急性白血病患者血清GFI1B 表達及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

張志敏 張永梅 劉鑫艷 潘志蘭

急性白血?。ˋcute leukemi，AL）是造血干細胞的惡性克隆疾病，在發(fā)病過程中骨髓中異常細胞大量繁殖，使正常造血受到影響，且髓外臟器也受到浸潤［1］。近年來，隨著造血干細胞移植技術(shù)的發(fā)展及新藥的研發(fā)，治療AL 患者的效果有了較大提升，但5 年的存活率只達到約30%，且≥65 歲老年人群多因化療方案耐藥引起復(fù)發(fā)，導致死亡率較高，并且近年來死亡率仍未明顯下降［2］。為此，需尋找更多新的生物標志物，以識別高危患者并成為治療新靶點。獨立生長因子1B（growth factor-independent 1B，GFI1B）屬一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于人類基因組9q34.13，主要表達于胎兒、成人的紅細胞系及巨核細胞系，是兩系生成和分化過程中一種必需的轉(zhuǎn)錄因子，GFI1B 表達與急性白血病、T 細胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)［3］。然而，有關(guān)GFI1B 表達在AL 患者中的作用尚未明確。本研究旨在探討GFI1B 表達與AL 患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床應(yīng)用提供理論支持，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018 年1 月至2020 年12 月石家莊市人民醫(yī)院收治的86 例AL 患者為研究對象，男性48例，女性38 例，平均年齡（41.27±4.21）歲；另選取同期在本院進行體檢的健康者30 名為對照組，男性19 例，女性11 例，平均年齡（39.58±4.08）歲。兩組性別、年齡對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。納入標準：①AL 患者由臨床、血常規(guī)檢查、骨髓象確診［4］；②臨床資料完整者；③研究對象及家屬知情同意并自愿參加。排除標準：①其他血液系統(tǒng)疾病；②合并惡性腫瘤者；③妊娠期或哺乳期女性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 血清GFI1B 表達檢測

1.2.1.1 儀器及試劑 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 儀（Real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，PQ-PCR，公司：美國PE 公司；型號：ABI-5700）檢測并動態(tài)觀察GFI1B 表達；PQ-PCR 引物合成、熒光探針合成、PQ-PCR 用dNTP、5×PQ-PCR buffer 于廣東達安臨床檢驗中心購買，PCR 引物合成在北京賽百盛公司購買。

1.2.1.2 檢測方法 ①細胞分離及提取總RNA：抽取兩組新鮮外周血4 mL，107 U/L 肝素抗凝，加4 mL Ficoll 淋巴細胞分離液，2 000 rpm 轉(zhuǎn)速離心20 min（離心半徑10 cm）分離單個核細胞，用0.9%氯化鈉注射液清洗3 次。采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取細胞總RNA，1g/L 瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀顯示28S 和18S 兩條清晰條帶，顯示提取完整的RNA。②cDNA 合成：逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，包括細胞總RNA 1 μg，隨機引物500 ng，RNA 酶抑制劑25 U，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μL，MMLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶200 U。37℃、60 min，94℃、5 min，1℃、2 min 終止反應(yīng)。③GFI1B 正向引物：5′-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3′；GFI1B 反向引物：5-CCGGCTCTCGTTTGAGGTT-3′，GFI1B 探針序列：5′-FAM-CCGGTGCCCAGAGAC-CAGGCTAMRA-3′GFI1B 擴增片段長度為117 bp。④PQPCR 反應(yīng)：待測樣本和陽性標準品按以下反應(yīng)體系進行：反應(yīng)體系50 μL，包括5×定量PCR buffer 10 μL，上游引物F（10 pmol/μL）1 μL，下游引物R（10 pmol/μL）1 μL，探 針（5 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq 酶（3 U/μL）1 μL，cDNA 或陽性標準品1 μL，ddH2O34 μL。擴增條件：93℃、3 min，93℃、30 s，55℃、45 s，共40 個循環(huán)。 ⑤定量分析產(chǎn)物：反應(yīng)結(jié)束后，隨機選擇5 個陽性模板標準梯度點分析，若相關(guān)系數(shù)r2＞0.97，表明線性關(guān)系較好，可確定為定量標準曲線，根據(jù)標準曲線得出樣本熒光定量反應(yīng)的絕對定量值，即為目的基因的表達水平。將GFI1B 表達≥0.5×106拷貝/μL cDNA 定義為高表達［5］。

1.2.2 資料的收集

通過查閱病歷獲得患者的臨床資料，包括性別、年齡、疾病類型、危險度分型、白細胞、髓外浸潤、查爾森合并癥指數(shù)（Charlson Comorbidity Index，CCI）評分［6］。

對觀察組進行為期1 年的隨訪，隨訪形式包括電話隨訪、門診復(fù)診。以患者死亡為終點事件，本研究隨訪截止時間為2021 年12 月31 日，以了解AL 患者的預(yù)后情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究采用SPSS 21.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料用（±s）表示，組間行t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，AL 患者中GFI1B 表達與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，建立Cox 風險比例模型分析GFI1B 表達與AL 患者預(yù)后的關(guān)系；采用Kaplan-Meier 法設(shè)計生存曲線，并用Log-Rank 法比較組間的生存差異。當P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GFI1B 表達水平比較

觀察組患者的GFI1B 表達水平（0.78±0.11）高于對照組（0.06±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（t=34.707，P＜0.05）。

