JMJD6與Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)性☆

曹恩棟 呂志異 蔡海平 鄭建濤 楊勇 張緒超 周德祥

惡性膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)特性是活躍增殖和侵襲性生長(zhǎng)，手術(shù)治療無(wú)法做到病理學(xué)全切除，經(jīng)綜合治療后仍容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不良，研究與膠質(zhì)瘤增殖與侵襲有關(guān)的基因具有重要研究意義。包含Jumonji C結(jié)構(gòu)域蛋白6（Jumonji C-domain containing protein 6, JMJD6）是JmjC家族成員，具有組蛋白精氨酸去甲基化酶和賴(lài)氨酸羥基化酶活性，與腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為有關(guān)[1-3]。既往研究表明JMJD6具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲的作用，抑制JMJD6可延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的生存期及改善預(yù)后[4]，但JMJD6在不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤之間表達(dá)的差異及其相關(guān)性如何還有待研究。Ki67是一種存在于增殖細(xì)胞核中，與細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原，是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物，Ki67的表達(dá)程度隨著膠質(zhì)瘤惡性度的增高而升高，與膠質(zhì)瘤病例級(jí)別呈正相關(guān)[5-6]。本研究旨在探討JMJD6與Ki67在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析JMJD6與Ki67和病理級(jí)別三者的相互相關(guān)性，為JMJD6成為膠質(zhì)瘤潛在靶點(diǎn)和抑制膠質(zhì)瘤增殖方面的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 從2018至2020年我科收治的膠質(zhì)瘤患者中，按病理級(jí)別及各級(jí)別發(fā)病率隨機(jī)抽取46例，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)每個(gè)級(jí)別10例，Ⅳ級(jí)16例，去除Ⅱ級(jí)和Ⅳ級(jí)掉片各2例，列入最后統(tǒng)計(jì)共42例，其中，Ⅰ級(jí)10例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)10例、Ⅳ級(jí)14例（按膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)2016版），按病理級(jí)別分為四個(gè)組：Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組和Ⅳ級(jí)組。病理診斷及例數(shù)分布：毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤10例，毛粘液型星形細(xì)胞瘤1例，彌漫型星形細(xì)胞瘤4例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例，多形性黃色星形細(xì)胞瘤1例，間變星形細(xì)胞瘤2例，間變多形性黃色星形細(xì)胞瘤2例，間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤6例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤14例。材料和試劑：兔抗人JMJD6單克隆抗體（購(gòu)于廣州碩恒生物科技有限公司）、兔抗人單克隆抗體 Ki67、SP 試劑盒及 DAB 顯色試劑盒均來(lái)自廣州捷威斯生物科技有限公司。

1.2 膠質(zhì)瘤組織中JMJD6與Ki67蛋白檢測(cè) 免疫組化染色均采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（Streptavidin-Perosidase，SP）法，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切取3張4μm厚切片，常規(guī)脫臘至水。采用SP二步法進(jìn)行免疫組化染色，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，微波修復(fù)抗原，以PBS代替一抗染色作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化染色定性、定量判斷 JMJD6蛋白的定性分析：JMJD6蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)黃染為陰性表達(dá)，淡黃色為弱陽(yáng)性表達(dá)，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。JMJD6檢測(cè)結(jié)果按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比評(píng)分分為5級(jí)：≤5%為0分；＞5%～25%為1分；＞25%～≤50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75% 4分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分分為4級(jí)：陰性為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分×細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分=染色指數(shù)積分。分析數(shù)據(jù)時(shí)，染色指數(shù)積分 0分為-，1～4分+，5～8分++，9～12分+++[1]。JMJD6的定量表達(dá)用染色指數(shù)積分表示。Ki67蛋白的定性分析：Ki67蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞核內(nèi)，核內(nèi)呈淡黃色為弱陽(yáng)性表達(dá)，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例：15%以下為+，15%～30%++，30%以上為+++。Ki67蛋白的定量分析：高倍鏡（×400）下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)算其陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，取均值作為該例患者的Ki67定量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 25.0及 GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)分析。腫瘤組織中JMJD6、Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率采用單因素χ2檢驗(yàn)；JMJD6、Ki67蛋白表達(dá)水平采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；JMJD6、Ki67與病理級(jí)別的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，關(guān)聯(lián)系數(shù)以rs表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 JMJD6與Ki67在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的定性表達(dá) JMJD6在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)因病理級(jí)別的不同而異，Ⅰ級(jí)呈陰性或弱陽(yáng)性，未見(jiàn)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；Ⅱ級(jí)的表達(dá)較多樣性，陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性均可見(jiàn)；Ⅲ級(jí)以陽(yáng)性為主，少數(shù)弱陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性；Ⅳ級(jí)以陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主，弱陽(yáng)性極少（圖1，表1）；Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)也與病理級(jí)別有關(guān)，Ⅰ級(jí)以弱陽(yáng)性為主；Ⅱ級(jí)大多數(shù)弱陽(yáng)性，少數(shù)為陽(yáng)性；Ⅲ級(jí)以陽(yáng)性為主，部分強(qiáng)陽(yáng)性，極少弱陽(yáng)性；Ⅳ級(jí)以強(qiáng)陽(yáng)性為主，少數(shù)為陽(yáng)性；JMJD6和Ki67的陽(yáng)性強(qiáng)度均隨著病理級(jí)別的升高而增高（JMJD6：χ2=30.875，P＜0.001；Ki67：χ2=35.292，P＜0.001）（圖2，表1）。

