曲面響應(yīng)法優(yōu)化核桃雄花多酚提取工藝及其組成與抗氧化活性分析

王紀(jì)輝，曾亞軍，侯娜*，耿陽陽*，胡伯凱，劉亞娜，張時(shí)馨，楊光

（1貴州省林業(yè)科學(xué)研究院核桃研究所，貴州貴陽 550005；2貴州陽光食品有限公司，貴州畢節(jié) 551600）

0 引言

【研究意義】核桃雄花別名核桃絮、長壽菜和龍須菜，鮮嫩的核桃雄花可烹飪食用，經(jīng)炒制后具有清香氣味、口感鮮嫩清脆（張文娥等，2016；張俊麗等，2018）。核桃雄花資源豐富，是一種亟待開發(fā)的天然營養(yǎng)保健食品資源，開發(fā)利用前景廣闊（胡大佐等，2020）。目前大量核桃雄花被當(dāng)作廢棄物燒毀，或堆放于耕地以腐爛，加之日曬雨淋、引起土地酸化，造成嚴(yán)重環(huán)境問題（張柳婷等，2021）；核桃雄花富含多酚和礦物元素，這些活性物質(zhì)未得到合理利用，造成很大的資源浪費(fèi)（韓本勇和任英，2014；胡伯凱等，2018）。因此，探索核桃雄花中多酚物質(zhì)提取及其特性，對核桃雄花的資源化開發(fā)利用具有一定意義。【前人研究進(jìn)展】核桃雄花序富含鉀（K）和鈉（Na），在維持機(jī)體酸堿平衡方面有重要作用（樊建等，2000）。鐵（Fe）、錳（Mn）、鋅（Zn）、硒（Se）及β-胡蘿卜素等可參與人體蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪代謝等過程（俞秀玲和侯小玲，2012），而多酚類物質(zhì)在維持細(xì)胞正常功能、清除自由基、抗氧化等方面作用突出（Shi et al.，2005；Porto et al.，2013；孔 方 南 等，2020）。樊建等（2000）研究pH、溫度和3種陽離子溶液對核桃雄花序蛋白質(zhì)提取率的影響，發(fā)現(xiàn)核桃雄花序蛋白質(zhì)在堿性溶液中抽提率較大、在酸性溶液中最小，溫度對其影響不明顯，Na+和K+溶液中的抽提率明顯大于Ca2+溶液。核桃雄花序采摘或落地后外表極易氧化而呈深黑色，屬天然黑色素提取原料之一，余曉煥等（2007）研究核桃花中黑色素提取工藝，結(jié)果顯示固液比1∶150、提取時(shí)間1.5 h、提取級數(shù)一級時(shí)，提取率可達(dá)28.96%，色價(jià)為48.08。賈忠（2008）采用重結(jié)晶、硅膠柱層析和聚酰胺柱層析等方法從核桃雄花序中分離純化得到13種化合物，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定了10種化合物。汪海波等（2008）發(fā)現(xiàn)核桃雄花序有一定的抗氧化活性，乙酸乙酯提取物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除作用優(yōu)于叔丁基-4-羥基茴香醚（BHA）。王長雷等（2015）優(yōu)化得到核桃雄花中多酚提取工藝：料液比1∶30、甲醇體積分?jǐn)?shù)30%、溫度70℃、時(shí)間70 min，雄花多酚提取率為2.63%。漂燙可有效鈍化氧化酶活性，便于干制（Zheng and Lu，2011），張文娥等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，隨漂燙時(shí)間延長，核桃雄花的多酚和總黃酮含量明顯降低，抗氧化能力也隨之下降。陳靜等（2019）研究發(fā)現(xiàn)盛果期鐵核桃雄花的常規(guī)營養(yǎng)成分、礦質(zhì)營養(yǎng)及氨基酸含量高于初果期雄花，但初果期雄花生物活性物質(zhì)含量高，抗氧化能力較強(qiáng)。【本研究切入點(diǎn)】傳統(tǒng)的溶劑浸提法提取時(shí)間較長，通常超1.0 h，多酚提取率較低，而超聲提取是利用超聲波作用于介質(zhì)（Ghitescu et al.，2015；Saini et al.，2019），使植物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體在瞬間破裂，縮短破碎時(shí)間（Bochi et al.，2014；Mojzer et al.，2016），同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率（d’Alessandroa et al.，2012；Wong Paz et al.，2015）。近年來，植物多酚的抗氧化活性受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究（Xiong et al.，2017），但針對核桃雄花中活性成分多酚超聲提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以干燥核桃雄花為原料，探討料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲功率等參數(shù)對雄花多酚提取率的影響，采用多元二次回歸方程對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化擬合，確定較佳提取條件，并對提取的雄花多酚抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為核桃雄花的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

