丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的作用及其鐵死亡通路機(jī)制的研究

陶磊 王迪 疏樹華★

丙泊酚（Propofol，2，6-diisopropylphenol）是烷基酸類短效靜脈麻醉藥物，多用于全身性麻醉誘導(dǎo)及維持，具有誘導(dǎo)時(shí)間短和蘇醒快的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于腫瘤根治術(shù)的全身麻醉［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以抑制部分腫瘤的生長［2-4］，但是機(jī)制還不是很清楚，現(xiàn)已成為臨床上研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)方向之一。鐵死亡（Ferroptosis）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，它由鐵依賴性脂過氧化驅(qū)動，主要特征包括：鐵失調(diào)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積、谷胱甘肽水平降低和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活等，參與多種病理生理過程和疾病的發(fā)生發(fā)展，包括肝癌［5-6］。肝癌是常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、惡性度高、進(jìn)展快、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)，目前尚無治療特效藥。本文揭示丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移與鐵死亡的活性密切相關(guān)，為未來有效地應(yīng)用丙泊酚進(jìn)行抗肝癌治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株購自武漢普諾賽生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基高糖DMEM、青霉素-鏈霉素、胰酶等購買自合肥Biosharp 公司；胎牛血清購買自依科賽公司；丙泊酚購買自美國Sigma-Aldrich 公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購買自上海生工；β-TUBULIN、SLC3A2、GPX4、SLC7A11 等抗體購自武漢ProteinTech 或成都正能等公司；Ferrostatin-1 和RSL3 購買自美國Selleck 公司；CCK8 試劑購自美國APExBIO 公司；Transwell 小室購買自美國康寧公司；ROS 檢測試劑盒購買自碧云天；生物安全柜和細(xì)胞培養(yǎng)箱等購自美國Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購買自德國徠卡公司；酶標(biāo)儀購買自美國Molecular Devices 公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)基成份為DMEM，里面添加10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素溶液，細(xì)胞在37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，按照1∶3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理細(xì)胞

丙泊酚、Ferrostatin-1 和RSL3 溶解在dimethyl sulfoxide（DMSO）中，根據(jù)需要配成不同濃度的母液。對照細(xì)胞用DMSO 處理，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則用10 μg/mL 丙泊酚處理48 h；對于鐵死亡干預(yù)實(shí)驗(yàn)，則在丙泊酚處理細(xì)胞時(shí)分別添加終濃度為10 μM 的Ferrostatin-1 和3 μM 的RSL3。

1.2.3 CCK8 實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞以相同的密度（約3×104）接種于96 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度細(xì)胞到達(dá)60%～70%時(shí)，進(jìn)行藥物干預(yù)處理。48 h 后，每孔中加入10 μL 的CCK8 試劑繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測450 nm 處光密度（optical density，OD）值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三個(gè)孔。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)

用無血清培養(yǎng)基重懸對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至8×105個(gè)/mL，吸取100 μL 的細(xì)胞懸液置于24 孔板上室，下室加入500 μL 含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h 或48 h，取出Transwell 嵌套的小室，用4% 多聚甲醛固定，再經(jīng)0.1%結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽輕輕拭去上室細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)選取3～5 個(gè)視野，觀察并拍照。

1.2.5 Western blot 檢測

收集對照組和丙泊酚處理組細(xì)胞，用PBS 洗滌后加入RIPA 溶液裂解細(xì)胞，BCA 法定量蛋白濃度。用10%的SDS-PAGE 膠分離蛋白質(zhì)，每孔添加80 μg蛋白，經(jīng)PVDF 轉(zhuǎn)膜90 分鐘、5%BSA 室溫封閉2 h、一抗4℃孵育、二抗室溫孵育1 h 等步驟，使用合肥Biosharp 公司的ECL 發(fā)光液顯色，在發(fā)光儀下拍照蛋白條帶，并用Image J分析條帶的相對灰度密度。

1.2.6 ROS 檢測

步驟按說明書執(zhí)行，首先按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μM；接著，去除對照組和丙泊酚處理組細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入能夠覆蓋細(xì)胞的DCFH-DA 溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA；最后，用熒光顯微鏡觀察拍照。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析。P＜0.05 時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙泊酚對肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

分別將兩株不同的肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh7分成4 組，添加不同濃度的丙泊酚處理48 小時(shí)。CCK8 檢測結(jié)果顯示：終濃度為10 μg/mL 和20 μg/mL 的丙泊酚均可以顯著地抑制HepG2 和Huh7細(xì)胞的增殖，且抑制效果相仿，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.06，P＜0.01；F=10.18，P＜0.01）（圖1A 和B）。同時(shí)，Transwell 結(jié)果實(shí)驗(yàn)顯示：終濃度為10 μg/mL的丙泊酚可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移（圖1C）。

圖1 丙泊酚對肝癌細(xì)胞生長和遷移的影響Figure 1 The effect of propofol on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells

2.2 抑制鐵死亡對丙泊酚調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

圖2A 顯示，相比較于丙泊酚組，添加Fer-1 可以恢復(fù)丙泊酚對HepG2 和Huh7 細(xì)胞生長的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.48，P＜0.01；F=23.13，P＜0.01）（圖2A 和B）；同時(shí)也能夠削弱丙泊酚對HepG2 和Huh7 細(xì)胞遷移的調(diào)控（圖2C）。

圖2 Fer-1 對丙泊酚抗肝癌作用的影響Figure 2 The effect of Fer-1 on the anti-hepatocellular carcinoma effect of propofol

