無乳鏈球菌感染方式對羅非魚血常規(guī)和抗體消長規(guī)律的影響

顧海聞，農源，蔣薇，2，王冬英，梁萬文，陳漢忠，吳文德*

（1廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；2賀州市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西賀州 542899；3廣西水產(chǎn)科學研究院，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】羅非魚是引入我國養(yǎng)殖最廣泛的魚類，具有雜食性、生長迅速、適應力強等特點（林虹等，2013）。近年來，我國羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口量均居世界首位，羅非魚養(yǎng)殖業(yè)已成為我國漁業(yè)的主要組成部分（Yuan et al.，2017；敖秋桅和朱佳杰，2020）。廣西是我國羅非魚的養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)之一，但在廣西各養(yǎng)殖區(qū)域羅非魚無乳鏈球菌病常呈暴發(fā)性流行，養(yǎng)殖戶為了控制疫情通常濫用各種藥物，致使病原菌普遍產(chǎn)生耐藥性，嚴重威脅廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（呂小麗等，2017）。據(jù)統(tǒng)計，2011年廣西地區(qū)因無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）感染引起的羅非魚死亡量超過7000 t，經(jīng)濟損失達8610.8萬元；2012年羅非魚無乳鏈球菌感染給我國漁業(yè)造成的經(jīng)濟損失達12億元（張行等，2020）。無乳鏈球菌是一種條件性致病菌，當羅非魚皮膚和腸黏膜受損時，病原菌更易侵入魚體加重感染及增加死亡率。因此，探索無乳鏈球菌感染方式對羅非魚血常規(guī)的影響及特異性抗體產(chǎn)生的消長規(guī)律，對開展羅非魚養(yǎng)殖業(yè)疫情預警和制定無乳鏈球菌抗體判斷標準均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】表皮是魚類與水生環(huán)境間的生物屏障，可保護魚類免受傳染病感染（Ellis，2001），而皮膚損傷直接影響魚類對細菌或病毒的易感性（Noble et al.，2012）。近年來，已有學者對魚類皮膚屏障受損原因及其與細菌感染間的關聯(lián)進行大量研究。Greaves和Tuene（2001）研究提出魚眼球受到創(chuàng)傷會引起嚴重的細菌繼發(fā)感染；Barthel等（2003）使用有繩結的網(wǎng)進行養(yǎng)殖魚群轉池時會造成魚鰭表皮受損，進而增加魚類疾病的感染率及死亡率；Braithwaite和McEvoy（2004）發(fā)現(xiàn)魚類在游泳時擦掉鱗片將極大增加患細菌或病毒病的風險；Harmache等（2006）研究發(fā)現(xiàn)傳染性造血壞死病毒會通過魚鰭損傷部位侵入體內而造成感染；D’Orbcastel等（2009）研究表明，飼養(yǎng)密度過高及抽水時水流速度太快均會增加魚體碰撞造成體表受損的概率；L?voll等（2009）發(fā)現(xiàn)體表受損的大西洋鮭魚更易感染Moritella viscosa；Jin等（2009）研究表明，寄生蟲侵染橄欖比目魚表皮后通常引起皮膚炎癥和損傷，繼發(fā)細菌感染，導致單核細胞和巨噬細胞水平明顯降低；Rombout等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，當病原體從硬骨魚肛門進入受損腸道內時，僅需少量抗原量就能引發(fā)全身抗體水平顯著升高；Koppang等（2015）認為魚鰓表面黏膜受損將增大病原體侵入的概率，并引起魚體強烈的炎癥反應?！颈狙芯壳腥朦c】無乳鏈球菌可通過糞口傳播感染周圍魚群，同時腹腔注射、肌肉注射、鰓接種、鼻腔接種、浸泡、灌胃含菌飼料等方法均能致使羅非魚感染無乳鏈球菌而發(fā)?。▌⑾?，2015；羅偉等，2018；敖秋桅和朱佳杰，2020）。此外，有學者開展了高鹽堿度、低溶解氧和高水溫等環(huán)境因素與無乳鏈球菌易感性間的關聯(lián)研究（祝璟琳和楊弘，2013），但鮮見針對無乳鏈球菌感染與羅非魚創(chuàng)傷或炎癥關聯(lián)的報道，因此妨礙了新型有效藥物及候選疫苗分子的發(fā)現(xiàn)?！緮M解決的關鍵問題】通過建立羅非魚皮膚創(chuàng)傷模型和腸炎模型，模擬自然環(huán)境下羅非魚體表損傷和細菌性腸炎，以健康羅非魚為對照，對不同健康狀況的羅非魚進行無乳鏈球菌浸泡感染，觀測急性感染無乳鏈球菌后的魚體健康狀況，檢測白細胞數(shù)量和種類變化及免疫應答血清抗體IgM的消長規(guī)律，旨在明確表皮損傷或某種原因造成的炎癥是否是羅非魚無乳鏈球菌病暴發(fā)的重要誘因，為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)疫情預警及無乳鏈球菌疫苗研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