泡核桃雄花于2020年4月中旬采自貴州省核桃研究所良種基地。多酚單體標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級）和福林酚購自上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇和甲醇購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃鹽酸購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；無水碳酸鈉購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L（+）-抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷、焦性沒食子酸和水楊酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫和硫酸亞鐵購自成都金山化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備：MS104TS電子天平［梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司］、KQ-500DE浴槽式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、L5S紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、3-18R臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）、XH-C旋渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠）、LGJ-22系列冷凍干燥機(jī)［四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司］、101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、HH-S型水浴鍋（常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠）、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、EM-30臺式掃描電鏡（庫賽姆）、ETD-900M小型離子濺射儀（北京意力博通技術(shù)發(fā)展有限公司）、U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）和HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃雄花樣品制備將新鮮核桃雄花置于-40℃真空冷凍干燥機(jī)中干燥30 h，在硅膠干燥器中冷卻至室溫，采用多功能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩備用。

1.2.2 影響因素試驗(yàn).以乙醇溶液作提取劑，考察料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲功率對核桃雄花多酚提取率的影響，其中設(shè)料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80和1∶100（g/mL，下同），提取時(shí)間10、20、30、40和50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%和90%，提取溫度20、30、40、50和60℃，超聲功率200、250、300、350和400 W，以多酚提取率作評價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和多酚提取率計(jì)算參考梁杏（2016）的方法，略有改動(dòng)，采用Folin-Ciocaileu比色法，稱取核桃雄花粉末0.2 g，按照料液比1∶60加入提取液置于浴槽式數(shù)控超聲波清洗器中，200 W下提取20 min，取出，8000 r/min離心5 min，取上清液。吸取1.0 mL上清液放入試管中，加入蒸餾水將上清液稀釋至一定比例，取1.0 mL上清液測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0103c+0.0196，計(jì)算多酚提取率。

式中，y為吸光值，c為樣品多酚濃度（μg/mL），V為提取液總體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 多元二次回歸方程模型.基于單因素試驗(yàn)及顯著性分析結(jié)果，選取料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度4個(gè)因素，以多酚提取率為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the test

1.2.5 核桃雄花多酚體外自由基清除對比試驗(yàn)核桃雄花多酚制備：稱取一定質(zhì)量雄花粉末，按料液比1∶40加入50%乙醇提取液，置于浴槽式數(shù)控超聲波清洗器中，60℃、300 W下提取30 min，得到多酚提取液，8000 r/min離心后取上清液測定多酚含量，再配制成不同濃度梯度多酚樣液備用。核桃雄花多酚、抗壞血酸及BHT濃度梯度樣液均用50%乙醇溶液稀釋并定容，配成所需濃度進(jìn)行清除自由基試驗(yàn)。

1.2.5 .1 對超氧陰離子的清除作用.參考楊喆等（2015）的方法并略作改動(dòng)，吸取2.3 mL 0.05 mol/L Trs-HCl緩沖液（pH 8.2）于具塞試管中，分別加入1.0 mL 0.01、0.03、0.05、0.07、0.09和0.11 mg/mL多酚待測液及1.0 mL 5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻置于室溫下反應(yīng)20 min，加入2滴濃鹽酸終止反應(yīng)，多酚待測液在420 nm處測的吸光值為A。以超純水代替樣本溶液測的吸光值為A0，以超純水代替鄰苯三酚溶液測的吸光值為A1，核桃雄花多酚的超氧陰離子清除率按下式計(jì)算：

