不同低氧訓(xùn)練模式通過激活小鼠脂肪組織脂噬作用調(diào)節(jié)脂代謝

李夢(mèng)影 李靈杰 馬春偉 邊靜 高炳宏

1 上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院（上海 200438）

2 上海體育學(xué)院競(jìng)技訓(xùn)練學(xué)院（上海 200438）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與生活節(jié)奏的不斷加快，人們不規(guī)律的飲食作息和過度的生活壓力等各種原因?qū)е聶C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)蓄積。前人的研究表明，體內(nèi)脂質(zhì)堆積通常會(huì)提高多種代謝性疾病的發(fā)病率，嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人的生命與健康[1]。2009 年，Singh 等在肝臟中發(fā)現(xiàn)并闡述了自噬對(duì)脂滴的選擇性降解作用，并引出“脂噬”這一全新的概念[2]。脂噬（Lipophagy）是將細(xì)胞內(nèi)脂滴和膽固醇當(dāng)作內(nèi)容物通過自噬體傳送到溶酶體，融合后在酸性脂肪酶和水解酶作用下將脂滴分解為甘油和游離脂肪酸的一種細(xì)胞內(nèi)脂肪降解途徑[3，4]。Kaushik和Cuervo的后續(xù)報(bào)道也進(jìn)一步支持Singh等的研究，揭示了分子伴侶誘導(dǎo)的自噬和巨自噬在清除肝臟脂滴方面的潛力[5]。脂噬最初在肝臟中被發(fā)現(xiàn)，之后在其他類型細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞[6]、巨噬細(xì)胞[7]和腫瘤細(xì)胞[8]中都發(fā)現(xiàn)脂噬能夠參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)代謝[5]。饑餓[9]、運(yùn)動(dòng)[10]、寒冷環(huán)境[11]等外界刺激可以激活脂噬作用，細(xì)胞內(nèi)脂滴與自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related gene or protein，Atg）結(jié)合激活自噬體的形成，之后自噬體與溶酶體融合降解脂質(zhì)。當(dāng)然這也存在著一種反向關(guān)系，即細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)存的異常也會(huì)影響脂噬。脂質(zhì)可以通過影響信號(hào)傳導(dǎo)、自噬體膜形成、擴(kuò)張等環(huán)節(jié)，從而調(diào)控脂噬過程[12]。

低氧訓(xùn)練作為一種新的治療策略，能通過促進(jìn)脂質(zhì)代謝來減控體脂[13]。研究表明長(zhǎng)期居住在高海拔地區(qū)的人比生活在低海拔地區(qū)的人的體脂更低，肥胖相關(guān)疾病也更少。低住高練（living-low/training-high，Lo-Hi）是指生活在常氧環(huán)境中，在低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)的一種訓(xùn)練方式。與其他低氧訓(xùn)練方式相比，低住高練僅需要建造一個(gè)訓(xùn)練的低氧環(huán)境，而不需要低氧居住環(huán)境。這不僅能達(dá)到減控體重的目的還能保證受試者訓(xùn)練后疲勞得到正常的恢復(fù)[14]。高住低練（living-high/training-low，HiLo）是指居住在低氧環(huán)境下，在常氧環(huán)境進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的一種訓(xùn)練方式。此模式解決了運(yùn)動(dòng)負(fù)荷和缺氧負(fù)荷同時(shí)存在的矛盾，但是對(duì)機(jī)體機(jī)能狀態(tài)的改善效果沒有低住高練模式顯著[15]。Lu 的研究表明4周的低氧訓(xùn)練能夠降低肥胖大鼠的體重、脂肪質(zhì)量和血脂水平[16]。運(yùn)動(dòng)和低氧能激活組織細(xì)胞中的脂噬作用，也能有效降低體脂。脂噬的激活能刺激脂滴（lipid droplets，LDs）降解并減少脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累[17]。低氧訓(xùn)練減少體脂是否與激活脂肪組織脂噬有關(guān)尚未見相關(guān)研究證實(shí)。因此，本研究主要探究不同低氧訓(xùn)練模式能否通過激活小鼠腹股溝皮下脂肪組織脂噬作用調(diào)節(jié)小鼠脂代謝，并結(jié)合前人研究探討低氧訓(xùn)練激活脂噬過程中可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)方案

從上海南方模式生物科技股份有限公司購入40只2月齡C57BL/6健康雄性小鼠，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由飲食。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22℃± 2℃，相對(duì)濕度50%～70%，12︰12 小時(shí)的光暗循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海體育學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017036）。

