低溫馴化對菊花品種抗寒性的影響

王珂，李繼東

（1商丘職業(yè)技術學院，河南商丘 476000；2河南農(nóng)業(yè)大學，河南鄭州 450046）

0 引言

【研究意義】菊花［Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.］是我國十大傳統(tǒng)名花之一，同時也是世界著名的四大切花之一（李榮華等，2012）。菊花種質資源非常豐富，在我國乃至世界花卉市場中一直占據(jù)著非常重要的主導地位（孫靜，2012）。我國北方地區(qū)秋冬季節(jié)天氣寒冷，低溫嚴重影響了菊花的生長、發(fā)育，其觀賞價值和經(jīng)濟價值也大打折扣，極大地影響菊花的種植和推廣。因此，研究低溫條件下菊花的生理指標變化，對菊花的抗寒育種及栽培應用等均有重要意義（郭彤，2016）?！厩叭搜芯窟M展】菊花的抗寒性一直以來得到學者們的廣泛關注。梁芳等（2010）分析了切花菊品種神馬在低溫弱光、偏低溫弱光、臨界低溫弱光下凈光合速率（Pn）、氣孔限制值（Ls）、最大光化學效率（Fv/Fm）、初始熒光（Fo）的變化及恢復情況。Ren等（2014）指出低溫會導致菊花器官非正常發(fā)育，并進一步影響菊花的生長。王翠麗等（2014）研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可以降低菊花葉片中飽和脂肪酸含量，增加不飽和脂肪酸含量。張嚴瑋等（2014）研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫條件下噴施適當濃度的氨基乙酰丙酸（ALA），可提高抗氧化酶活性，提高質膜透性，增強細胞滲透調節(jié)能力，從而提高切花菊的光合能力和抗寒性。近年來，關于低溫脅迫對菊花光系統(tǒng)、滲透調節(jié)物質和脂肪酸含量的影響已有大量的研究，程祥飛等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，菊花葉片抗氧化酶活性大幅下降，使其緩解活性氧傷害的能力喪失。王蓓（2019）指出低溫脅迫條件下，DgbZIP2基因和DgNF-YA1基因作為正調控因子，可增強菊花的抗寒性。趙鵬飛（2019）研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫使菊花葉片的光合色素含量顯著降低，細胞代謝水平降低，受損程度增大。馬嬌等（2020）指出超聲—低溫破壁處理可最大程度提取和保留野生蔬菜的抗氧化活性，ABTS自由基清除試驗也避免了樣品溶液對DPPH自由基清除測量的光譜干擾。聶林杰等（2020）指出低溫脅迫提高了菊花葉片脂肪酸去飽和酶基因表達量，促使不飽和脂肪酸質量分數(shù)增加，進而維持PSⅡ功能相對穩(wěn)定。楊英楠等（2020）明確了菊花舌狀花抗寒性的遺傳變異，獲得了抗寒性相關分子標記和抗寒材料。苗潤田等（2022）指出低溫脅迫下菊花葉片脂肪酸去飽和酶基因的表達量顯著上調，促進細胞膜和類囊體膜脂不飽和度的增加，維持了膜的穩(wěn)定性，可能在一定程度上緩解了低溫對光系統(tǒng)造成的傷害。【本研究切入點】目前研究大多主要集中在菊花花期調控及優(yōu)良品種的選育方面，針對低溫脅迫方面的研究主要從生理生化方面及分子水平闡述了菊花對低溫脅迫的響應機制，而低溫馴化對菊花抗寒性影響的研究報道相對較少?！緮M解決的關鍵問題】以姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種為試驗材料，比較在不同溫度處理下2種菊花品種葉片生理生化指標的變化，探討低溫馴化對菊花品種抗寒性的影響，為菊花耐寒性種質挖掘以及新品種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年6—8月在河南農(nóng)業(yè)大學試驗基地開展，試驗材料為姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種，由開封市園林菊花研究所提供。所選的材料為當年生扦插苗，以草炭∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1（V∶V∶V）的基質栽植于24孔穴盤中，將材料放置于人工氣候室進行培養(yǎng)，人工氣候室溫度為（25±2）℃，空氣濕度為（50±5）%，光照強度為36±3.6 μmol/（m2·s），光照時長為每天12 h，常規(guī)管理。待株高長至20±2 cm、葉片數(shù)達到13±1枚時，對植株進行相應的低溫處理。磷酸緩沖液、氮藍四唑、核黃素、甲硫氨酸等試劑由湖北鑫鳴泰化學有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計每個品種的幼苗均設置3個不同溫度處理，即對照（CK），常溫25℃；T1處理，低溫馴化，先4℃處理24 h（低溫馴化過程），然后-4℃處理24 h；T2處理，低溫處理，-4℃處理24 h。每個處理重復3次，每個重復50株苗。處理過程中，其他環(huán)境條件不變。選取上部第4~5片長勢健康的功能葉片，將樣品置于錫箔紙中包好并在液氮中快速冷凍，隨后將其放到-80℃超低溫冰箱中貯存待用。受到冷害處理的幼苗其葉片會出現(xiàn)凋零狀態(tài)，無法正常生長，因此試驗中未對其進行生長指標測定。