1.2.5 .2 對羥基自由基的清除作用采用水楊酸法測定。吸取1.5 mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mg/mL多酚待測液，依次加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4、2.0 mL 6 mmol/L水楊酸—乙醇溶液和2.0 mL 6 mmol/L H2O2溶液，混勻置于37℃水浴中反應(yīng)30 min，多酚待測液在510 nm處測的吸光值為A。以超純水代替樣本溶液測的吸光值為A0，以超純水代替H2O2溶液測的吸光值為A1，核桃雄花多酚的羥基自由基清除率計(jì)算公式（王新然，2019）如下：

1.2.6 核桃雄花多酚物質(zhì)分析鑒定

1.2.6 .1 樣品溶液制備.取核桃雄花粉末3.5 g置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 50%甲醇水溶液，置于浴槽式數(shù)控超聲波清洗器中，50℃、300 W下提取30 min，重復(fù)提取2次，合并提取液。提取液經(jīng)8000 r/min離心10 min，上清液在65℃下減壓濃縮至膏狀后用10.0 mL 50%甲醇超聲輔助溶解，離心10 min，上清液置于10 mL容量瓶中，定容，即為多酚提取液，置于-4℃冰箱中冷藏備用（可保存7 d）（史斌斌等，2017）。多酚提取液用0.22 μm親水濾膜過濾，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，放入自動(dòng)進(jìn)樣器中。

1.2.6 .2 檢測條件.色譜柱為CAPCELL PAK C18，流動(dòng)相為0.8%乙酸溶液（A相）、色譜甲醇（B相），進(jìn)樣量5 μL，流速0.9 mL/min。對照品沒食子酸、兒茶素、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、丁香醛、對香豆素和阿魏酸采用洗脫程序1，蘆丁、楊梅素、胡桃醌和槲皮素采用洗脫程序2。其中，洗脫程序1為柱溫30℃，波長280 nm（洗脫梯度：0~10 min，10%~20% B；10~30 min，20%~50% B；30~40 min，50% B；40~41 min，50%~100% B；41~50 min，100% B；50~51 min，100%~10% B；51~60 min，10% B）；洗脫程序2為柱溫25℃，波長251 nm（洗脫梯度：0~10 min，10%~40% B；10~25 min，40%~60%B；25~35 min，60%~80% B；35~36 min，80%~100%B；36~46 min，100% B；46~47 min，100%~10% B；47~57 min，10% B）。

1.2.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察.采用Scanning electron microscope（SEM）對超聲處理前后的核桃雄花粉末進(jìn)行表觀形貌觀察。在樣品臺貼上雙面膠，雙面膠上均勻放置少量樣品，吹去多余樣品，噴金處理，再利用SEM進(jìn)行掃描觀察、拍照（李明娟等，2021）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，Origin 9.1制圖及相關(guān)分析，以SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對核桃雄花多酚提取率的影響.由圖1可知，料液比在1∶20~1∶40和1∶60~1∶100時(shí)，隨著溶劑用量的增大，核桃雄花多酚提取率顯著提高（P＜0.05，下同），料液比在1:40~1:60時(shí)多酚提取率顯著下降，可能是溶劑用量繼續(xù)增大致使部分脂溶性雜質(zhì)滲出，阻礙多酚擴(kuò)散、滲透；料液比為1∶100時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值（17.91 mg/g）；料液比為1∶40和1∶80時(shí)，多酚提取率較大，且料液比1∶40與1∶80、1∶80與1∶100之間多酚提取率差異不顯著（P＞0.05，下同），加之溶劑用量太大不利于后續(xù)多酚提純，所以在料液比為1∶40時(shí)核桃雄花多酚提取更經(jīng)濟(jì)。

圖1 不同料液比對核桃雄花多酚提取率的影響Fig.1 Effects of different solid to liquid ratios on polyphenol extraction yield from walnut male flowers

