中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在急性缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

徐躍軒 趙曉麗

急性缺血性腦卒中又稱急性腦梗死，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧性壞死而迅速出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。據(jù)全球疾病 負(fù) 擔(dān) 2017（Global Burden of Diseases2017，GBD2017）顯示，缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)死亡和永久性殘疾的主要原因之一［1］。在美國，每年有近70 萬人經(jīng)歷新發(fā)或復(fù)發(fā)性缺血性卒中，有3%的美國人口受到卒中的影響，卒中已成為美國第五大死亡原因［2］。我國住院急性缺血性腦卒中患者發(fā)病后3 個月時(shí)病死率9%～9.6%，致死/殘疾率為34.5%～37.1%［3］。最近有研究發(fā)現(xiàn)活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular traps，NETs）可以捕獲微生物以阻止其傳播，并可以保持局部高濃度的抗菌藥物以降解毒素、殺滅細(xì)菌［4］。但近來有研究證實(shí)NETs 與急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。本文將圍繞NETs的形成及其在急性缺血性腦卒中的意義進(jìn)行概述。

1 NETs 概述

1.1 NETs 的發(fā)現(xiàn)及構(gòu)成

2004 年Brinkmann 等［4］人首次發(fā)現(xiàn)了活化的中性粒細(xì)胞會向胞外釋放一種由解聚的DNA 及多種顆粒蛋白組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即NETs。NETs 的主要成分為DNA，主要蛋白質(zhì)成分為組蛋白（Histone，H），主要是組蛋白H2A，H2B，H3 和H4，其他蛋白質(zhì)成分包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、乳鐵蛋白、凝膠酶、防御素、鈣衛(wèi)蛋白和抗菌肽等［4］。

1.2 NETs 的形成機(jī)制

Brinkmann 等［4］人發(fā)現(xiàn)NETs 在中性粒細(xì)胞激活后10 分鐘形成，其進(jìn)程早于細(xì)胞凋亡。Fuchs 等人認(rèn)為NETs 形成不同于細(xì)胞凋亡和壞死，是一種新的中性粒細(xì)胞的死亡方式［6］。研究表明，誘導(dǎo)NETs 形成的因素諸多，如細(xì)菌、病毒、真菌、白介素-8、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、自身抗體、佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA）等均可誘導(dǎo)NETs 形成。

近年來的研究證實(shí)，不同的誘導(dǎo)因素所介導(dǎo)的NETs 形成方式也有所不同。其中最為經(jīng)典且研究最為詳細(xì)的為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）途徑。Fuchs 等人證實(shí)了NETs 形成依賴于NADPH 產(chǎn)生的ROS［6］。在PMA 或者LPS 等刺激因素作用下，在NADPH 酶生成的ROS 和鈣離子的作用下，蛋白精氨酸去亞胺酶4（Peptidylarginine deiminase 4，PAD4）誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的組蛋白H3瓜氨酸化及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致染色質(zhì)去聚化，ROS 作為第二信使作用于MPO 和NE 從胞質(zhì)顆粒遷移到細(xì)胞核內(nèi)，增強(qiáng)染色質(zhì)去聚化及促使核膜破裂，進(jìn)而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞釋放解聚的核DNA 及相關(guān)顆粒蛋白組成NETs［7-9］。同時(shí)，Li 等［8］人的研究表明PAD4 的活性對于NETs 的形成也至關(guān)重要［9］。Hakkim 等人證實(shí)Raf-MEK-ERK 通路位于NADPH 氧化酶的上游，參與了NETs 的形成。Kang 等［10］人證實(shí)了銀納米粒子（AgNPs）也是通過NADPH 依賴ROS 途徑誘導(dǎo)NETs 形成。

其他誘導(dǎo)途徑如金黃色葡萄球菌可以激活Toll 樣受體2（Toll like receptor 2，TLR2）及補(bǔ)體途徑誘導(dǎo)NETs 形成，但需要TLR2 和補(bǔ)體同時(shí)存在，單獨(dú)的TLR2 或補(bǔ)體存在均不能誘導(dǎo)NETs 形成［11］。金黃色葡萄球菌還可以通過一些成孔毒素如γ 溶血素在中性粒細(xì)胞核膜上形成孔，誘導(dǎo)組蛋白、含有MPO 和NE 的顆粒蛋白釋放到胞外來刺激NETs 形成［12］。除此之外，肌動蛋白骨架重排、梗死灶周圍的酸堿環(huán)境、氧濃度和鐵離子也可能影響NET 的形成［5，13］。