1.2.2 生理指標測定.葉綠素a（Chlorophyll a，CHLA）、葉綠素b（Chlorophyll b，CHLB）和類胡蘿卜素（Carotenoid，CAR）含量參照李合生（2000）的方法測定，采用80%丙酮提?。怀趸锲缁福⊿OD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性參照王學奎和黃見良（2015）的方法測定。超氧陰離子（）含量參照李忠光和龔明（2005）的方法進行測定；相對電導率（REC）參照郭海林等（2006）的方法測定；過氧化氫（H2O2）含量的測定參照Yin等（2010）的方法進行測定；丙二醛（MDA）含量參照王學奎和黃見良（2015）的方法測定；脯氨酸（Pro）含量參照王乾（2020）的方法測定。

1.2.3 耐冷性綜合評價.采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法計算指標的耐冷性系數(shù)，對品種耐冷性進行綜合評價（王陽等，2017）。如指標與耐冷性呈正相關，則Uij=（Xij-Xjmin）（/Xjmax-Xjmin）；如指標與耐冷性呈負相關，則Uij=1-（Xij-Xjmin）（/Xjmax-Xjmin）。

式中，Uij表示i組j指標耐冷隸屬值，Xij表示i組j指標耐冷性系數(shù)，Xjmax表示i組j指標最大值，Xjmin表示i組j指標最小值。

指標耐冷性系數(shù)（%）=（-4℃處理下平均測定值/對照測定值）×100。系數(shù)越高，代表越耐冷，反之不耐冷。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用單因素方差分析和Duncan’s新復極差法進行。

2 結果與分析

2.1 低溫馴化對菊花葉綠素含量的影響

從表1可知，經(jīng)過低溫馴化后，CHLA、CHLB和CAR的含量在姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種葉片中均表現(xiàn)出下降的趨勢。姹紫嫣紅菊花葉片中CHLA、CHLB和CAR含量在經(jīng)低溫馴化后（T1處理）分別比CK下降18%、24%和14%，且分別比低溫處理（T2處理）增長23%、58%和50%；經(jīng)低溫馴化后金龍騰云品種菊花葉片中CHLA、CHLB和CAR含量與CK相比也同樣下降，分別下降17%、35%和32%，與T2處理相比分別增長38%、54%和50%。在不同處理下，2個菊花品種的CHLA和CAR含量均無顯著差異（P＞0.05，下同）；而對于CHLB含量，2個菊花品種在CK和T1處理下表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05，下同），在T2處理下2個品種則無顯著差異。

表1 低溫馴化對菊花葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effects of cold acclimation on chlorophyll content in chrysanthemum leaves

2.2 低溫馴化對菊花葉片抗氧化酶活性的影響

由圖1可看出，低溫馴化后，姹紫嫣紅葉片SOD活性呈下降趨勢，而金龍騰云葉片SOD活性則表現(xiàn)出上升趨勢。與CK相比，T1處理姹紫嫣紅的葉片SOD活性未表現(xiàn)出顯著差異，T2處理則顯著下降，分別比CK和T1下降12%和8%；金龍騰云葉片SOD活性在T1與T2處理間無顯著差異，但分別比CK顯著上升18%和24%。

圖1 低溫馴化下菊花葉片SOD活性變化Fig.1 Effects of cold acclimation on SOD activity in chrysanthemum leaves

由圖2可看出，2個菊花品種在3個不同溫度處理過程中其葉片POD活性均表現(xiàn)出先下降再上升的變化趨勢。在CK中，2個菊花品種的葉片POD活性均表現(xiàn)出最高值，且品種間差異不顯著；低溫馴化下，2個菊花品種葉片的POD活性均表現(xiàn)出最低值，且姹紫嫣紅的葉片POD活性顯著高于金龍騰云；低溫處理下，姹紫嫣紅的葉片POD活性也顯著高于金龍騰云。

