基于eDNA宏條形碼技術的喀斯特高原人工湖泊魚類多樣性分析

許龍飛，姚鄧雕，楊原偉，郭星辰，李君軼，姜海波，安苗，董響紅，邵儉*

（1貴州大學動物科學學院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2中國水產科學研究院長江水產研究所/農業(yè)農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，湖北武漢 430223）

0 引言

【研究意義】我國以云貴高原為中心的西南地區(qū)喀斯特地貌豐富，是世界三大喀斯特集中分布區(qū)域之一，其中貴州境內61.9%的國土面積為喀斯特地貌（李秋華等，2013；阮玉龍等，2013）。西南喀斯特地區(qū)是我國珍稀物種、瀕危物種、特有物種分布最集中、種類最豐富的地區(qū)之一（王波等，2018）；但喀斯特生態(tài)系統(tǒng)也是典型的脆弱生態(tài)系統(tǒng)，土層淺薄，土壤承載力差，生態(tài)地質環(huán)境脆弱（賀忠權等，2021）。近年來，人工筑壩導致的河道破碎、工農業(yè)污染引起的水體富營養(yǎng)化及不合理引種造成的外來物種生物入侵等，致使我國喀斯特地區(qū)土著魚類種群受到不同程度的脅迫。因此，亟待摸清喀斯特高原魚類群落現(xiàn)狀，為保護西南喀斯特地區(qū)魚類多樣性提供科學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】紅楓湖和阿哈湖是典型的喀斯特高原人工湖泊。紅楓湖位于貴州省清鎮(zhèn)市，是貓?zhí)犹菁壦娬緮r河而成的人工湖泊，屬長江流域烏江水系（曾華獻等，2020）；阿哈湖位于貴州省貴陽市西南郊8 km，流域面積180.3 km2，總庫容0.87億m3，同屬長江流域烏江水系（黃軼婧等，2020）。至今，有關紅楓湖和阿哈湖的研究多圍繞水質評價（郭云等，2015；韓翠紅等，2020；金祖雪等，2020；費志軍等，2021），涉及魚類資源調查的研究較少，對于二者的魚類種群現(xiàn)狀尚不清楚。紅楓湖和阿哈湖作為長江上游重要的生態(tài)屏障，研究其魚類多樣性是維持當?shù)厮鷳B(tài)系統(tǒng)的關鍵，對于維持和補充長江魚類資源同樣具有重要意義（de Paula Gutiérrez and Agudelo，2020；Wang et al.，2021）。環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指生物散落在環(huán)境中的DNA片段，通常來源于生物的皮膚碎屑、配子、黏液及糞便等（Bohmann et al.，2014）。Ogram等（1987）利用eDNA研究土壤沉積物中的微生物，并首次提出eDNA的概念。eDNA宏條形碼技術是利用環(huán)境中的DNA結合高通量測序技術完成對環(huán)境樣本總DNA測序，通過生物信息學分析，以及與公開物種序列數(shù)據(jù)庫進行比對，最終得到環(huán)境樣本中物種組成的技術（Shu et al.，2020；楊海樂等，2021）。目前，eDNA宏條形碼技術已廣泛應用于監(jiān)測魚類空間結構（Zhang et al.，2020）、魚類物種組成與種群豐度（王夢等，2022）及魚類生物入侵現(xiàn)狀（Zhang et al.，2022）等領域。eDNA宏條形碼技術的優(yōu)點包括：（1）不受科研人員的主觀判斷影響；（2）避免了長期的魚類樣本采集，極大提高了物種監(jiān)測效率；（3）eDNA宏條形碼技術不入侵環(huán)境，對監(jiān)測物種及其棲息地幾乎不產生影響（Antognazza et al.，2019；Aglieri et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c】隨著國際動物保護公約、動物福利及生態(tài)生物多樣性保護等法規(guī)措施的執(zhí)行，eDNA宏條形碼技術無疑更符合當下生物多樣性監(jiān)測的需求。【擬解決的關鍵問題】利用eDNA宏條形碼技術探究喀斯特高原人工湖泊魚類多樣性，綜合評估紅楓湖和阿哈湖魚類群落結構及環(huán)境因子對喀斯特高原人工湖泊魚類分布的影響，以期為喀斯特地區(qū)水域魚類多樣性評估提供新方法、新思路，也為紅楓湖和阿哈湖魚類保護管理措施的制定積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣點設置及樣品采集