2.1.2 提取時(shí)間對核桃雄花多酚提取率的影響由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，核桃雄花多酚提取率顯著提高，在30 min時(shí)達(dá)最大值（20.23 mg/g），30 min后多酚提取率逐漸降低。30 min與10、20、50 min相比多酚提取率分別顯著提高28.76%、19.69%和18.64%，但與40 min多酚提取率間無顯著差異，多酚提取率增幅為9.36%。由于提取時(shí)間為30 min時(shí)，雄花多酚溶出已達(dá)飽和狀態(tài)，且多酚易受外界環(huán)境的影響而較易發(fā)生氧化，因此本研究選擇提取時(shí)間為30 min。

圖2 不同提取時(shí)間對核桃雄花多酚提取率的影響Fig.2 Effects of different extraction times on polyphenol extraction yield from walnut male flowers

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對核桃雄花多酚提取率的影響.由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%~50%時(shí)，核桃雄花多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，雄花多酚提取率達(dá)最高值（16.67 mg/g）；乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%~90%時(shí)，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，多酚提取率逐漸降低。乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚提取率較乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、30%和90%分別顯著增加68.80%、36.55%和103.17%，較乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的多酚提取率增加15.22%，但二者差異不顯著。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，溶液極性逐漸減小，當(dāng)乙醇水溶液與提取物極性相近時(shí)，核桃雄花多酚提取率達(dá)最大值，因此本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對核桃雄花多酚提取率的影響Fig.3 Effects of different ethanol volume fraction on polyphenol extraction yield from walnut male flowers

2.1.4 提取溫度對核桃雄花多酚提取率的影響由圖4可知，提取溫度為20~40℃時(shí)，核桃雄花多酚提取率隨提取溫度的升高而逐漸增加，但變化不顯著；提取溫度為40~50℃時(shí)，多酚提取率隨提取溫度的升高而顯著增加；提取溫度為50~60℃時(shí)，多酚提取率趨于平緩，增加不顯著；核桃雄花多酚提取率在提取溫度為60℃時(shí)達(dá)最大值（21.94 mg/g）。溫度升高能加快多酚溶出，然而溫度過高，雜質(zhì)浸出會(huì)增多，且黃酮類物質(zhì)不耐高溫，致使有效成分溶出減少，因此，本研究將提取溫度設(shè)定為55℃。

圖4 不同提取溫度對核桃雄花多酚提取率的影響Fig.4 Effects of different extraction temperatures on polyphenol extraction yield from walnut male flowers

2.1.5 超聲功率對核桃雄花多酚提取率的影響由圖5可知，超聲功率為200~350 W時(shí)，核桃雄花多酚提取率隨超聲功率增大而逐漸增加，其中超聲功率在200~300 W和250~350 W范圍內(nèi)時(shí)，多酚提取率增加不顯著；超聲功率在350~400 W范圍內(nèi)時(shí)，多酚提取率逐漸降低，但變化不顯著。超聲功率為350 W時(shí)，核桃雄花多酚提取率最高（19.25 mg/g），但與超聲功率為250、300和400 W時(shí)的多酚提取率差異不顯著，因此，本研究選擇超聲功率為300 W。

圖5 不同超聲功率對核桃雄花多酚提取率的影響Fig.5 Effects of different ultrasound powers on polyphenol extraction yield from walnut male flowers

2.2 核桃雄花多酚提取工藝多元二次回歸方程擬合結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定超聲功率為300 W，以料液比（X1）、提取時(shí)間（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）和提取溫度（X4）為影響因素，以多酚提取率（Y）為考察指標(biāo)，采用多元二次回歸方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)多元二次回歸方程擬合，得到核桃雄花多酚提取率（Y）與4個(gè)自變量之間的四元二次回歸方程模型：Y=22.02+0.75X1+0.18X2+0.15X3+0.49X4-0.41X1X2-0.64X1X3+0.19X1X4-0.022X2X3+0.28X2X4-0.35X3X4-2.26X12-1.51X22-0.69X32-0.86X42；經(jīng)方差分析，模型（P＜0.0001）極顯著，失擬度（P=0.8247＞0.05）不顯著，說明該模型切實(shí)可行；由F、P及顯著性水平差異可知，4因素對核桃雄花多酚提取率的影響排序?yàn)椋篨1＞X4＞X2＞X3。一次項(xiàng)X1和X4、交互項(xiàng)X1X3及二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42對核桃雄花多酚提取率的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01，下同）；二次項(xiàng)X1X2對核桃雄花多酚提取率的影響達(dá)顯著水平。此外，回歸方程模型的變異系數(shù)為1.86%＜10%，表明多酚提取率變異中僅1.86%不能由該模型解釋，試驗(yàn)可靠性高，重復(fù)性好?；貧w方程模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9665，說明試驗(yàn)值與預(yù)測值擬合較好。

