血小板輸注無效患者外周血T、B、NK 細(xì)胞和血小板抗體表達(dá)

張玲 孫慶正 王曉珍 劉加軍

血小板輸注是指通過補(bǔ)充外源性血小板，從而預(yù)防和治療血小板功能異?；蛘哐“鍞?shù)量下降引起的出血。血小板輸注是目前治療各種血液病的有效支持治療［1］。但血小板輸注過程中可能會(huì)出現(xiàn)血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR），尤其常見于反復(fù)多次輸血小板這類患者中，發(fā)生率約38.3%至40.9%，患者血小板數(shù)量未見提高，出血癥狀無明顯改善［2-4］。本研究擬通過分析血小板輸注無效患者外周血中T、B、NK 細(xì)胞比例和血小板特異性抗體表達(dá)，探討其在血小板輸注無效中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

以2018 年1 月至2021 年12 月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院收治的22 例血小板輸注無效的患者作為研究對(duì)象，其中急性髓系白血病（AML）14 例，急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）8 例，男8 例，女14 例，平均年齡（46.09±3.253）歲。以33 例輸注有效的患者作為對(duì)照組，其中急性髓系白血?。ˋML）24 例，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）9 例，男18 例，女15 例，平均年齡（43.67±3.24）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①急性髓系白血病或者急性淋巴細(xì)胞白血??；②簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①脾功能亢進(jìn)，抗血小板藥物，彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等引起的血小板輸注無效；②缺失重要診療信息的患者。所有患者均簽署知情同意書。該研究符合中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院相關(guān)倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 患者外周血T、B、NK 淋巴細(xì)胞比例檢測(cè)

留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，PBS 液洗滌后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（1～10）×109/L；按比例分別加人CD19、CD3、CD4、CD8、CD56 和CD45 抗體（Becton Dickinson 公司），室溫避光孵育20 min；然后再加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育10 min，用PBS 液洗滌，離心后棄上清；加入500 μL PBS 液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，以CD45-SSC 設(shè)門圈出淋巴細(xì)胞，計(jì)算T 淋巴細(xì)胞亞群（CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+）比例，B 淋巴細(xì)胞（CD19+），NK 細(xì)胞（CD56+）比例。

1.2.2 血小板特異性抗體檢測(cè)

血小板表面攜帶有血小板特異性抗原（HPA），通過固相凝集法檢測(cè)血小板特異性抗體（HPA 抗體），留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，4 000 rpm，離心半徑為16.3 cm，離心5 分鐘后取上層血漿，凍存至負(fù)80 度冰箱待檢。按照血小板抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板特異性抗體表達(dá)情況比較

無效組血小板特異性抗體表達(dá)陽性率明顯高于有效組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血小板輸注患者血小板特異性抗體表達(dá)情況［n（%）］Table 1 The expression of platelet specific antibody in patients received platelet transfusion［n（%）］

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T、B、NK 淋巴細(xì)胞比值

與有效組相比較，無效組患者外周血B 細(xì)胞升高，CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞下降，CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞升高，CD4+/CD8+比值下降，CD3+T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞比例，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 血小板輸注患者外周血T、B、NK 細(xì)胞比例（%）Figure 1 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

表2 血小板輸注患者外周血T、B、NK 細(xì)胞比例（%）Table 2 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

3 討論

血小板輸注是治療血小板減少的有效手段。在需要長期血小板支持性治療的患者中，血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）是常見的臨床棘手問題，其發(fā)生時(shí)，外源性輸入的血小板迅速被破壞，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。血小板輸注無效是指連續(xù)兩次或者兩次以上輸注血小板，輸注后10 分鐘至1 小時(shí)，血小板計(jì)數(shù)增加指數(shù)＜5×109/L［5］。

PTR 發(fā)生的常見原因包括非免疫因素和免疫因素。非免疫因素主要為機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、服用抗血小板藥物、脾功能亢進(jìn)、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等，導(dǎo)致血小板消耗過多或破壞增加，從而引起血小板輸注無效。這些可通過祛除病因和對(duì)癥治療來提高血小板輸注效果［6］。免疫性因素主要指同種異體免疫，即輸注的外源性血小板，作為同種異體抗原，誘發(fā)機(jī)體的同種異體免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致血小板輸注無效［7-8］。