紅楓湖和阿哈湖樣品采集時間為2021年11月25日，采樣點設置參考SC/T 9402—2010《淡水浮游生物調查技術規(guī)范》，具體如下：紅楓湖分為南湖和北湖，在南、北湖湖心處、湖泊入水口、出水口設置采樣點，結合紅楓湖水域特點，環(huán)湖布置采樣點，南、北湖各設5個采樣點，共計10個采樣點；在阿哈湖湖心處、湖泊入水口、出水口設置采樣點，結合阿哈湖水域特點，環(huán)湖布置采樣點，共計7個采樣點（圖1）。樣品采集全部在船上完成，使用采水器分水體上（1 m）、中（5 m）、下層（10 m）采樣混合后，每個采樣點留取2 L水樣低溫避光保存，送回實驗室立即抽濾，實驗人員操作時每個采樣點更換1次手套。采樣過程記錄采樣點的經緯度，使用黑白盤測定水體透明度（Transparency，Tra），并以YSI便攜式水質儀測定水溫（Water temperature，WT）、總溶解固體（Total dissolved solids，TDS）、鹽度（Salinity，Sal）、pH、溶解氧（Dissolved oxygen，DO）、離子氨（Ionic ammonia，NH4+）等環(huán)境因子（表1）。

表1 eDNA樣品采集點地理位置及其環(huán)境因子Table 1 Geographic locations and environmental factors of eDNA sampling sites

圖1 紅楓湖和阿哈湖采樣點設置分布情況Fig.1 Sampling site distribution of Hongfeng Lake and Aha Lake

1.2 eDNA提取及擴增

使用隔膜真空泵和砂芯玻璃過濾裝置抽濾水樣，選用0.45 μm孔徑的玻璃纖維濾膜。抽濾時操作環(huán)境充分通風，每過濾1份樣品均用1%次氯酸溶液處理實驗操作臺面及過濾裝置，實驗人員更換1次手套。設1個空白對照，使用同樣濾膜抽濾2 L的ddH2O檢測有無環(huán)境污染。抽濾完成后將濾膜置于1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肙MEGA公司的Water DNA Kit D5525試劑盒提取水體eDNA，選用Tele 02硬骨魚類通用引物（Tele 02-F：5'-AAA CTCGTGCCAGCCACC-3'；Tele 02-R：5'-GGGTATC TAATCCCAGT TTG-3'）進行PCR擴增（Taberlet et al.，2018）。對提取的eDNA進行凝膠電泳檢測，質檢合格的樣本上機測序，測序平臺為Illumina NovaSeq 6000。

1.3 測序及生物信息學分析

設10 bp的窗口，若窗口內平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的序列（Trimmomatic v0.3），根據(jù)雙端測序的overlap關系，將成對序列拼接成1條序列，最小overlap長度為10 bp，overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩除不符合序列（FLASH v1.2.7），按照標簽和引物序列進行拆分并調整序列方向，得到每個樣本的優(yōu)質序列。對優(yōu)質序列按照98%相似性進行OTU聚類（Zhang et al.，2020），在聚類過程中去除嵌合體，生成OTUs表格（perl v5.18.2，Usearch v10，qiime v1.9.1）。將生成的OTUs表格在基于NCBI網站nt數(shù)據(jù)庫自建的淡水魚類數(shù)據(jù)庫中進行物種基因注釋（建庫時間2021年10月），得到魚類物種信息，魚類分類依據(jù)參考Fishbase數(shù)據(jù)庫。