吉富羅非魚（平均體質量約40 g）購自廣西南寧羅非魚良種場，暫養(yǎng)于消毒過的魚池（長7.0 m×寬1.5 m×高1.2 m）內，每天飼喂人工配合飼料，水溫保持在20~25℃，全天24 h供氧。無乳鏈球菌HN株和羅非魚陰、陽性血清及HRP標記鼠抗羅非魚IgM單克隆抗體由廣西大學動物科學技術學院寄生蟲實驗室保存提供。間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽、紅細胞裂解液和四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自Sigma公司；HRP標記羊抗鼠抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；脫脂奶粉、0.01 mol/L PBS（pH 7.2~7.4）粉末、大豆蛋白胨、胰蛋白胨及氯化鈉購自北京北京索萊寶科技有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS）購自Thermo Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 無乳鏈球菌培養(yǎng).對無乳鏈球菌HN株進行復蘇，在含5%兔血的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上劃線培養(yǎng)，挑取單個典型菌落接種至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)菌液6000 r/min離心5 min，棄上清液，細菌沉淀加入滅菌生理鹽水，用麥氏比濁管調整濃度至1.5×106CFU/mL。

1.2.2 試驗分組與處理.將180尾健康羅非魚隨機分為3組（健康組、皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組），每組60尾。皮膚創(chuàng)傷組處理：用無菌打孔器在靠近羅非魚背鰭部打2個孔（孔徑1.5 mm，孔深1.0 mm），放入32℃的50 L水族箱飼養(yǎng)。腸炎組處理：參考宋學宏（2015）的方法，羅非魚禁食24 h后放入60 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽溶液中浸泡麻醉10 min，采用聚丙烯管插入羅非魚肛門上端1 cm處，灌入0.06 mL的2.5%三硝基苯磺酸乙醇溶液，放入32℃水族箱飼養(yǎng)。飼養(yǎng)2 d待羅非魚生命狀態(tài)穩(wěn)定后向水族箱（長60 cm×寬45 cm×高55 cm）投入10 mL的1.5×106CFU/mL無乳鏈球菌懸液感染羅非魚。同時設3組空白對照組，不感染無乳鏈球菌，每組60尾。恒溫加熱棒控制水溫維持在32℃，全天24 h供氧，定時觀察羅非魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。所有羅非魚均參考廣西大學動物試驗倫理審查（GXU2020-010）進行處理。

1.2.3 白細胞計數(shù)測定.分別于無乳鏈球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8個時段，從健康組、皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組中隨機選取15尾羅非魚，進行魚尾鰭靜脈采血，采集的血液樣品經(jīng)臺盼藍染色后采用白細胞計數(shù)儀（Bio-Rad全自動細胞計數(shù)儀）進行計數(shù)，統(tǒng)計外周血白細胞總數(shù)，同時經(jīng)吉姆薩染色后觀察并統(tǒng)計淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞數(shù)量。統(tǒng)計感染無乳鏈球菌7 d內各處理組羅非魚的死亡尾數(shù)。

1.2.4 抗體測定.抗體測定參照吳文德等（2020）的方法：將1.5×108CFU/mL的菌懸液加入酶標板孔中，50 μL/孔，56℃烘箱烘干；加入-20℃預冷的甲醇，100 μL/孔，室溫固定15 min，棄甲醇，用蒸餾水洗滌3次，5 min/次；每孔加入200 μL 5%脫脂奶粉，放入恒溫箱37℃封閉2 h，PBS洗滌3次，5 min/次；將待檢血清進行1∶4稀釋，每孔加入100 μL，放入恒溫箱中37℃反應1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；每孔加入100 μL以PBS按1∶5000稀釋的HRP標記鼠抗羅非魚IgM單克隆抗體，放入恒溫箱中37℃反應1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；每孔加入100 μL TMB-H2O2顯色液，放入恒溫箱中37℃避光顯色20 min；每孔加入50 μL的2 mol/L H2SO4終止反應，置于酶標儀上讀取OD450值。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Origin 2018和Graph Pad v9.0進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。其中，多時間點試驗數(shù)據(jù)選用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），組間差異則采用LSD-t檢驗。