表2 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for regression model

通過多元二次回歸方程模型預(yù)測分析，并將得到的提取工藝參數(shù)進(jìn)行修正，得出核桃雄花多酚提取優(yōu)化條件為：料液比1∶41、提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度52℃，理論提取率為22.17 mg/g，通過試驗(yàn)驗(yàn)證模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，得到核桃雄花多酚提取率為21.32 mg/g，與理論值相對誤差為3.83%，說明多元二次回歸方程能較好模擬和預(yù)測核桃雄花多酚提取率，進(jìn)而證明提取技術(shù)參數(shù)的可行性，表明建立的回歸模型準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，優(yōu)化設(shè)計(jì)方案切實(shí)可行。

2.3 核桃雄花各影響因素相關(guān)分析結(jié)果

由圖6可知，料液比與提取溫度、超聲功率之間均表現(xiàn)出正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，相關(guān)系數(shù)均為0.83，說明料液比對核桃雄花多酚提取率的影響變化與提取溫度、超聲功率較一致；提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率呈正相關(guān)，但相關(guān)性也不顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.86和0.60，表明提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的互相作用對核桃雄花多酚提取率的影響強(qiáng)于提取時(shí)間與超聲功率的互相作用；提取溫度與超聲功率之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.84，表明不同提取溫度與超聲功率處理核桃雄花，其多酚提取率走向變化較相似，二者互作對核桃雄花多酚提取率有較大的影響。綜上可知，在核桃雄花多酚提取過程中，多酚的溶出率不只是受單一因素的影響，而是影響因素之間互相作用的結(jié)果。

圖6 各影響因素相關(guān)分析Fig.6 Correlation analysis of the influencing factors

2.4 核桃雄花多酚物質(zhì)種類及含量

由圖7可知，從核桃雄花中共鑒定出4種單體酚，分別是沒食子酸、綠原酸、蘆丁和槲皮素，其中蘆丁含量最高，為804 μg/g，綠原酸含量（181 μg/g）次之，槲皮素含量（41 μg/g）較低，沒食子酸含量最低，僅為18 μg/g；蘆丁含量分別是綠原酸、槲皮素和沒食子酸含量的4.44倍、19.61倍和44.67倍，且差異均達(dá)極顯著水平；綠原酸含量分別是槲皮素和沒食子酸含量的4.41倍和10.06倍，差異均達(dá)極顯著水平；槲皮素與沒食子酸含量之間差異達(dá)顯著水平。

圖7 核桃雄花中單體酚含量Fig.7 Monophenol content in walnut male flowers

2.5 核桃雄花多酚體外自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 超氧陰離子清除效果由圖8可知，核桃雄花多酚、抗壞血酸和BHT對超氧陰離子清除效果顯著，三者對超氧陰離子清除率均隨濃度升高呈逐漸增加趨勢；就抗氧化能力強(qiáng)弱而言，抗壞血酸最強(qiáng)，核桃雄花多酚次之，BHT最弱。雄花多酚濃度為0.11 mg/mL時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)42.37%，較濃度為0.01和0.03 mg/mL的清除率分別顯著提高33.03%和12.35%，較濃度為0.05、0.07和0.09 mg/mL的清除率分別提高7.33%、6.00%和3.98%，但差異不顯著；抗壞血酸清除超氧陰離子能力最強(qiáng)，抗壞血酸濃度為0.11 mg/mL時(shí)，超氧陰離子清除率接近70.00%；BHT清除作用較弱，濃度為0.11 mg/mL時(shí)，超氧陰離子清除率低于30.00%。

