集功能較強(qiáng)有關(guān)，但其樣本量較少，且PK/PD的差異性與出血、呼吸困難等不良反應(yīng)的相關(guān)性還有待研究。既往研究顯示替格瑞洛出血風(fēng)險(xiǎn)增加，與女性、年齡>75歲，同時(shí)使用非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和抗栓藥物有關(guān)[16]。REPLACE-2研究顯示[17]，女性患者是PCI術(shù)后發(fā)生出血事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，機(jī)制尚未完全明了，可能與微血管病變、血管相關(guān)并發(fā)癥以及相對于低體重指數(shù)的過度抗凝有關(guān)。

本研究通過對120例PCI術(shù)后ACS患者的血漿樣本進(jìn)行分析，建立了ACS患者PCI術(shù)后血漿中替格瑞洛及其代謝物HPLC—MS/MS測定法，方法穩(wěn)定且符合生物樣品定量分析要求，并成功應(yīng)用于臨床。從血藥濃度監(jiān)測的結(jié)果證實(shí)了替格瑞洛谷濃度與不同人群特征之間可能存在相關(guān)性，這不僅豐富了替格瑞洛在中國冠心病患者人群中的研究，對指導(dǎo)ACS患者抗血小板藥物的個(gè)體化治療和開展有效性、安全性臨床研究提供了一定的參考價(jià)值。