2 結果與分析

2.1 羅非魚幾種白細胞的形態(tài)特征

經(jīng)姬姆薩染色后在1000×顯微鏡下進行觀察，結果（圖1）發(fā)現(xiàn)，單核細胞的細胞核很大，染色較深，呈紫紅色，且偏向于細胞一側，細胞質染色較淺；淋巴細胞一般呈圓形，細胞核圓形，所占比例大，質地緊密，細胞質所占比例很小，僅在細胞核外圍形成細窄環(huán)狀，細胞質淡染，細胞核深染呈紫紅色；嗜中性粒細胞呈圓形，細胞核大、致密，偏向細胞一側，且通常分成兩葉，呈紫紅色，細胞質則呈淡紫色。

圖1 羅非魚幾種白細胞的形態(tài)特征（姬姆薩染色）Fig.1 Morphology of white blood cells of tilapia（WBCs）

2.2 不同處理組羅非魚的感染死亡情況

由圖2可知，與健康組羅非魚相比，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚的死亡時間提前，健康組羅非魚至感染后第7 d的累計死亡率為33.3%，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組則分別為53.3%和46.7%，均呈顯著升高趨勢（P＜0.05，下同），說明宿主的機體損傷會促進感染加重及病程延長。

圖2 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后7 d內的存活率比較Fig.2 Comparison of survival rates of tilapia in different groups within 7 d after artificial infection with S.agalactiae

2.3 不同處理組羅非魚外周血白細胞數(shù)量的變化趨勢

試驗期間，各感染組羅非魚外周血白細胞數(shù)量均呈先增加后減少的變化趨勢（圖3）。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚分別在感染無乳鏈球菌后72和24 h上升至峰值，且極顯著高于健康組羅非魚（P＜0.01，下同）。除感染后24和144 h外，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚感染無乳鏈球菌后的外周血白細胞總數(shù)量均顯著或極顯著高于健康組羅非魚；腸炎組羅非魚從感染無乳鏈球菌起直至感染后48 h，其外周血白細胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚，至感染后72 h下降至與健康組羅非魚無顯著差異（P＞0.05，下同）。至感染后168 h，由于健康組羅非魚外周血白細胞數(shù)量進一步下降，低于初始值，導致皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚外周血白細胞數(shù)量又極顯著高于健康組羅非魚?？梢?，無乳鏈球菌感染皮膚創(chuàng)傷或患有腸炎的羅非魚相對于健康魚能引起更強烈的免疫反應。

圖3 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后外周血白細胞數(shù)量的變化情況Fig.3 Changes in the number of peripheral blood leukocytes of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.4 不同處理組羅非魚外周血中性粒細胞數(shù)量的變化趨勢

皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚經(jīng)浸泡感染無乳鏈球菌后，其外周血中性粒細胞數(shù)量迅速增殖，從感染后24 h即與健康組羅非魚存在極顯著差異（圖4）。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚的外周血中性粒細胞數(shù)量分別在感染后96和24 h后達峰值，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚在感染后168 h內持續(xù)極顯著高于健康組羅非魚，腸炎組羅非魚則在感染后24~48 h內極顯著高于健康組羅非魚，之后逐漸下降至正常水平，至感染后168 h再次極顯著高于健康組羅非魚。

圖4 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后外周血中性粒細胞數(shù)量的變化情況Fig.4 Changes in the number of neutrophils in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.5 不同處理組羅非魚外周血單核細胞數(shù)量的變化趨勢

由圖5可看出，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚經(jīng)浸泡方式感染無乳鏈球菌120和24 h后，其外周血單核細胞數(shù)分別上升至峰值。皮膚創(chuàng)傷組羅非魚在感染后72~168 h的外周血單核細胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚，而腸炎組羅非魚只在感染后24 h極顯著高于健康組羅非魚，之后降至正常水平。

圖5 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后外周血單核細胞數(shù)量的變化情況Fig.5 Changes in the number of monocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.6 不同處理組羅非魚外周血淋巴細胞數(shù)量的變化趨勢

皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚在感染無乳鏈球菌后72和24 h，其外周血淋巴細胞數(shù)量分別達峰值。皮膚創(chuàng)傷組羅非魚從感染后24~168 h的外周血淋巴細胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚；腸炎組羅非魚在感染后24~48 h的淋巴細胞數(shù)量極顯著高于健康組羅非魚，感染后72~96 h則顯著或極顯著低于健康組羅非魚，但感染后144~168 h腸炎組羅非魚的外周血淋巴細胞數(shù)量再次極顯著高于健康組羅非魚（圖6）。

圖6 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后外周血淋巴細胞數(shù)量的變化情況Fig.6 Changes in the number of lymphocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.7 不同處理組羅非魚血清IgM抗體水平的變化趨勢

由圖7可看出，皮膚創(chuàng)傷組和健康組羅非魚感染無乳鏈球菌后產(chǎn)生特異性IgM抗體的時間較接近，均在第3周后大幅升高；相對于健康組羅非魚，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚的特異性抗體維持時間更久，7周后才降至正常水平，健康組羅非魚則在6周時已降至正常水平。與皮膚創(chuàng)傷組和健康組羅非魚相比，腸炎組羅非魚感染無乳鏈球菌后產(chǎn)生特異性抗體的時間更早，1周后即開始大幅升高，持續(xù)6周后才降至正常水平。

圖7 不同處理組羅非魚感染無乳鏈球菌后血清IgM抗體水平的變化情況Fig.7 Changes in the IgM antibody level in serum of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

3 討論

與哺乳動物相似，魚類的免疫系統(tǒng)分為特異性免疫和非特異性免疫。外周血白細胞數(shù)量的變化直接影響魚體特異性免疫和非特異性免疫的應答功能（Kaattari and Piganelli，1996；Manning and Nakanishi，1996；Secombes，1996）。魚類受細菌、病毒及有毒物質侵染時，其白細胞數(shù)量發(fā)生顯著變化，如遭受嗜水氣單胞菌感染的日本鰻鱺（張偉妮等，2011）及患敗血癥的鰱魚（米瑞芙等，1993），其白細胞數(shù)量顯著增多；攝入殺蟲劑的鯉魚（王媛等，2005），其白細胞數(shù)量隨殺蟲劑濃度的升高而增加。白細胞借助變形特性穿透血管壁，行使趨化功能，移動至細菌、毒素、機體細胞降解物等有害物質處，包圍并利用胞內各種酶系分解或消化吞噬有害物質。本研究也證實，羅非魚外周血白細胞數(shù)量的變化與機體損傷、炎癥及免疫反應相關，即白細胞數(shù)量變化可作為判斷羅非魚感染無乳鏈球菌后病理損傷和免疫應答的一個參考指標。白細胞按有無胞內顆粒物可分為有顆粒白細胞和無顆粒白細胞兩大類，前者主要是中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，后者包括淋巴細胞和單核細胞。中性粒細胞在感染初期發(fā)揮抵御病原菌入侵的作用，淋巴細胞則主要參與特異性免疫應答。李利和張其中（2007）以車輪蟲感染羅非魚，結果發(fā)現(xiàn)其淋巴細胞和中性粒細胞在感染初期呈顯著上升趨勢；但Pasnik等（2005）研究表明注射疫苗的羅非魚感染無乳鏈球菌后47 d其抗體水平才開始顯著上升，于感染后90 d達峰值。本研究中，羅非魚感染無乳鏈球菌后的抗體水平上升時間較Pasnik等（2005）的研究結果提前，可能與本研究的無乳鏈球菌感染濃度較高有關。