圖8 核桃雄花多酚清除超氧陰離子效果Fig.8 Effects of eliminating superoxide anion of walnut male flowers polyphenols

2.5.2 羥基自由基的清除效果.由圖9可知，核桃雄花多酚、抗壞血酸和BHT對羥基自由基均有一定的清除作用，表現(xiàn)為抗壞血酸＞雄花多酚＞BHT；三者對羥基自由基清除率均隨濃度增大呈逐漸增加趨勢。核桃雄花多酚濃度為0.6 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率最高，為15.06%，較濃度0.1、0.2、0.3和0.4 mg/mL的清除率分別顯著提高79.94%、65.04%、31.56%和23.96%，但與0.5 mg/mL相比，清除率無顯著差異，清除率增幅為14.53%；抗壞血酸濃度為0.6 mg/mL時(shí)清除率最高，接近100.00%，0.3 mg/mL時(shí)清除率已超50.00%；BHT在濃度為0.6 mg/mL時(shí)清除率也最高，但低于15.00%。

圖9 核桃雄花多酚清除羥基自由基效果Fig.9 Effects of eliminate hydroxy radical of walnut male flowers polyphenols

2.6 超聲處理對核桃雄花粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

就100倍電鏡觀察而言，未經(jīng)超聲處理（對照組）（圖10-A）和經(jīng)超聲處理后（處理組）（圖10-C）核桃雄花均呈現(xiàn)大小不一的形狀，其形狀類似蓮藕籽。就1000倍電鏡觀察而言，對照組核桃雄花呈方形，形狀類似石頭，表面有凹陷，并有片狀顆粒附著其上，整個(gè)輪廓較緊實(shí)（圖10-B）；處理組形狀類似棉花團(tuán)，表面無明顯片狀顆粒，整個(gè)組織形態(tài)較空洞、松散（圖10-D）。可見，經(jīng)超聲處理的核桃雄花組織結(jié)構(gòu)不緊密、塌陷、較松垮，有利于組織內(nèi)部的多酚物質(zhì)穿過層層細(xì)胞組織進(jìn)入提取溶劑（李明娟等，2021）。

圖10 核桃雄花粉經(jīng)超聲處理前后的SEM圖Fig.10 Scanning electron microscope micrographs of walnut male flower powders before and after ultrasound treatment