血小板表面攜帶人類白細(xì)胞抗原（HLA）、血小板特異性抗原（HPA），可產(chǎn)生的HPA 抗體、HLA抗體和HLA/HPA 復(fù)合抗體，這些抗體是導(dǎo)致無效輸注發(fā)生的主要原因［9-12］。在本研究中我們分析了血小板輸注無效組和有效組血小板特異性抗體（抗HPA 抗體）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無效組血小板特異性抗體陽性率明顯高于有效組（86.36% vs 15.15%，P＜0.01），提示血小板特異性抗體在血小板輸注無效中發(fā)揮重要作用，與研究報(bào)道相符［13］。臨床上通過檢測(cè)血小板特異性抗體及輸注配型血小板有助于預(yù)防血小板輸注無效的發(fā)生。

血小板輸注后引起的同種異體免疫需要啟動(dòng)和激活特異于源自血小板抗原肽的CD4+T 細(xì)胞，CD4+T 細(xì)胞激活后反過來刺激B 淋巴細(xì)胞，B 細(xì)胞進(jìn)一步分化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白G（IgG）抗體，這些抗體可結(jié)合血小板表面，從而導(dǎo)致血小板輸注無效［14］。

目前關(guān)于機(jī)體產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。因此，我們分析了血小板輸注患者外周血T、B 和NK 細(xì)胞比例，以探討血小板輸注無效可能的免疫機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，血小板輸注無效患者外周血中B 淋巴細(xì)胞比例升高，B 淋巴細(xì)胞可能進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生血小板抗體從而引起血小板輸注無效，提示臨床上可使用利妥昔單抗提高血小板輸注效果。

T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用，CD3 僅存在于T 淋巴細(xì)胞表面，參與抗原識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。T 淋巴細(xì)胞亞群分為輔助性T 淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，CD4 為輔助性T 淋巴細(xì)胞的主要標(biāo)記，具有刺激B 淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，輔助T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成效應(yīng)細(xì)胞。CD8為細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的主要標(biāo)記，通過分泌細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫。本研究通過CD45 設(shè)門圈出淋巴細(xì)胞，CD3 標(biāo)記T 淋巴細(xì)胞，然后通過CD4，CD8標(biāo)記CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞，CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞，分析T 淋巴細(xì)胞亞群變化，發(fā)現(xiàn)PTR 患者較有效組CD3+CD8+T 細(xì)胞比例增高，而CD3+CD4+T 細(xì)胞比例減低，提示CD8 陽性T 淋巴細(xì)胞在血小板輸注無效中發(fā)揮重要作用，與研究報(bào)道相符［15］。CD4 陽性T 細(xì)胞與CD8 陽性T 細(xì)胞的比值保持動(dòng)態(tài)平衡，從而維持機(jī)體的細(xì)胞免疫。本研究發(fā)現(xiàn)血小板輸注無效患者CD4+/CD8+比值下降，T 淋巴細(xì)胞比例失衡，CD8+T 淋巴細(xì)胞增高，促進(jìn)B 細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體，從而導(dǎo)致血小板輸注無效。

NK 細(xì)胞稱自然殺傷細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，CD56 是NK 細(xì)胞的表面標(biāo)志物。目前關(guān)于NK細(xì)胞在PTR 中的作用尚不明確，本研究尚未觀察到NK 細(xì)胞在血小板輸注中的差異，可能與本研究樣本量偏少有關(guān)，未來尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確NK細(xì)胞在血小板輸注無效中的作用及可能的機(jī)制。

綜上所述，血小板特異性抗體表達(dá)，T、B 淋巴細(xì)胞異常在血小板輸注無效中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步探討血小板輸注無效的發(fā)生機(jī)制，有助于預(yù)防和治療血小板輸注無效。