羅非魚機體出現(xiàn)損傷或炎癥時，其外周血白細胞數(shù)量顯著增加，主要是由于中性粒細胞和淋巴細胞的增多而引起，與Ranzani-Paiva等（2004）以分歧桿菌腹腔感染尼羅羅非魚后的白細胞數(shù)量變化趨勢相似。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚的無乳鏈球菌感染死亡率明顯高于健康組羅非魚，而感染空白對照組無羅非魚死亡現(xiàn)象，說明羅非魚感染無乳鏈球菌后會加重因轉池、運輸、寄生蟲感染等造成魚體表皮受到的損傷，或飼料霉變等原因造成的腸炎，從而促使羅非魚死亡。在3種感染方式中，羅非魚的中性粒細胞數(shù)量與未感染無乳鏈球菌時相比均明顯增加，因此可作為羅非魚感染無乳鏈球菌的重要判定指標之一。魚類白細胞中的單核細胞具有活躍的變形運動和吞噬能力，能吞噬并分解侵入機體的細菌，是結締組織巨噬細胞的前身，在一定條件下可分化為巨噬細胞等而參與免疫反應，同時作為天然免疫和獲得性免疫間的重要環(huán)節(jié)，可將抗原產(chǎn)物傳遞給淋巴細胞，協(xié)助淋巴細胞在免疫過程中發(fā)揮重要作用（袁仕取等，1998）。此外，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚的外周血單核細胞數(shù)量顯著高于空白組羅非魚，說明無乳鏈球菌感染會加重羅非魚自身表皮受損或某些原因產(chǎn)生的炎癥，無乳鏈球菌在自然條件中廣泛存在，是條件性致病菌，因此可將單核細胞數(shù)量變化作為監(jiān)測羅非魚是否受感染無乳鏈球菌的參考指標。淋巴細胞來源于骨髓多能造血干細胞，可劃分為T淋巴細胞、B淋巴細胞、K細胞和NK細胞，T淋巴細胞和B淋巴細胞受抗原物質刺激后能分化增殖產(chǎn)生免疫活性細胞，在免疫應答過程中起核心作用（Vallejo et al.，1992）。本研究中，健康組羅非魚在感染無乳鏈球菌后期其淋巴細胞數(shù)量顯著升高，而皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚均在感染后期出現(xiàn)淋巴細胞數(shù)量下降現(xiàn)象，說明機體損傷和炎癥對羅非魚免疫反應有抑制作用，與Verburg-van Kemenade等（1999）、Engelsma等（2003）的研究結果一致，即遭受應激的魚體血液皮質醇濃度增加引起淋巴細胞數(shù)量減少、嗜中粒細胞數(shù)量增加的表現(xiàn)一致，說明其作用機制存在一定關聯(lián)性。

在細菌入侵時，魚體也會與哺乳動物一樣產(chǎn)生針對病原菌的特異性抗體。IgM是魚類特異性免疫應答中最主要的介質之一，其血清抗體效價可直接反映魚體免疫接種的效果及病原菌感染后對魚體造成的影響（陳昌福，1998）。本研究中，不同健康狀況下以無乳鏈球菌感染羅非魚均會產(chǎn)生明顯的特異性抗體，且達峰值后高抗體水平能維持一段時間。但不同機體條件下羅非魚感染無乳鏈球菌產(chǎn)生的免疫應答能力有區(qū)別，特異性抗體產(chǎn)生的時間也存在時效差異，健康組羅非魚在遭受無乳鏈球菌侵襲時，其皮膚的固有屏障作用致使大部分抗原顆粒停留在皮膚和魚鰓中，僅有相對少量的抗原進入機體，免疫應答也主要發(fā)生在黏膜免疫組織，因此血清抗體出現(xiàn)較皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚晚，且血清抗體水平維持時間較短，消退較快。皮膚創(chuàng)傷模型制的人工造創(chuàng)口較小，皮膚的完整性和皮膚黏膜免疫并無明顯下降趨勢，在感染無乳鏈球菌后其血清抗體產(chǎn)生的時間與健康組羅非魚相近，但相對于健康魚體，浸泡感染過程中無乳鏈球菌更易從創(chuàng)口進入機體，且在后續(xù)的感染過程中無乳鏈球菌持續(xù)作用，血清抗體達峰值后較健康組羅非魚持續(xù)的時間更長。在腸炎組羅非魚中，魚體抵抗環(huán)境病原體侵襲的最初屏障受損，腸黏膜系統(tǒng)對魚類免疫保護機能下降，黏膜免疫系統(tǒng)此時無法獨立于系統(tǒng)免疫完成免疫應答，大量無乳鏈球菌進入機體，血清抗體出現(xiàn)時間早且達峰值時間長?？梢姡岣哂行Э贵w水平的維持時間是確保羅非魚無乳鏈球菌疫苗免疫成功的關鍵。

4 結論

羅非魚在無乳鏈球菌感染前后并發(fā)機械性或免疫性病理損傷及炎癥，會導致感染死亡率升高，即感染無乳鏈球菌后會加重因轉池、運輸、寄生蟲感染等造成魚體表皮受損，或飼料霉變等原因造成的腸炎，進而導致羅非魚死亡率上升。血常規(guī)和抗體水平的消長規(guī)律能反映羅非魚無乳鏈球菌的感染情況，其中，外周血白細胞數(shù)量變化可作為判斷羅非魚感染無乳鏈球菌后病理損傷和免疫應答的參考指標。