1.3 NETs 的檢測

NETs 的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，至今尚未統(tǒng)一檢測指標(biāo)及方法，但在近些年的研究中，瓜氨酸組蛋白H3（Citrullinated histone H3，citH3）被 普 遍 用 于NETs 的檢測，通常用citH3 的含量代表NETs 的含量［14-15］。除此以外，由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的游離胞外DNA（Cell-free DNA，cfDNA）作為NETs 的主要成分也常用于NETs 的檢測，而NE、MPO 等NETs 的蛋白組分也被廣泛應(yīng)用于NETs 的雙通道檢測。

2 NETs 的分類

根據(jù)中性粒細(xì)胞的形態(tài)變化，NETs 可分為三種類型：①suicidal NETosis：由細(xì)胞溶解性死亡釋放NETs，細(xì)菌、真菌、病毒、PMA、白介素-8 等誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞通過NADPH 依賴性ROS 途徑釋放解聚的核DNA 及相關(guān)顆粒蛋白組成的NETs，通常在2～20 小時(shí)內(nèi)發(fā)生；②Vital NETs：由活細(xì)胞將NETs通過囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞结尫胖涟?，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞通過依賴TLR2 途徑釋放核DNA等組成的NETs，通常在10～60 分鐘內(nèi)發(fā)生；③mitochondrial NETs：由活細(xì)胞釋放的NETs，經(jīng)過粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）預(yù)處理，中性粒細(xì)胞在LPS 或補(bǔ)體因子5a 刺激下釋放由線粒體DNA組成的NETs，通常在15～20 分鐘內(nèi)發(fā)生［16］。

3 NETs 在急性缺血性腦卒發(fā)生中的作用

依據(jù)局部腦組織發(fā)生缺血壞死的機(jī)制可將缺血性腦卒中分為三種主要病理生理學(xué)類型：腦血栓形成（Cerebral thrombosis）、腦栓塞（Cerebral embolism）和血流動力學(xué)機(jī)制所致的缺血性腦卒中。腦血栓形成和腦栓塞均是由于腦供血動脈急性閉塞或嚴(yán)重狹窄所致，約占全部急性腦梗死的80%～90%。最近，大量的研究發(fā)現(xiàn)NETs 與腦血栓形成有關(guān)［5，17］。

3.1 NETs 在動脈粥樣硬化中的作用

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見病因，其隨著年齡的增長而加重，高齡、高血壓病、高脂血癥、吸煙、糖尿病是其重要的危險(xiǎn)因素。近年來，有研究證實(shí)NETs 可以促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。NETs 形成后反饋誘導(dǎo)DNase 反應(yīng)，這也是NETs 清除的重要機(jī)制。Dhawan 等［18人發(fā)現(xiàn)高固醇血癥會損害Apoe-/-小鼠的DNase 反應(yīng)，導(dǎo)致NETs 清除延遲并加重炎癥，通過外源性補(bǔ)充DNase1 清除NETs 后，炎癥減輕并出現(xiàn)了有益的動脈粥樣硬化斑塊重塑］，這表明了調(diào)節(jié)NETs 在體內(nèi)的水平可能成為延緩或阻止動脈粥樣硬化進(jìn)展的治療手段。

3.2 NETs 在腦血栓形成中的作用

血栓形成是在某些誘導(dǎo)因素下血液中的有形成分聚集，形成固體質(zhì)塊的過程。近年來大量的研究證實(shí)NETs 在血栓形成部位存在，為血栓的組分之一［19-20］。

2017 年Laridan 等［19］人采用免疫組化及免疫熒光染色法首次證實(shí)了缺血性腦卒中的血栓中存在NETs，且其為缺血性腦卒中的血栓的共同組分。2018 年Ducroux 等［20］的研究表明，所有急性缺血性腦卒中的血栓均含有NETs，且NETs 主要位于血栓的外層。2020 年Novotny 等［21］人的研究也證實(shí)了急性缺血性腦卒中的血栓中百分百含有NETs。2022 年Li 等［5］人的研究表明中性粒細(xì)胞和NETs 存在于缺血損傷后梗死灶同側(cè)的血管周圍，在缺血后1～3 天達(dá)到峰值?；谶@些發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于急性缺血性腦卒中的研究方向和研究熱點(diǎn)有所轉(zhuǎn)移，如NETs 如何影響血栓形成。