圖2 低溫馴化下菊花葉片POD活性變化Fig.2 Effects of cold acclimation on POD activity in chrysanthemum leaves

由圖3可看出，2個菊花品種在3個不同溫度處理中其葉片CAT活性下降的變化趨勢基本一致，隨著溫度的降低，CAT活性表現(xiàn)出顯著下降的趨勢。與CK相比，T1和T2處理下姹紫嫣紅葉片CAT活性分別降低20%和28%，金龍騰云葉片CAT活性分別降低21%和29%；3組處理下，姹紫嫣紅的葉片CAT活性始終高于金龍騰云，且品種間差異顯著。

圖3 低溫馴化下菊花葉片中CAT活性變化Fig.3 Effects of cold acclimation on CAT activity in chrysanthemum leaves

2.3 低溫馴化對菊花葉片REC的影響

由圖4可知，CK和T1處理下，葉片REC在2品種間均無顯著差異，而在T2處理下，2個菊花品種間呈顯著差異，金龍騰云的葉片REC顯著高于姹紫嫣紅。2個菊花品種的T1處理其葉片REC顯著低于T2處理，表明經(jīng)過低溫馴化能明顯抑制低溫處理下葉片的REC。

圖4 低溫馴化下菊花葉片REC變化Fig.4 Effects of low temperature domestication on relative electrical conductivity in chrysanthemum leaves

2.4 低溫馴化對菊花葉片MDA含量的影響

從圖5可看出，姹紫嫣紅和金龍騰云在3種不同溫度處理下，其葉片MDA含量逐漸增加的變化趨勢基本一致。其中，在CK下，姹紫嫣紅和金龍騰云的葉片MDA含量均表現(xiàn)出最低值，分別為7.86和9.83 nmol/g；在T2處理下，姹紫嫣紅和金龍騰云的葉片MDA含量均表現(xiàn)出最高值，分別為11.24和12.19 nmol/g。隨著溫度的降低，菊花葉片MDA含量表現(xiàn)出了顯著增加趨勢。同時，姹紫嫣紅的葉片MDA含量均表現(xiàn)出顯著低于金龍騰云，表明在低溫馴化下姹紫嫣紅菊花葉片的膜脂過氧化程度相對較低。

圖5 低溫馴化下菊花葉片MDA含量變化Fig.5 Effects of cold acclimation on MDA content in chrysanthemum leaves

2.5 低溫馴化對菊花葉片Pro含量的影響

由圖6可知，隨著冷脅迫的處理，2個菊花品種的葉片Pro含量均大量積累，暗示隨著溫度的降低增加了滲透調節(jié)物質的積累量。其中，CK下金龍騰云的葉片Pro含量比姹紫嫣紅高21.38%，而經(jīng)過T1和T2處理后姹紫嫣紅的葉片Pro含量分別比金龍騰云高24.79%和4.65%，處理間差異均達顯著差異。同時，CK下2個菊花品種葉片Pro含量均表現(xiàn)出最低值，且品種間差異顯著；T2處理下，2個菊花品種葉片Pro含量均表現(xiàn)出最高值，品種間無顯著差異。

圖6 低溫馴化下菊花葉片Pro含量變化Fig.6 Effects of cold acclimation on Pro content in chrysanthemum leaves

2.6 低溫馴化對菊花葉片H2O2及O-2含量的影響

由圖7可看出，2個菊花品種在受到低溫脅迫后，其葉片H2O2含量的變化趨勢基本一致，隨著溫度的降低，葉片H2O2含量均表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。在T1處理下，姹紫嫣紅和金龍騰云的葉片H2O2含量均為最低值，分別為0.33和0.32 μmol/g，且品種間無顯著差異；在T2處理下，2個品種的葉片H2O2含量均表現(xiàn)出最高值，姹紫嫣紅菊花的葉片H2O2含量僅為金龍騰云的28.69%，說明低溫馴化對植株起到一定的保護作用。

圖7 低溫馴化下菊花葉片H2O2含量變化Fig.7 Effects of cold acclimation on H2O2 content in chrysanthemum leaves

由圖8可看出，姹紫嫣紅和金龍騰云在低溫脅迫下，其葉片O-2含量變化趨勢基本一致，隨著溫度的降低，菊花葉片中O-2含量均表現(xiàn)出顯著增加的變化趨勢。其中，在CK下，姹紫嫣紅和金龍騰云的葉片O-2含量均為最低值，在T2處理下，其葉片O-2含量均為最高值。在CK下，姹紫嫣紅的葉片O-2含量顯著低于金龍騰云，而T1和T2處理下姹紫嫣紅的葉片O-2含量則顯著高于金龍騰云，表明姹紫嫣紅菊花品種在經(jīng)過冷處理后產(chǎn)生更多的O-2，使得植株的耐寒性相對較差。