1.4 魚類多樣性數(shù)據(jù)處理分析

為確保鑒定結果更準確，對鑒定結果進行如下校正：（1）將低豐度序列（序列樣本平均讀數(shù)低于1）訂正為未識別；（2）將鑒定到的雜交種進行校正，若雜交種父母本隸屬于同屬魚類A屬，則將該雜交種訂正為Asp.，否則將該雜交種序列訂正為未識別。使用Excle 2020分析含魚類物種信息注釋的OTUs表格，并繪制物種組成餅圖；基于魚類代表OTUs序列讀數(shù)，繪制屬分類水平魚類分布熱圖，為消除數(shù)據(jù)差異過大對熱圖的影響，先將序列讀數(shù)進行均一化處理，再使用R語言繪制熱圖。同時，使用R語言進行PerMANOVA分析，明確紅楓湖南、北湖魚類群落結構差異性；利用R語言vegan包進行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），將魚類代表OTUs序列讀數(shù)進行Hellinger轉化，環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行均一化以消除量綱影響，RDA分析前需對環(huán)境因子進行共線性分析，剔除方差膨脹因子過大的環(huán)境因子。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物質量檢測結果

紅楓湖10個eDNA樣本和阿哈湖7個eDNA樣本的PCR擴增產物質量檢測目的條帶大小正確，均滿足測序條件，而空白對照組無任何條帶，說明試驗過程中無污染。

2.2 高通量測序結果

紅楓湖10個eDNA樣本的物種累積曲線如圖2-A所示，隨著測序深度的增加，觀測到的OTUs數(shù)量趨于穩(wěn)定，說明eDNA樣本數(shù)量足以代表紅楓湖魚類多樣性。阿哈湖7個eDNA樣本的物種累積曲線如圖2-B所示，隨著樣本數(shù)量的增加，觀測到的OTUs數(shù)量趨于穩(wěn)定，也說明eDNA樣本數(shù)量足以反映阿哈湖魚類多樣性。

圖2 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）的eDNA樣本物種累積曲線Fig.2 Cumulative curve of species of eDNA samples from Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

2.3 魚類基因注釋結果

經人工校正后，在紅楓湖鑒定出魚類32種，隸屬于5目11科27屬，有2種 魚 類 鑒 定 到 屬［鱖 屬（Siniperca）］，有11種魚類在歷史數(shù)據(jù)庫中得到匹配（表2）。其中，鯉形目（Cypriniformes）魚類18種，鲇形目（Siluriformes）魚類5種，日鱸目（Centrarchiformes）魚類5種，胡瓜魚目（Osmeriformes）魚類2種，鰕虎魚目（Gobiiformes）魚類2種（圖3-A）。在阿哈湖鑒定到魚類33種，隸屬于6目12科28屬，有3種魚類鑒定到屬（表2）。其中，鯉形目魚類18種，鲇形目魚類5種，日鱸目魚類5種，胡瓜魚目魚類2種，鰕虎魚目魚類2種，攀鱸目（Anabantiformes）魚類1種（圖3-B）。

圖3 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）的魚類物種組成結構Fig.3 Fish species composition of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

表2 基于eDNA宏條形碼技術在紅楓湖和阿哈湖各采樣點的魚類檢出情況Table 2 Detection of fish from each sampling site in Hongfeng Lake and Aha Lake based on eDNA metabarcoding technology

在屬分類水平上，紅楓湖魚類在各采樣點的分布情況如圖4顯示。紅楓湖魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名前10的分別是鱯屬（Hemibagrus）、鯉屬（Cyprinus）、鱖屬、黃顙魚屬（Tachysurus）、鰱屬（Hypophthalmichthys）、屬（Hemiculter）、新銀魚屬（Neosalanx）、草魚屬（Ctenopharyngodon）、青魚屬（Mylopharyngodon）和特鯰屬（Tatia）。阿哈湖屬分類水平魚類在各采樣點的分布情況如圖5所示，阿哈湖魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名前10的分別是鰱屬、鱯屬、鱖屬、鯉屬、黃顙魚屬、屬、新銀魚屬、草魚屬、吻鰕虎魚屬（Rhinogobius）和鳑鲏屬（Rhodeus）。