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control，C組），運(yùn)動(dòng)組（exercise，E組），低氧組（hypoxia，H組），低住高練組（LoHi組）和高住低練（HiLo 組）五組，每組8 只。C 組在常氧下生活，不運(yùn)動(dòng)。E組、LoHi組和HiLo組小鼠在第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，速度從12 m/min 提高到25 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間從15 min/d 增加到了60 min/d。從第2 周開始對(duì)E組、H組、LoHi組和HiLo組小鼠進(jìn)行6周的訓(xùn)練干預(yù)，運(yùn)動(dòng)方案為：25 m/min，1 h/d，5 d/w；E 組在常氧環(huán)境下進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；H 組每天8 點(diǎn)～18 點(diǎn)在13.6%（相當(dāng)于3600 m）低氧濃度下進(jìn)行低氧暴露；Lo-Hi組在常氧（21%）氧濃度下生活，在13.6%低氧濃度下進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；HiLo 組每天8 點(diǎn)～16 點(diǎn)在氧氣濃度為13.6%的低氧帳篷下進(jìn)行低氧暴露，每次低氧暴露結(jié)束后進(jìn)行常氧環(huán)境下的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。低氧組和低氧訓(xùn)練組的低氧干預(yù)在低氧帳篷中進(jìn)行，采用Everest SummitⅡ低氧發(fā)生器（可模擬海拔0～8000 m 高度常壓低氧環(huán)境，美國Hypoxico Inc.公司）。從第1周開始，每周六稱量小鼠體重，共7周，體重增長(zhǎng)量=第7周體重－第1周體重（g）。

1.2 體成分測(cè)試

小鼠的體成分采用動(dòng)物體成分分析儀（Echo MRI，匯佳生物股份有限公司，中國）測(cè)量。首先在體成分測(cè)試前稱量小鼠體重，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)后在軟件上輸入小鼠編號(hào)和體重等信息，之后將小鼠放入適合的Holder內(nèi)，插入機(jī)器上部對(duì)應(yīng)空間，最后測(cè)完體成分獲得小鼠全身脂肪含量等數(shù)據(jù)，進(jìn)而得到體脂比，體脂比=脂肪含量/體重×100%。

1.3 動(dòng)物取材

小鼠末次訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行取材，取材前禁食12 h。經(jīng)腹膜下注射水合氯醛麻醉，麻醉后小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，血液室溫靜置30 min 后，3000 rpm、22℃離心20 min 后收集血清。血清分裝在－80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈蟾构蓽现?，并使用分析電子天平測(cè)量其質(zhì)量，整個(gè)過程在冰上操作。稱量后取部分置于脂肪固定液（塞維爾，中國）中固定，用于制備切片；剩余組織迅速置于液氮，整理分類后置于－80℃超低溫冰箱備用。

1.4 血清甘油三酯檢測(cè)

血清甘油三酯（triglyceride，TG）嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)（南京建成生物工程研究所，中國），在酶標(biāo)板中分別加入2.5 μl 的蒸餾水、校準(zhǔn)品和血清以及250 μl 的工作液，之后在震蕩孔板混勻，37℃孵育10 min 波長(zhǎng)510 nm，最后用酶標(biāo)儀（DG5033A，南京華東電子廠，中國）測(cè)定各孔吸光度值并按照說明書中的公式計(jì)算。

1.5 組織學(xué)分析

從C、E、H、LoHi 和HiLo 組中各選擇5 只小鼠的脂肪組織進(jìn)行固定至少12 h 后，從脂肪固定液中取出長(zhǎng)、寬、高大致為4 mm的脂肪組織塊，修剪組織后置流水中2 h，用酒精脫水后浸蠟包埋，包好的石蠟塊修理好切片，使用Leica切片機(jī)切片（RM2135，Leica公司，德國），厚度為5 μm，烘干組織后用蘇木精和伊紅染色，奧林巴斯顯微鏡拍片，每張片子取3 個(gè)視野，保存照片。使用Image J 軟件測(cè)算每張照片中的細(xì)胞平均面積。