3 討論

3.1 核桃雄花多酚的提取工藝

植物組織中多酚類物質(zhì)通常以氫鍵和疏水鍵形式與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合成化合物，多酚類物質(zhì)分子之間也是以此種方式進(jìn)行結(jié)合（方芳和王鳳忠，2018）。提取溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，因能破壞多酚物質(zhì)分子之間形成的氫鍵，進(jìn)而減弱多酚分子間締合作用，有利于多酚溶出，且不與多酚物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，浸出雜質(zhì)少，較易分離，因此上述有機(jī)溶劑在提取植物多酚中最常用。此外，料液比、提取時(shí)間、溶劑濃度和提取溫度等因素會(huì)對植物中酚類物質(zhì)提取效果、植物多酚充分溶出及多酚有效成分保護(hù)產(chǎn)生直接影響（林建城等，2015）。本研究在確定超聲功率為300 W的基礎(chǔ)上，經(jīng)多元二次方程回歸得到核桃雄花多酚提取優(yōu)化參數(shù)：料液比1∶41、提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度52℃，得到多酚提取率平均值為21.32 mg/g。王長雷等（2015）優(yōu)化得到核桃雄花多酚類物質(zhì)較佳提取工藝條件為料液比1∶30、甲醇體積分?jǐn)?shù)30%、溫度70℃、浸提時(shí)間10 min，核桃雄花多酚含量為6.56%，高于本研究結(jié)果，究其原因可能是提取所用溶劑類型不同。王長雷等（2015）前期研究發(fā)現(xiàn)甲醇較乙醇能更好地提取核桃雄花中的多酚物質(zhì)，與甲醇、乙醇分子結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，可能甲醇的分子結(jié)構(gòu)更有利于破壞聚合酚之間的化學(xué)鍵，促進(jìn)聚合酚解體，此外可能與測定樣品也存在關(guān)聯(lián)，本研究是用整個(gè)雄花穗進(jìn)行多酚提取，而王長雷等（2015）是用雄花序，雄花穗中存在的雄花粉可能會(huì)阻礙多酚滲出，致使本研究多酚提取率較低。此外，本研究采樣地點(diǎn)為貴陽市，而王長雷等（2015）采樣點(diǎn)為赫章縣財(cái)神鎮(zhèn)，該地海拔較高，高海拔地區(qū)可能更有利于多酚物質(zhì)的積累和轉(zhuǎn)化。丁建英等（2018）采用響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉多酚工藝條件，得到較佳工藝參數(shù)為：提取溫度67℃、提取時(shí)間40 min、料液比1∶25、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此條件下得到枇杷葉多酚提取率為48.24 mg/g；孔方南等（2020）優(yōu)化刺果番荔枝葉多酚乙醇浸提工藝，在乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1∶50、提取時(shí)間96 min、提取溫度60℃的條件下，多酚提取率達(dá)20.37 mg/g。綜上可見，來源不同的植物多酚采用乙醇提取的工藝存在差別、提取率也有所差異，可能與植物原料中固有的多酚含量、原料本身細(xì)胞壁厚度和通透性，以及所含的多酚種類和性質(zhì)等影響因素存在密切關(guān)聯(lián)（林建城等，2015）。此外，相同來源的植物原料多酚含量也存在差異，可能與浸提溶劑、提取溫度、樣品品種及采樣地域和海拔高度等因素密切相關(guān)。

本研究中，核桃雄花多酚提取率隨料液比增大呈升—降—升的變化趨勢，可能是提取溶劑增大，傳質(zhì)動(dòng)力就越大，多酚物質(zhì)更容易釋放溶出（汪濤等，2021），之后提取溶劑用量增加引起其他脂溶性成分溶出，與多酚產(chǎn)生競爭，致使多酚提取率下降；繼續(xù)增大提取溶劑用量，植物組織內(nèi)部液泡中極性較弱的其他酚類物質(zhì)又繼續(xù)溶出。核桃雄花多酚提取率隨提取時(shí)間延長呈倒U型，提取前期超聲產(chǎn)生的機(jī)械波穿透植物組織，溶劑與細(xì)胞內(nèi)部濃度差促使多酚物質(zhì)相繼擴(kuò)散溶出；多酚穩(wěn)定性較差，時(shí)間過長有氧氣進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)，致使多酚氧化分解，此時(shí)其他雜質(zhì)成分也相繼溶出，進(jìn)一步導(dǎo)致多酚提取率降低（董樂等，2020）。乙醇水溶液兼具一定的極性和非極性，能很好地將植物組織內(nèi)部多酚帶出，本研究中核桃雄花多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈先上升后下降的變化趨勢，與趙強(qiáng)等（2020）研究得出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，藜麥糠多酚提取率先增后降的結(jié)果一致。乙醇浸提下多酚提取率呈現(xiàn)的這種變化與其所含酚羥基的極性相關(guān)，依據(jù)相似相溶原理，乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，溶劑極性下降，部分脂溶性成分溶出與多酚形成競爭，致使多酚提取率降低（徐萍等，2020）。溫度對核桃雄花多酚提取效果影響顯著，在試驗(yàn)設(shè)定的溫度梯度范圍內(nèi)核桃雄花多酚提取率呈逐漸增加的變化趨勢，可能原因是溫度升高使溶劑分子具有足夠的能量滲透進(jìn)入細(xì)胞膜，多酚物質(zhì)與大分子之間的氫鍵和疏水鍵遭到破壞，利于多酚溶出，多酚提取率得以提高。超聲功率直接影響機(jī)械波穿透細(xì)胞的能量強(qiáng)弱，本研究中核桃雄花多酚提取率隨超聲功率增大呈先升高后略有下降的變化趨勢，可能是一定范圍內(nèi)的超聲功率促使介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)加速，利于多酚物質(zhì)滲出（張海容等，2019），而超聲功率過大，大分子間的氫鍵和疏水鍵出現(xiàn)斷裂，多糖及蛋白質(zhì)大分子溶出，致使多酚提取率降低。