2.3 鐵死亡激活劑協(xié)同丙泊酚對肝癌細(xì)胞生長和遷移的影響

如圖3A 所示，和對照組細(xì)胞相比，丙泊酚和RSL3 單獨(dú)作用均可以抑制HepG2 和Huh7 細(xì)胞的增殖，但是兩者聯(lián)合作用可進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞的生長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.79，P＜0.01；F=24.60，P＜0.01）（圖3A 和B）。同時(shí)，相比較于對照組和單獨(dú)處理組，RSL3 和丙泊酚同時(shí)處理可以顯著地抑制HepG2 和Huh7 細(xì)胞的遷移（圖3C）。

圖3 RSL3 對丙泊酚抗肝癌功能的影響Figure 3 The effect of RSL3 on the anti-hepatocellular carcinoma effect of propofol

2.4 丙泊酚在肝癌細(xì)胞中對鐵死亡的調(diào)控

相比較于對照組，丙泊酚提高了細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平（圖4A）；Western blot 檢測表明丙泊酚沒有改變SLC7A11 和SLC3A2 的表達(dá)，但是減少了GPX4 的蛋白水平（圖4B 和C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.48，53.62，P＜0.01）。

圖4 丙泊酚對鐵死亡的影響Figure 4 The effect of Propofol on ferroptosis

3 討論

圍手術(shù)期麻醉處理對腫瘤患者預(yù)后具有重要的意義，丙泊酚作為一種烷基酚類的短效靜脈麻醉藥，除了廣泛用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持及重癥監(jiān)護(hù)病房的靜脈鎮(zhèn)靜外，丙泊酚還可影響不同類型腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，且作用機(jī)制也具有組織差異性［1］。

丙泊酚在肝癌細(xì)胞中的作用雖然已有一些報(bào)道，但是分子機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種不同的信號通路和表觀遺傳的調(diào)控，如TGF-β1/Smad2 信號通路、ERK 信號通路、JAK2/STAT3 信通路和非編碼RNA 等。Li［3］等發(fā)現(xiàn)丙泊酚可能通過抑制PCNA和CD34 等蛋白水平、提高TGF-β1 的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721荷瘤的BALB/c 小鼠中也觀察到丙泊酚通過劑量依賴性的方式減少肝癌細(xì)胞中PCNA，CD34和pAKT 的表達(dá)，抑制肝癌生長［7］。Fei et al 等［8］團(tuán)隊(duì)證明了NET1 會調(diào)控丙泊酚對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 增殖和遷移的抑制，丙泊酚通過下調(diào)NET1 的 表 達(dá) 來 抑 制pERK 和VEGF 的 水 平。Li［9］研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞株Huh7 和Bel-7405 中，丙泊酚可以提高miR-105 的水平，后者會靶向抑制JAK2 表達(dá)，導(dǎo)致JAK2/STAT3 信號活性降低，肝癌細(xì)胞的增殖受到抑制。除了miR-105，miR-195-5P的表達(dá)也受丙泊酚的調(diào)節(jié)［10］。丙泊酚可以提高順鉑對肝癌細(xì)胞的殺傷強(qiáng)度，主要的下游機(jī)制是通過誘導(dǎo)miR-195-5P 的表達(dá)，靶向降解CCNE1 信使RNA，所以添加miR-195-5P 的抑制劑會削弱順鉑致死功能。此外，Chang et al［11］發(fā)現(xiàn)丙泊酚處理會顯著減少肝癌細(xì)胞株SNU-449 和HuH-6中l(wèi)ncRNA CASC9 的水平，過表達(dá)后者可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究證明CASC9 通過與EZ2H2 相互作用負(fù)調(diào)控PTEN 的轉(zhuǎn)錄，而PTEN 是AKT/mTOR 信號通路的抑制成份［11］。本論文發(fā)現(xiàn)丙泊酚在肝癌細(xì)胞中可以通過調(diào)控GPX4的表達(dá)激活鐵死亡來發(fā)揮功能（圖4B 和C）。鐵 死 亡抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的研究較多［6］，如Let［12］發(fā)現(xiàn)PCDHB14 會促進(jìn)RNF182 調(diào)控的P65 泛素化，而P65 可以結(jié)合SLC7A11 啟動子從而激活其表達(dá)，所以PCDHB14 通過降低SLC7A11 從而激活鐵死亡來發(fā)揮抗肝癌的功能［12］。事實(shí)上，丙泊酚在其他類型的腫瘤中通過激活鐵死亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移已有報(bào)道，如乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等［4，13-14］。但是丙泊酚激活鐵死亡信號的詳細(xì)下游機(jī)制還需要深入地研究。

綜上所述，本論文揭示了丙泊酚抑制肝癌的新機(jī)制，豐富了丙泊酚抗癌機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是手術(shù)時(shí)需要的丙泊酚的血藥濃度在2.5～8.0 μg/mL，復(fù)合其他靜脈麻醉藥時(shí)所需血藥濃度會更低，而丙泊酚發(fā)揮抗癌作用的濃度則更高，作用時(shí)間也較長。此外，臨床上供選擇的非巴比妥類靜脈麻醉藥物也較多［15］，如依托咪酯、氯胺酮、羥丁酸鈉，它們在肝癌細(xì)胞中是否具有和丙泊酚相類的作用？聯(lián)合使用是否可以調(diào)控丙泊酚的功能？也值得未來進(jìn)一步研究，結(jié)果將為在臨床上優(yōu)化肝癌的治療方案提供新的參考和線索。