圖4 基于紅楓湖各采樣點魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)的魚類分布熱圖Fig.4 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Hongfeng Lake

圖5 基于阿哈湖各采樣點魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)的魚類分布熱圖Fig.5 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Aha Lake

2.4 紅楓湖和阿哈湖魚類多樣性

紅楓湖各采樣點魚類的Chao1指數(shù)顯示，在H6采樣點觀察到的OTUs數(shù)量最低（1205.08），在H10采樣點觀察到的OTUs數(shù)量最高（1434.26）；在Shannon指數(shù)方面，H7采樣點群落多樣性最高，H9采樣點群落多樣性最低；Simpson指數(shù)的變化趨勢與Shannon指數(shù)一致（表3）。在監(jiān)測到的32種魚類中，有27種魚類在所有采樣點均能監(jiān)測到，紅楓湖全部采樣點均無特有魚類，各采樣點檢出魚類總數(shù)差異不明顯，保持在28~30種。紅楓湖南湖監(jiān)測到32種魚類，其中2種為南湖獨有魚類；北湖監(jiān)測到30種魚類，無北湖獨有魚類（表2）。PerMANOVA分析結果顯示，紅楓湖南、北湖魚類群落結構差異不顯著（R2=0.08，P=0.562＞0.05）。

表3 紅楓湖魚類α多樣性指數(shù)Table 3 α diversity index of fish in Hongfeng Lake

阿哈湖各采樣點魚類的Chao1指數(shù)顯示，在A7采樣點觀察到的OTUs數(shù)量最低（1051.95），在A5采樣點觀察到的OTUs數(shù)量最高（1435.24）；在Shannon指數(shù)方面，A5采樣點群落多樣性最高，A3采樣點群落多樣性最低；Simpson指數(shù)則顯示以A6采樣點群落多樣性最高、A3采樣點群落多樣性最低（表4）。在監(jiān)測到的33種魚類，有26種魚類在所有采樣點中均能監(jiān)測到，阿哈湖全部采樣點均無獨有魚類，各采樣點檢出魚類總數(shù)差異不明顯，保持在28~32種（表2）。

表4 阿哈湖魚類α多樣性指數(shù)Table 4 α diversity index of fish in Aha Lake

2.5 魚類多樣性與環(huán)境因子的相關性

對紅楓湖魚類多樣性與環(huán)境因子進行RDA分析前，在共線性分析中剔除了Tra和Sal 2個環(huán)境因子，剩余5個環(huán)境因子（表5）對引起紅楓湖各采樣點魚類群落結構差異的解釋度為69.38%。RDA分析結果（圖6-A）顯示，紅楓湖各采樣點分布較散，無聚集趨勢。在RDA1軸上，WT呈正相關，其余環(huán)境因子呈負相關；在RDA2軸上，pH、DO和NH4+呈正相關，其余環(huán)境因子呈負相關。對阿哈湖魚類多樣性與環(huán)境因子進行RDA分析前，在共線性分析中剔除了Sal和pH 2個環(huán)境因子，剩余5個環(huán)境因子（表5）對引起阿哈湖各采樣點魚類群落結構差異的解釋度為68.74%。RDA分析結果（圖6-B）顯示，阿哈湖各采樣點分布較散，也無聚集趨勢，其中A3、A5采樣點與其余采樣點距離較遠，說明這2個采樣點與其余采樣點魚類群落相似度更低。在RDA1軸上，NH4+、DO和WT呈正相關，其余環(huán)境因子呈負相關；在RDA2軸上，5個環(huán)境因子均呈正相關。

圖6 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）魚類多樣性與環(huán)境因子的RDA分析結果Fig.6 RDA results of fish diversity and environmental factors of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

表5 RDA分析中各環(huán)境因子的決定系數(shù)及其相關性Table 5 Determination coefficients and correlation of each environmental factor in RDA