1.6 免疫熒光共定位

石蠟包埋及切片的步驟與上述一致，將石蠟切片在烘片機(jī)上58℃烘烤1 h 30 min，之后用二甲苯和酒精梯度脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，驢血清封閉1小時(shí)后，使用LC3（ 1︰200，CST 公司，美國）、LAMP-2（1︰200，proteintech 公司，美國）4℃孵育過夜，次日使用熒光染液（abcam，英國）在室溫下孵育90 min，然后用DAPI（上海碧云天生物技術(shù)公司，中國）對(duì)細(xì)胞核染色10 min 后加入2 μl 抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術(shù)公司，中國）封片。最后用蔡司LSM700 激光共聚焦顯微鏡觀察載玻片，選取合適視野拍照并保存LC3與LAMP-2共定位相關(guān)的數(shù)據(jù)。

1.7 免疫印跡

采用Western blot 方法檢測(cè)腹股溝皮下脂肪組織的微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 的比值（Microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ/Ⅰ，LC3Ⅱ/Ⅰ）、溶酶體相關(guān)2 型蛋白（Lysosome-associated membrane protein type Ⅱ，LAMP-2）、選擇性自噬接頭蛋白（Sequestosome1，p62）、BECN1 基因編碼蛋白（BCL 2 interacting protein，Beclin1）等自噬關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)。取適量的脂肪組織剪碎，加入300 μl 含有甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液中（PMSF：RIPA=1︰100，上海碧云天生物技術(shù)公司，中國），使用高通量組織研磨機(jī)（SCIENZ48，寧波新芝生物科技有限公司，中國）裂解組織，在4℃、12000 r/min離心20 min 后取上清，避免吸到脂質(zhì)，重復(fù)兩次。用增長(zhǎng)型二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司，中國）測(cè)定蛋白濃度。樣本通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜 上（Millipore，德國），用5%的脫脂奶粉溶液封閉2小時(shí)后加入LC3（1︰1000，CST 公司，美國）、LAMP-2（1︰1000，proteintech公司，美國）、Beclin1（1︰1000，CST公司，美國）、p62（1︰1000，CST 公司，美國）、內(nèi)參GAPDH（1︰1000，上海碧云天生物技術(shù)公司，中國）的抗體4℃孵育過夜，用1×TBST 沖洗3 次，每次8 min，再加入相應(yīng)的二抗（1︰1000，HRP標(biāo)記，proteintech 公司，中國），常溫孵育1小時(shí)后使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon5200Muti，上海天能科技有限公司，中國）顯影，保存圖片。使用Image J軟件進(jìn)行蛋白定量，自噬相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)采用GAPDH進(jìn)行歸一化處理。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)小鼠體重、體脂和血清甘油三酯的影響

如圖1所示，6周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組、低氧組、低住高練組、高住低練組四組體重增長(zhǎng)量都有相應(yīng)的減少，低住高練組體重增長(zhǎng)減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與運(yùn)動(dòng)組和低氧組相比，低住高練組和高住低練組的體重增長(zhǎng)量也有相應(yīng)減少，但沒有顯著變化（P＞0.05）。

圖1 6周低氧訓(xùn)練干預(yù)后各組小鼠體重增長(zhǎng)量、體脂百分比和血清甘油三酯水平比較

小鼠體脂比變化與體重變化有細(xì)微差異，與對(duì)照組、低氧組和運(yùn)動(dòng)組相比，低住高練組與高住低練組的體脂比都有減少的趨勢(shì)，但是沒有顯著性差異（P＞0.05），且不同低氧訓(xùn)練模式之間也未見顯著差異（P＞0.05）。

低氧組、運(yùn)動(dòng)組、低住高練組和高住低練組四組的血清甘油三酯（TG）水平較對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），且低住高練組和高住低練組與運(yùn)動(dòng)組和低氧組相比以及不同低氧訓(xùn)練模式之間未見明顯變化（P＞0.05）。

2.2 不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)皮下脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，6周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，與對(duì)照組相比，經(jīng)過運(yùn)動(dòng)、低氧以及低氧訓(xùn)練干預(yù)后的小鼠皮下脂肪細(xì)胞直徑明顯減少，同一視野下脂肪細(xì)胞的數(shù)量明顯增多；此外，統(tǒng)計(jì)分析同一視野下皮下脂肪細(xì)胞的平均面積，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)、低氧和低氧訓(xùn)練干預(yù)后的小鼠皮下脂肪細(xì)胞的平均面積顯著減?。≒＜0.01）；運(yùn)動(dòng)組、低氧組、高住低練組和低住高練組四組之間脂肪細(xì)胞平均面積沒有明顯差異，但低住高練組和高住低練組細(xì)胞的平均面積較運(yùn)動(dòng)組和低氧組更?。徊煌脱跤?xùn)練組平均面積相差較小。