大量的研究證實(shí)NETs 通過以下途徑促進(jìn)血栓形成：①NETs 對內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并與血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）等共同促進(jìn)高凝狀態(tài)［22］；②NETs 為血小板、紅細(xì)胞和促凝劑分子提供骨骼支持，以促進(jìn)血栓形成［23］；③NETs 中包含的蛋白質(zhì)成分激活內(nèi)源性凝血途徑，如血小板可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞釋放NETs，在組蛋白等的作用下，誘導(dǎo)凝血因子FXII（Coagulation factor FXII，F(xiàn)XIIa）依賴性凝血，進(jìn)而促進(jìn)血液的高凝狀態(tài)［22，24］。組蛋白釋放到循環(huán)后，還可以在凝血因子FXIII（Coagulation factor FXIII，F(xiàn)XIIIa）等的作用下與纖維蛋白交聯(lián)，促進(jìn)凝血和增加凝塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致動脈、靜脈和微血管血栓形成［25］。

4 NETs 在急性缺血性腦卒中預(yù)后中的作用

2017 年Vallés 等人研究表明急性缺血性腦卒中患者的citH3 水平顯著升高與下列因素相關(guān)，如年齡較大、血糖水平升高、房顫史、心栓塞性卒中和卒中嚴(yán)重程度升高［5］。這表明血漿中citH3 水平可能作為腦卒中患者的預(yù)后衡量指標(biāo)，同時(shí)也可作為腦卒中患者的評估卒中嚴(yán)重程度的指標(biāo)。2019 年Lim 等［26］人通過測量急性缺血性腦卒中患者血漿中的雙鏈DNA（dsDNA）和DNA-組蛋白復(fù)合物的濃度來評估NETs 的含量，證實(shí)了急性缺血性腦卒中患者在初始階段時(shí)NETs 的水平升高。與此同時(shí)，Lim 等使用ROC 曲線分析dsDNA 濃度在急性缺血性腦卒中初始階段是否是有效的標(biāo)記物，計(jì)算得到AUC 值為0.859，即dsDNA 濃度在急性缺血性腦卒中初始階段是有效的標(biāo)記物。但此研究存在方法學(xué)上的局限性，結(jié)論的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步探索。

5 NETs 在急性缺血性腦卒中治療中的意義

2021 年Genchi 等［27］對80 例缺血性腦卒中患者經(jīng)血管內(nèi)機(jī)械取栓提取的人腦血栓進(jìn)行組織學(xué)分析，描述了NETs 的組成并采用免疫組化染色法測定了血栓NETs 含量及采用ELISA 法測定了血漿NETs 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)量化NETs 可以區(qū)分心源性栓塞性卒中和大動脈粥樣硬化性卒中。此前Laridan 等［19］人的研究中也發(fā)現(xiàn)心源性栓塞性卒中的NETs 含量為非心源性栓塞性卒中的兩倍。這為臨床正確的區(qū)分缺血性腦卒中的類型提供了有力的支撐，后續(xù)的治療也將更加具有針對性。但目前的結(jié)論大多建立在動物模型之上，進(jìn)一步的探索將具有重大的臨床意義。Dhawan 等［27］人通過外源性補(bǔ)充DNase1 糾正了DNase 反應(yīng)缺陷的情況也表明了NETs 作為新興的治療靶點(diǎn)可能性。

6 總結(jié)

從上述的研究和討論中可以明顯看出NETs與血栓形成的關(guān)系及其在急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中的作用。目前急性缺血性卒中溶栓治療的成功率較低，更加深入地了解急性缺血性腦卒中的血栓形成就至關(guān)重要。此外，關(guān)于急性缺血性腦卒中血栓的研究對于腦血栓的靶向治療的進(jìn)展也極其重要。

目前關(guān)于NETs 的研究報(bào)道較少，其在急性缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全闡明，但根據(jù)目前的研究成果，NETs 在急性缺血性腦卒中的作用有進(jìn)一步的臨床研究價(jià)值，需要深入的探索與研討。NETs 除了與急性缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)，還與其他血栓性疾病、自身免疫性疾病、膿毒血癥、腫瘤、牙周炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。綜上所述，更加深入細(xì)致地研究NETs 形成的確切機(jī)制，以及NETs在疾病發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，對于闡明疾病的發(fā)生機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的診療手段具有重要的臨床意義。