3 討論

3.1 紅楓湖和阿哈湖魚類組成

本研究在紅楓湖設10個采樣點，通過eDNA宏條形碼技術共監(jiān)測到32種魚類，其中有11種魚類在歷史數(shù)據(jù)庫（牟洪民等，2012）中得到驗證。紅楓湖有21種魚類沒有在歷史數(shù)據(jù)庫中得到驗證，主要是由于歷史數(shù)據(jù)庫為2010—2011年采集樣本，對于目前紅楓湖現(xiàn)有魚類群落組成尚不清楚，說明選取的歷史數(shù)據(jù)庫不能完全代表紅楓湖現(xiàn)階段魚類群落結構。此外，利用公用魚類線粒體12S序列文庫進行物種信息注釋可能會對個別親緣近的物種出現(xiàn)偏差（Lamy et al.，2021；de Santana et al.，2021）。本研究監(jiān)測到鰱（H.molitrix）、鳙（H.nobilis）（H.leucisculus）、南方馬口魚（O.uncirostris）、棒花魚（A.rivularis）、鯉（C.carpio）、草魚（C.idella）等紅楓湖歷史優(yōu)勢魚類，但1982和2010年2次紅楓湖魚類資源調查中監(jiān)測到的紅鰭鲌（Culter erythropterus）、長春鳊（Parabramis pekinensis）、三 角 魴（Magalobrama tarminalis）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、黃鱔（Monopterus albus）等魚類（牟洪民等，2012）在本研究中均未監(jiān)測到，說明這些魚類種群極度萎縮或已消失。本研究在紅楓湖監(jiān)測到鯉形目魚類18種（占56.25%），還包括日鱸目大口黑鱸（M.salmoides）、中國少鱗鱖（C.whiteheadi）、鱖（S.chuatsi）及鱖屬（Sinipercasp.）未定種魚類2種，胡瓜魚目太湖新銀魚（N.taihuensis）、中國大銀魚（P.chinensis），鲇形目斑鱯（H.guttatus）、南方鯰（S.meridionalis）等常見非紅楓湖土著經濟養(yǎng)殖魚類。阿哈湖并無傳統(tǒng)的魚類資源調查數(shù)據(jù)作為歷史數(shù)據(jù)庫，本研究在阿哈湖監(jiān)測到鯉形目魚類18種（占54.55%），另有鱧屬未定種魚類1種，日鱸目大口黑鱸、中國少鱗鱖、鱖及鱖屬未定種魚類2種，胡瓜魚目太湖新銀魚、中國大銀魚，鲇形目斑鱯、南方鯰等常見經濟養(yǎng)殖魚類?？梢姡F(xiàn)階段的紅楓湖和阿哈湖魚類組成以鯉形目魚類為主，但存在以日鱸目為主的養(yǎng)殖魚類生態(tài)入侵。

3.2 高通量測序序列讀數(shù)與魚類種群豐度的關系

本研究結果顯示，在OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名中，紅楓湖魚類以鱯屬排名第一、特鯰屬排名第十，阿哈湖魚類以鱯屬排名第一、黃顙魚屬排名第五、特鯰屬排名第十三。鱯屬僅監(jiān)測到斑鱯1種魚類，斑鱯隸屬于鲇形目鲿科（Bagridae），俗稱芝麻劍，是我國傳統(tǒng)的名貴養(yǎng)殖魚類，主要分布在錢塘江、九龍江和珠江等水系（劉偉，2016），而紅楓湖和阿哈湖屬于長江水系。在紅楓湖監(jiān)測到斑鱯eDNA信號可能是由于2021年更新的《國家重點保護野生動物名錄》將斑鱯野生種群列為國家二級保護動物（養(yǎng)殖群體除外），貴州多地開展斑鱯人工繁育及養(yǎng)殖所造成，但斑鱯是否成為紅楓湖和阿哈湖魚類的優(yōu)勢種尚有待進一步考證。黃顙魚隸屬于鲇形目鲿科，在我國長江、黃河及珠江等各大水系均有分布，是常見的經濟養(yǎng)殖魚類（王凌宇等，2020）。有研究表明，大壩的建成通常導致原有江段魚類多樣性下降，繁殖魚類群落結構趨于單一，其中條等小型魚類等易成為優(yōu)勢種（李世健等，2011；常濤等，2021），但鮮見黃顙魚成為優(yōu)勢種的報道。特鯰屬魚類監(jiān)測到中間特鯰（T.intermedia），中間特鯰隸屬于鲇形目頸鰭鯰科（Auchenipteridae），俗名為銀河豹鯨，在南美洲廣泛分布（Pereira et al.，2017），F(xiàn)ishbase數(shù)據(jù)庫標記我國無分布，但在公開網絡上可檢索到國內已將其作為觀賞魚進行人工繁育的記錄。故推測中間特鯰是因遺棄、放生等方式進入我國自然水域，但其為熱帶魚類，紅楓湖和阿哈湖的環(huán)境并不利于中間特鯰發(fā)展成為優(yōu)勢種。