圖2 6周低氧訓(xùn)練干預(yù)后各組小鼠腹股溝皮下脂肪細(xì)胞大小比較（400×）

2.3 不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)皮下脂肪組織LC3與LAMP-2共定位的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，6周的干預(yù)之后，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組、低氧組、低住高練組、高住低練組四組皮下脂肪細(xì)胞中的橙黃色斑點(diǎn)增多的現(xiàn)象，且6 周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)、低氧、低住高練、高住低練組四組的共定位系數(shù)都顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）；同樣的，從圖3B中可以觀察到皮下脂肪細(xì)胞的直徑明顯縮減。此外，運(yùn)動(dòng)組的共定位系數(shù)顯著高于低氧組（P＜0.01）；低住高練組的共定位系數(shù)也顯著高于低氧組和運(yùn)動(dòng)組（P＜0.01）；低住高練組和高住低練組沒有明顯差異（P＞0.05）。

圖3 6周低氧訓(xùn)練干預(yù)后各組小鼠腹股溝皮下脂肪組織免疫熒光共定位圖（400×）

2.4 不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)皮下脂肪組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)、低氧、低住高練、高住低練組LC3Ⅱ/Ⅰ、LAMP-2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。此外，低住高練組LC3Ⅱ/Ⅰ的比值顯著大于低氧組（P＜0.01），低住高練組LAMP-2的蛋白表達(dá)顯著高于運(yùn)動(dòng)組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，低住高練、高住低練組的Beclin1 蛋白表達(dá)水平顯著提高（P＜0.01）；低住高練組、高住低練組、運(yùn)動(dòng)組和低氧組四組之間也未見顯著差異。與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組、低住高練組和高住低練組p62 的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；同時(shí)，低住高練組的p62蛋白表達(dá)顯著低于低氧組（P＜0.05）；但不同低氧訓(xùn)練組之間未見顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 6周低氧訓(xùn)練干預(yù)后各組小鼠腹股溝皮下脂肪組織脂噬蛋白表達(dá)比較

3 討論

脂肪組織作為“脂肪的儲(chǔ)存庫”積蓄體內(nèi)脂質(zhì)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，除了傳統(tǒng)的脂肪酶的脂解作用，細(xì)胞內(nèi)的脂噬作用同樣能降解細(xì)胞內(nèi)的脂滴[18]。機(jī)體在正常的生理狀態(tài)下存在基礎(chǔ)自噬，不同類型的脂肪細(xì)胞的自噬水平不同[19，20]。低氧和運(yùn)動(dòng)已經(jīng)被證明可以激活細(xì)胞內(nèi)的脂噬作用，也可以通過增加脂質(zhì)代謝，減少機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)儲(chǔ)存[21-24]。但低氧訓(xùn)練減控體脂是否與脂噬作用的激活有關(guān)尚未可知。

低氧訓(xùn)練可能通過降解脂滴促進(jìn)小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝。本研究表明在經(jīng)過6 周的低氧訓(xùn)練干預(yù)后，與低氧組相比，運(yùn)動(dòng)組、低住高練組、高住低練組有體重增長(zhǎng)減少，體脂百分比減小的趨勢(shì)，但無明顯變化。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用的小鼠體內(nèi)皮下脂肪組織沒有過度積累，所以脂肪代謝之后脂肪減少量較少，差異性難以體現(xiàn)。對(duì)脂肪細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞中央被脂滴占據(jù)而呈現(xiàn)空泡狀，細(xì)胞質(zhì)貼于四周細(xì)胞壁，細(xì)胞核扁長(zhǎng)位于細(xì)胞邊緣。在同樣視野下，運(yùn)動(dòng)組、低氧組、低住高練組和高住低練組的脂肪細(xì)胞直徑減小，數(shù)量增多，低住高練組與高住低練組的平均脂肪細(xì)胞面積較運(yùn)動(dòng)組和低氧組更小，但這兩組的平均脂肪面積差別很小。這也與免疫熒光共定位的結(jié)果中脂肪細(xì)胞的形態(tài)大小變化一致。這提示我們低氧訓(xùn)練確實(shí)能減少皮下脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)儲(chǔ)存，低住高練和高住低練的干預(yù)效果相似。為了進(jìn)一步確認(rèn)低氧和運(yùn)動(dòng)對(duì)脂肪儲(chǔ)存的影響促進(jìn)了脂質(zhì)代謝，我們測(cè)試了血清中TG水平，如圖1所示，運(yùn)動(dòng)、低氧和低氧訓(xùn)練都能降低血清中的TG水平。上述的形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)等結(jié)果表明不同低氧訓(xùn)練干預(yù)方式促進(jìn)了小鼠皮下脂肪組織中脂質(zhì)的分解代謝，減少了細(xì)胞中的脂質(zhì)儲(chǔ)存，且低住高練和高住低練的干預(yù)效果一致。Gunadi等研究不同訓(xùn)練強(qiáng)度對(duì)Wistar大鼠肝臟中與自噬相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度訓(xùn)練大鼠血清甘油三酯水平降低更為明顯，同時(shí)高強(qiáng)度訓(xùn)練組的LC3 和p62 mRNA表達(dá)下降，Beclin1、Atg5、LC3的蛋白表達(dá)顯著增加，這可能意味著中、高強(qiáng)度訓(xùn)練更有助于激活肝臟內(nèi)的脂噬作用，減少肝臟內(nèi)的脂質(zhì)沉積[25]。Song 等的研究發(fā)現(xiàn)適度低氧能夠降低前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）中的甘油三酯水平和脂滴大小[26]。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信號(hào)通路與低氧誘導(dǎo)的自噬密切相關(guān)，低氧預(yù)適應(yīng)能夠通過激活HIF-1α/Beclin1信號(hào)通路激活神經(jīng)細(xì)胞的自噬，從而保護(hù)神經(jīng)，避免缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[27]。因此，低氧訓(xùn)練刺激降解脂質(zhì)，減少脂質(zhì)儲(chǔ)存可能與低氧訓(xùn)練激活了腹股溝皮下脂肪組織的脂噬作用有關(guān)。