2.2 GFI1B 高表達與臨床病理特征的關(guān)系

AL 患者中GFI1B 高表達與危險度分型、白細胞有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 GFI1B 高表達與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 1 Relationship between GFI1B overexpression and clinicopathological features［n（%）］

2.3 影響AL 患者預(yù)后的單因素分析

本研究AL 患者的1 年總生存率為59.30%（51/86）。單因素分析顯示，髓外浸潤、CCI 評分、GFI1B 表達均是影響AL 患者預(yù)后的危險因素，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 影響AL 患者預(yù)后的單因素分析［n（%）］Table 2 Univariate analysis of influencing prognosis of AL patients［n（%）］

2.4 影響AL 患者預(yù)后的Cox 分析

以AL 患者預(yù)后為因變量進行Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，髓外浸潤、CCI 評分、GFI1B 表達均是AL 患者預(yù)后不良的獨立影響因素，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。GFI1B 高表達組（56.52%）1 年生存率低于GFI1B低表達組（88.24%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 GFI1B 表達與AL 患者1 年生存率的關(guān)系Figure 1 Relationship between GFI1B expression and 1 year survival rate of AL patients

表3 影響AL 患者預(yù)后的Cox 分析Table 3 Cox analysis of influencing prognosis of AL patients

3 討論

AL 是造血干細胞的惡性克隆性疾病，主要表現(xiàn)為白血病細胞增殖、分化和凋亡異常，而正常的造血功能受到影響。目前，臨床上治療AL 患者主要是最大限度消滅白血病細胞群體，抑制白血病細胞的異常增殖，同時對因白血病細胞浸潤而引起的各種臨床表現(xiàn)可有效緩解。盡管醫(yī)學技術(shù)在不斷地發(fā)展，但AL 患者仍存在較高的病死率。因此，急需尋找更多新的生物標志物來作為患者預(yù)后標志物及治療新靶點。GFI1B 是在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的與GFI1 結(jié)構(gòu)十分相似的一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，同時也是紅系、巨系生成和分化過程中的一種必需轉(zhuǎn)錄因子［7］。GFI1B 表達與AL、T 細胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但其表達對AL 患者的臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系仍需進一步探討。

本研究采用qRT-PCR 技術(shù)檢測AL 患者和健康體檢者的GFI1B 表達情況，結(jié)果顯示，觀察組患者的GFI1B 表達水平高于對照組，提示GFI1B 異常高表達與AL 的發(fā)生密切相關(guān)，與既往研究相符［8］。AL 是造血干細胞的異常增殖所致，且是一個多步驟多基因參與的過程，故治療該疾病的首要步驟是控制細胞生長的基因表達異常或其編碼蛋白功能異常［9］。調(diào)控細胞轉(zhuǎn)化常以轉(zhuǎn)錄因子形式進行轉(zhuǎn)化，最后使細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控非正常，而GFI1B 屬該類因子的一種［10］。GFI1B 一旦發(fā)生過度表達，可通過激活一系列細胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達從而抑制細胞的凋亡及促進細胞的增殖的作用，進而使腫瘤惡性發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)GFI1B 高表達與危險度分型、白細胞有關(guān)。GFI1B 是一種鋅指蛋白，具有轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，對于產(chǎn)生確定的紅細胞和巨核細胞譜系至關(guān)重要［11］。可能由于GFI1B 對造血分化的表觀遺傳調(diào)控取決于輔因子CoREST 和LSD1，在GFI1B 的SNAG 結(jié)構(gòu)域之間的相互作用介導的過程中，這些輔因子被募集到GFI1B 靶基因的啟動子區(qū)域，抑制這一過程會干擾紅細胞和巨核細胞的分化［12］。Cox 回歸分析顯示，髓外浸潤、CCI 評分、GFI1B 表達均為AL 患者預(yù)后不良的獨立影響因素。結(jié)果提示AL 患者的GFI1B 表達異常，可能會促進疾病的惡性進展，嚴重影響患者預(yù)后，也表明動態(tài)監(jiān)測GFI1B 對AL患者預(yù)后有著重要的指導意義。有研究顯示［13］，缺乏GFI1B 的小鼠不能生成成熟的紅細胞，而在這些小鼠的肝臟中紅系和巨核系生成的前體物質(zhì)增多，這表明GFI1B 在紅系和巨核系的生成和分化中起了重要的作用。當患者出現(xiàn)髓外浸潤時，腫瘤負荷較高，導致腫瘤細胞清除較慢，雖在治療后可得到緩解，但復(fù)發(fā)風險會增加，且影響預(yù)后［14］。CCI 評分≥2 分是AL 患者預(yù)后不良獨立影響因素，可能是由于患者常合并心、肝、肺等重要器官功能障礙，嚴重性的合并癥會降低機體對藥物清除力以及影響機體抵抗力［15］。另有研究表示，GFI1B 表達不僅能夠誘導細胞周期依賴激酶抑制物p2l Wafl/Cip 的產(chǎn)生及表達，導致細胞滯留在G0 期，且還可與GFl1 基因相互作用使細胞癌變，因此GFI1B 高表達會增加AL 患者病死率風險［16］。

綜上所述，GFI1B 在AL 患者中呈高表達態(tài)，其表達異常升高會增加預(yù)后的死亡風險，GFI1B參與調(diào)節(jié)AL 的發(fā)生及發(fā)展，可作為AL 患者潛在的預(yù)后標志物和治療新靶點。此外，臨床可加強對AL 患者GFI1B 的動態(tài)監(jiān)測，以提高患者的生存率。本研究還存在不足之處，樣本量較少，未來需開展大病例數(shù)進一步研究。