既往研究顯示，序列豐度讀數(shù)和生物量存在一定的相關性（Kelly et al.，2014；Evans et al.，2016）。陳世靜（2020）研究表明，在魚類組成相對簡單的水族箱中，魚類生物量與序列讀數(shù)呈正相關。在PCR擴增過程中，通用引物對水環(huán)境中不同物種的擴增效率也不同，是由于通用引物對個別物種存在擴增偏好性，而導致個別物種序列讀數(shù)產生數(shù)量級差異（Elbrecht and Leese，2015；Pi?ol et al.，2015）。因此，黃顙魚屬、鱯屬、特鯰屬魚類代表OTUs序列讀數(shù)較高，也有可能是通用引物的擴增偏好性所造成。

3.3 紅楓湖和阿哈湖魚類多樣性與環(huán)境因子的關系

紅楓湖環(huán)境因子與魚類群落結構差異的決定系數(shù)（R2）排序為DO＞TDS=WT＞pH＞NH4+。DO（P=0.034）是引起紅楓湖各采樣點魚類群落結構差異的主要環(huán)境因子。DO是影響魚類生存最重要的環(huán)境因子，當水體DO在2.0~3.0 mg/L時會影響魚類攝食等生命活動，而DO高于5.0 mg/L時魚類攝食生長完全正常（申玉春，2008）。本研究的采樣均在日出時間，紅楓湖各采樣點水體DO在6.3~10.5 mg/L，可能是由于日出時間湖中生產者正在進行光合作用，因此水體DO均高于5.0 mg/L；在日落時間因光合作用停止，紅楓湖部分區(qū)域水體DO降至5.0 mg/L以下，致使DO成為紅楓湖魚類群落分布的主要制約因子。阿哈湖環(huán)境因子與魚類群落結構差異的決定系數(shù)（R2）排序為TDS＞WT＞Tra＞NH4+＞DO。TDS（P=0.005）是引起阿哈湖各采樣點魚類群落結構差異的主要環(huán)境因子。據(jù)李美霞（2021）的研究顯示，TDS和浮游植物群落呈顯著正相關。本研究中，阿哈湖以鰱和鳙的OTUs序列豐度最高，且二者都是以浮游生物為主要食物來源的濾食性魚類。這可能也是TDS成為引起阿哈湖各樣點魚類群落結構差異主要環(huán)境因子的原因。

4 結論

現(xiàn)階段的紅楓湖和阿哈湖魚類組成以鯉形目魚類為主，但存在以日鱸目為主的養(yǎng)殖魚類生態(tài)入侵。eDNA宏條形碼技術在喀斯特高原水域魚類多樣性評估方面具有較好的適應性，可快速監(jiān)測到魚類群落結構和空間分布情況，但通用引物可能對某些魚類存在擴增偏好性；此外，不同人工湖泊水質理化因子特異性較強，研究環(huán)境因子與湖泊魚類群落的關系時應對每個湖泊單獨進行評估。