脂噬過程的調(diào)節(jié)涉及許多復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)，為了確認(rèn)在不同低氧訓(xùn)練模式干預(yù)后的小鼠皮下脂肪中發(fā)生了脂噬作用，本研究測(cè)試了LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LAMP-2、p62 等自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)。在脂噬的起始階段，腺苷5`-單磷酸（AMP）活化的蛋白激酶（adenosine5`-monophosphate activated protein kinase，AMPK）能夠直接調(diào)控UNC-51 激酶1（UNC-51 like kinase，ULK1），也可通過抑制雷帕霉素靶蛋白1（mechanistic target of rapamycin，mTOR1）間接激活ULK1，從而導(dǎo)致Atg13、Beclin1 和Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（vacuolar protein sorting 34，VPS34）底物的磷酸化，促進(jìn)Beclin1-Vps34-Vps15 復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)脂噬的激活[28]。本研究中不同的低氧訓(xùn)練模式都顯著提高了Beclin1的蛋白表達(dá)，低氧和運(yùn)動(dòng)也有提高Beclin1蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，表明低住高練和高住低練干預(yù)都激活了脂肪組織的脂噬。Liu等[29]的研究表明定期有氧運(yùn)動(dòng)顯著增加AMPKα1 的表達(dá)以及磷酸化活性水平，上調(diào)海馬中Beclin1 和LC3 的表達(dá)來誘導(dǎo)自噬。這同樣證明Beclin1是運(yùn)動(dòng)調(diào)控細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子。脂噬被激活后，自噬體膜借助LC3 與脂滴結(jié)合后繼續(xù)擴(kuò)展延伸形成封閉的自噬小體。因此，LC3 是自噬體的標(biāo)志分子，LC3 的表達(dá)強(qiáng)度及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值與自噬呈正相關(guān)[30]。如圖4所示，6周的低氧訓(xùn)練干預(yù)后，與對(duì)照組相比，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LAMP-2 等蛋白表達(dá)顯著提高。自噬被激活后，細(xì)胞內(nèi)LC3 蛋白的表達(dá)水平及其LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的數(shù)量會(huì)顯著提高[31]。自噬水平升高，LC3Ⅱ/Ⅰ也隨之升高，這也與本研究結(jié)果一致。前人的研究中對(duì)大鼠進(jìn)行9周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練激活了自噬作用，與對(duì)照組相比，附睪白色脂肪組織的LC3Ⅱ和p62以及腹股溝脂肪組織的LC3-Ⅱ和Atg7的表達(dá)水平也是顯著升高[32]。當(dāng)然這種LC3 的增加可能不是因?yàn)樽允苫钚缘脑黾?，而是由于?xì)胞內(nèi)自噬體的大量堆積，無法快速降解造成的，所以這就需要結(jié)合p62 蛋白的表達(dá)水平來評(píng)價(jià)自噬才更加準(zhǔn)確。p62 是細(xì)胞自噬的經(jīng)典底物，其蛋白表達(dá)的增多表明自噬對(duì)細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白或者其他底物的降解能力下降或者是失能[33]。p62將脂滴鏈接到自噬體后，隨溶酶體的降解而減少[34]。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)和低氧訓(xùn)練都能降低小鼠皮下脂肪組織p62 蛋白表達(dá)，且低氧訓(xùn)練的效果更加顯著，這與LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)相符。