圖8 低溫馴化下菊花葉片O-2含量變化Fig.8 Effects of cold acclimation on O-2 content in chrysanthemum leaves

2.7 菊花生理指標間的相關分析

將2個菊花品種的11個生理指標進行相關分析，結果如表2和表3所示，2個品種的CAR與MDA含量間均達極顯著負相關（P＜0.01，下同）。對于姹紫嫣紅菊花品種，CHLA與Pro含量呈顯著負相關；CHLB含量與CAT活性呈極顯著正相關；CAR含量與REC呈顯著負相關；REC與MDA含量呈極顯著正相關（表2）。

表2 姹紫嫣紅菊花品種葉片生理指標相關分析Table 2 Correlation analysis of physiological indexes of chrysanthemum variety Chazi Yanhong

對于金龍騰云菊花品種，CHLB與CAR含量呈極顯著正相關，與MDA含量呈顯著負相關；SOD與CAT活性呈極顯著負相關；REC與Pro含量呈顯著正相關（表3）。因此，植物受到低溫脅迫后，其生理變化是錯綜復雜的，單一化的指標并不能揭示植物的抗寒性本質。

表3 金龍騰云菊花品種葉片生理指標相關分析Table 3 Correlation analysis of physiological indexes of chrysanthemum variety Jinlong Tengyun

2.8 2個菊花品種耐冷性綜合評價

如果通過單一指標對低溫脅迫下2個菊花品種的耐冷性進行評價，則顯得不夠全面，再加上不同指標值的單位不同，數(shù)值大小和變異程度也不同，因此對耐冷性系數(shù)進行無量綱化處理，消除單一指標的片面性，用隸屬函數(shù)法將各品種的各耐冷指標擴展到［0，1］。姹紫嫣紅和金龍騰云的各項生理指標在不同處理中的耐冷系數(shù)、隸屬函數(shù)值及綜合排名見表4。T1和T2處理下，隸屬值平均得分均為金龍騰云＞姹紫嫣紅。其中，金龍騰云在T2處理下的耐冷性表 現(xiàn) 優(yōu) 于T1處理，其隸屬值為T2（0.54）＞T1（0.48）。姹紫嫣紅在T2處理下的耐冷性表現(xiàn)劣于T1處理，其隸屬值為T2（0.44）＜T1（0.45）。對于姹紫嫣紅菊花品種來言，T1處理更能更加提高其耐冷性，對于金龍騰云而言，則以T2處理的效果更好。

表4 各項指標耐冷系數(shù)、隸屬函數(shù)值及綜合排名Table 4 Cold tolerance coefficient，membership function value and comprehensive ranking of each index

3 討論

當植物受到脅迫時可能會發(fā)生一系列的生理生化反應，一些與脅迫相關的生理生化指標也會發(fā)生相應的改變（魏霞等，2015；曹群陽等，2022）。例如當溫度降到-14℃時，菊花的腳芽均不能恢復生長（許瑛和陳發(fā)棣，2008）。因此，本研究中在冷脅迫處理下，通過測定分析2個菊花品種主要生理指標的變化情況，意在明確低溫馴化對不同品種菊花低溫脅迫的影響；通過試驗，低溫馴化可提高菊花的耐寒性，對比姹紫嫣紅和金龍騰云在相關指標上各有優(yōu)劣，總體表現(xiàn)上金龍騰云＞姹紫嫣紅，其較強的耐寒性對菊花耐寒栽培和擴大種植范圍具有一定的指導作用，但是對于低溫馴化后菊花的植株生長、植株葉片、花期、花色的影響還有待于進一步的研究，尤其是對于秋冬季自然狀態(tài)下的低溫與低溫馴化后影響區(qū)別還需要深入研究。在低溫馴化下葉綠素合成受阻，抑制各種光合酶活性，使得光合速率下降（郁萬文，2008）；自然溫度條件下，姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種葉片CHLA、CHLB和CAR含量的差異并不顯著，而低溫馴化下2個品種葉綠素含量隨著溫度的降低表現(xiàn)出下降趨勢，這與前人的研究結果（趙鵬飛，2019）一致。