3.2 核桃雄花多酚組成及清除自由基能力

本研究從核桃雄花中測出4種單體酚，即蘆丁、綠原酸、槲皮素和沒食子酸。Chrzanowski等（2010）發(fā)現(xiàn)核桃雄花序的主要化合物為香草酸（359.5 μg/g），沒食子酸含量（32.7 μg/g）最低，本研究結(jié)果與Chrzanowski等（2010）的研究結(jié)果存在差異，究其原因可能是所用樣品不同；本研究采用整個(gè)雄花穗進(jìn)行提取分析，Chrzanowski等（2010）僅以雄花序進(jìn)行提取，然而二者均檢測到綠原酸和沒食子酸，本研究的沒食子酸含量約為Chrzanowski等（2010）的一半，綠原酸含量較高，但本研究鑒定出的多酚種類較少，可能與樣品處理方法不同有關(guān)。Pop等（2021）以40%丙酮為浸提溶劑，從核桃雄花中測出槲皮素含量為101.9 μg/g，高于本研究測定結(jié)果，可能原因是提取采用的有機(jī)溶劑不同，丙酮—水溶液較甲醇—水溶液更能兼顧槲皮素的溶解性，有待后續(xù)探索驗(yàn)證。

天然抗氧化劑能清除自由基，所以從植物中提取抗氧化劑植物多酚已逐漸被醫(yī)藥、食品及材料等領(lǐng)域廣泛關(guān)注（Li et al.，2011），然而目前體內(nèi)活性研發(fā)投入過大、耗時(shí)太長，故抗氧化活性物質(zhì)研究主要以體外模擬為主。本研究結(jié)果表明，核桃雄花多酚能清除超氧陰離子和羥基自由基，在一定范圍內(nèi)樣品濃度增加，清除能力隨之增強(qiáng)，但其清除能力較抗壞血酸低，可能是研究提取的雄花多酚純度較低，其中含有的雜質(zhì)會(huì)對多酚類物質(zhì)的共軛結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。雖然核桃雄花多酚能清除超氧陰離子和羥基自由基，但對不同自由基清除能力存在差異，是由多酚類化合物結(jié)構(gòu)所決定，其羥基數(shù)量和位置直接影響抗氧化活性。柏宏偉等（2015）得出板栗雄花醇提物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對DPPH·清除率低于抗壞血酸；張珍林等（2020）發(fā)現(xiàn)霍山石斛和鐵皮石斛干花均能清除DPPH·和還原鐵氰化鉀，但清除效果和還原能力均低于抗壞血酸，本研究結(jié)果與其具有相似之處；邢敏等（2021）研究發(fā)現(xiàn)杜仲雄花多酚濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子的清除率低于20%，杜仲雄花多酚濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的清除率達(dá)72.01%，而本研究發(fā)現(xiàn)核桃雄花多酚濃度為0.09 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子的清除率達(dá)41.00%，核桃雄花多酚濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的清除率僅為13.15%，對超氧陰離子的清除率明顯高于邢敏等（2021）的研究結(jié)果，但對羥基自由基的清除率明顯低于邢敏等（2021）得出的結(jié)果，與不同原料中多酚的組成密切相關(guān)。綜上，核桃雄花多酚具有一定的抗氧化能力，為其發(fā)揮抗氧化作用提供了可能。因此，下一步將開展分離和純化核桃雄花多酚及確定有效抗氧化成分結(jié)構(gòu)研究。

4 結(jié)論

多元二次回歸方程模型能較好的模擬和預(yù)測核桃雄花多酚提取率，雄花多酚提取率是多種影響因素共同互相作用的復(fù)雜結(jié)果；核桃雄花富含多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑材料來源加以開發(fā)利用。