包裹脂滴的自噬體與溶酶結(jié)合后形成自噬溶酶體，在此結(jié)合過程中，溶酶體表面蛋白LAMP-2 發(fā)揮重要作用。前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP-1和LAMP-2雙缺陷細(xì)胞延遲了溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子Ras 相關(guān)蛋白7（Ras-related protein，Rab7 ）的募集，并且破壞了自噬體與溶酶體融合，從而破壞了自噬過程[35]。本研究中，經(jīng)過6 周的干預(yù)，運(yùn)動(dòng)、低氧和低氧訓(xùn)練組的LAMP-2蛋白表達(dá)都顯著提高，且低住高練較單純運(yùn)動(dòng)的干預(yù)效果更明顯。為了再次確認(rèn)自噬體是否與溶酶體結(jié)合，本研究利用LC3 和LAMP-2 進(jìn)行免疫熒光共定位，如圖3 所示，紅色熒光代表的是LAMP-2，綠色熒光代表的是LC3，藍(lán)色的斑點(diǎn)則是細(xì)胞核的發(fā)光顏色。自噬體與溶酶體結(jié)合后，自噬體標(biāo)記蛋白LC3和溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP-2共同定位于自噬溶酶體膜上，綠色熒光與紅色熒光疊加后形成黃色的熒光。與對(duì)照組相比，6 周的干預(yù)之后，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組、低氧組、低住高練組、高住低練組四組皮下脂肪細(xì)胞中的橙黃色斑點(diǎn)增多的現(xiàn)象。免疫熒光共定位結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同的低氧訓(xùn)練模式干預(yù)后LC3 與LAMP-2 熒光共定位系數(shù)都顯著提高；此外，低住高練組、高住低練組也顯著高于運(yùn)動(dòng)組、低氧組。LAMP-2是一種單跨溶脂膜蛋白，能保持溶解質(zhì)穩(wěn)定并參與自噬[36]，在運(yùn)動(dòng)和低氧干預(yù)后皮下組織細(xì)胞中LAMP-2與LC3蛋白表達(dá)升高以及免疫熒光信號(hào)增強(qiáng)，LC3和LAMP-2在自噬中發(fā)揮重要作用，并且二者增強(qiáng)信號(hào)高度重合，均證實(shí)腹股溝皮下脂肪細(xì)胞發(fā)生了脂噬作用。前人的研究表明運(yùn)動(dòng)、低氧以及饑餓等刺激時(shí)，mTOR 受到抑制，Beclin1 被激活，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化增加，p62表達(dá)減少，從而增強(qiáng)自噬活性，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的激活可以上調(diào)mTOR從而抑制自噬，而AMPK活化也能抑制mTOR增加自噬[37，38]。Liu等[39]的研究給纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5）缺乏的小鼠補(bǔ)充FNDC5，結(jié)果顯示，外源補(bǔ)充FNDC5 能通過恢復(fù)AMPK/mTOR 信號(hào)通路，上調(diào)LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)，從而激活自噬，減少肝臟中的脂質(zhì)累積。這與本研究的結(jié)果一致，也提示了脂噬的調(diào)控不僅與LC3、Beclin1、p62、LAMP-2 等關(guān)鍵因子的調(diào)控有關(guān)，還可能與AMPK/mTOR等信號(hào)調(diào)節(jié)因子有關(guān)。

綜上所述，不同低氧訓(xùn)練方式都能通過激活皮下脂肪組織脂噬作用降解脂滴，調(diào)控脂代謝，但具體的調(diào)控機(jī)制尚未明確，下一步的研究可以從低氧訓(xùn)練激活脂噬作用促進(jìn)脂代謝入手，進(jìn)一步探討此過程的具體調(diào)控機(jī)制，為低氧訓(xùn)練調(diào)控脂代謝提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

6 周的低氧訓(xùn)練能夠通過激活小鼠腹股溝皮下脂肪組織的脂噬作用促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝，且低住高練和高住低練的干預(yù)效果沒有明顯區(qū)別。