植物在正常的生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）量與清除ROS量相平衡；而在低溫馴化下，這種動態(tài)平衡將會被打破，ROS量累積過度會對細胞造成毒害，甚至會造成膜脂過氧化，影響細胞的正常生長發(fā)育（Guo et al.，2012；王凱月等，2022）。有研究表明，SOD可清除O-2，并產(chǎn)生O2和H2O2；CAT能將H2O2轉化為H2O和O-2；而POD不僅能清除H2O2，還與細胞的抗病能力有關（Song et al.，2014；于波，2017）。本研究中，各處理下，姹紫嫣紅的葉片SOD活性均高于金龍騰云，表明姹紫嫣紅本身較金龍騰云有較強的耐寒性；姹紫嫣紅的葉片POD活性也均高于金龍騰云，同時H2O2的清除能力與此表現(xiàn)一致。隨著低溫脅迫程度加劇，2個品種的CAT活性隨著溫度降低呈現(xiàn)出逐漸降低趨勢，且差異顯著。

REC的變化可反映出細胞膜的完整性及細胞受到損傷的程度，而細胞膜的穩(wěn)定性則與植物的抗逆性呈正相關關系；隨著脅迫程度的加深和脅迫時間的持續(xù)延長，不同品種的植物膜相對透性逐漸增大；不同的低溫脅迫對鳳劍1號葉片REC明顯升高（曹群陽等，2022）。本研究中，REC隨著冷脅迫處理的增加而逐漸增加，姹紫嫣紅和金龍騰云2個品種經(jīng)過低溫馴化其葉片REC顯著低于低溫處理，說明低溫馴化降低了菊花細胞質膜受傷害的程度，對菊花具有一定的保護作用。

MDA是一種重要的膜脂過氧化作用產(chǎn)物，其含量用來反映膜的損傷程度。不同大葉女貞品種幼苗葉片處理時間延長，會提升MDA和可溶性糖含量（林艷等，2012）。本研究表明，隨著溫度的降低，姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種的MDA含量則會顯示出一定的升高趨勢，究其原因是由于低溫馴化后細胞膜系統(tǒng)受到一定的傷害；經(jīng)過低溫馴化的MDA含量均明顯低于低溫處理，說明低溫馴化在一定程度上能降低菊花受傷害的程度，進而提高了其對低溫的抵御能力。

Pro是蛋白質的組成成分之一（余瓊芳，2018）。Pro不僅可作為滲透的調節(jié)物質，而且能對膜結構產(chǎn)生保護，防止膜脂發(fā)生過氧化現(xiàn)象，并能提高植物的抗逆性（Hasanuzzaman et al.，2014）。本研究中姹紫嫣紅的葉片Pro含量上升幅度高于金龍騰云，從而可推斷姹紫嫣紅菊花品種由于Pro含量的增加，降低了水勢，使植物體內的水分保持平衡，植物的抗寒性得到了提高。

當植物體在遭受到低溫馴化時，植物體內會產(chǎn)生大量的活性氧，由于活性氧積累量的增加使得氧化脅迫在植物體內發(fā)生，與此同時就會導致植物體受到嚴重的氧化損傷甚至是植株死亡，而活性氧則包括H2O2和O-2等（張騰國等，2019；郭樹勛等，2021）。本研究中姹紫嫣紅和金龍騰云的葉片H2O2和O-2含量均根據(jù)不同溫度處理而有所變化，隨著溫度的降低2個指標均表現(xiàn)出下降的趨勢，說明低溫馴化誘導ROS的積累，為了穩(wěn)定生物膜系統(tǒng)，SOD與POD活性則會有所上升，與前人的研究結果一致（張續(xù)周等，2021；郭揚，2022）。

植物耐低溫脅迫指標種類多樣，而單一化的指標很難真實反映植物的耐低溫性實質。只有通過多指標全方面解讀才能確定植物的耐低溫性，本研究通過對葉綠素含量、抗氧化酶活性、REC、MDA、Pro及ROS等生理指標進行相關分析，結果發(fā)現(xiàn)，植物耐低溫性是受多種因素控制的綜合性狀，不同品種的耐低溫機制可能不同。通過采用隸屬函數(shù)法，對姹紫嫣紅和金龍騰云2個菊花品種進行分析，其中以金龍騰云耐冷性表現(xiàn)較好，且在T2處理下表現(xiàn)最好，反映低溫馴化處理對菊花葉片的損傷小，能起到一定的保護作用。

4 結論

低溫馴化后，2個菊花品種生理特性均優(yōu)于低溫處理，金龍騰云比姹紫嫣紅更耐冷，低溫馴化對菊花葉片的機械損傷能起到一定的保護作用，降低了菊花細胞質膜受傷害的程度，進而提高菊花對低溫的抵御能力。