表1 JMJD6在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異

圖1 各級(jí)別膠質(zhì)瘤中JMJD6的定性表達(dá) A，Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中常見(jiàn)JMJD6呈陰性表達(dá)（×400）；B，Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中多見(jiàn)JMJD6呈弱陽(yáng)性表達(dá)（×400）；C，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中多見(jiàn)JMJD6呈陽(yáng)性表達(dá)（×400）；D，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中多見(jiàn)JMJD6呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（×400）。

圖2 Ki67在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的定性表達(dá)×400 A，Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤常見(jiàn)Ki67呈（+）；B，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中多見(jiàn)Ki67呈（++）；C，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中多見(jiàn)Ki67呈（+++）。

2.2 JMJD6與Ki67在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的定量分析 JMJD6與Ki67的表達(dá)水平不滿足正態(tài)性和方差齊性，JMJD6表達(dá)的中位數(shù)為Ⅰ級(jí)0.05，Ⅱ級(jí)4.50，Ⅲ級(jí)7.50，Ⅳ級(jí)8.00，JMJD6的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而升高，級(jí)別間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=25.397，P＜0.001）（圖 3，表 2）。Ki67表達(dá)的中位數(shù)為Ⅰ級(jí)0.010，Ⅱ級(jí)0.050，Ⅲ級(jí)0.325，Ⅳ級(jí)0.550，Ki67的表達(dá)水平也隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而升高，級(jí)別間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=30.804，P＜0.001）（圖4，表2）。

表2 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤JMJD6、Ki67的表達(dá)水平的差異

2.3 JMJD6和Ki67與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相互相關(guān)性分析 JMJD6的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別間呈正相關(guān)（r=0.782，P＜0.001）（圖3）；Ki67的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別間呈正相關(guān)（r=0.852，P＜0.001）（圖4）；膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67的表達(dá)水平也呈正相關(guān)（r=0.709，P＜0.001）（圖5）。

圖3 各級(jí)別膠質(zhì)瘤中JMJD6的表達(dá)水平（中位數(shù)）的趨勢(shì) JMJD6的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別間呈正相關(guān)（r=0.782，P ＜0.001）。

圖4 各級(jí)別膠質(zhì)瘤中Ki67表達(dá)水平（中位數(shù)）的趨勢(shì)及差異Ki67的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別間呈正相關(guān)（r=0.852，P＜0.001）。

圖5 膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67表達(dá)的相關(guān)性分析 膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.709，P＜0.001）。

3 討論

JMJD6是一個(gè)具有賴(lài)氨酸羥化酶活性和酪氨酸激酶活性雙重作用的加氧酶，既發(fā)揮催化賴(lài)氨酸的羥基化和精氨酸組蛋白與非組蛋白多肽的乙基化作用[1-2]，也起內(nèi)在的酪氨酸激酶活性作用[3]。JMJD6作為一個(gè)癌基因，與許多惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為有關(guān)[7-10]。JMJD6參與膠質(zhì)瘤的形成[4]，且與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖與侵襲有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，JMJD6在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別密切相關(guān)，雖然可以表現(xiàn)為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。但是，隨著病理級(jí)別的遞增，JMJD6的表達(dá)水平也呈逐漸升高趨勢(shì)，在各級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)不全相同，JMJD6的表達(dá)水平與病理級(jí)別相關(guān)性分析結(jié)果也提示兩者存在正相關(guān)。上述兩方面研究結(jié)果均說(shuō)明JMJD6與膠質(zhì)瘤的病理性質(zhì)即惡性程度密切相關(guān)。由此，可預(yù)測(cè)JMJD6與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后可能存在相關(guān)性，這值得我們下一步進(jìn)一步深入探討。當(dāng)然，我們也發(fā)現(xiàn)在Ⅱ級(jí)別膠質(zhì)瘤中JMJD6的表達(dá)呈現(xiàn)多樣，陰性表達(dá)、低表達(dá)及高表達(dá)均可見(jiàn)，有可能是Ⅱ級(jí)別入組例數(shù)少，存在誤差，也可能是以前病理級(jí)別分型采用上一個(gè)舊版本分級(jí)，該舊版本中有少數(shù)Ⅱ級(jí)別膠質(zhì)瘤，如進(jìn)一步檢查H3K27M（+），則在2021年新版本分型中歸入Ⅳ級(jí)，因此，也可能產(chǎn)生誤差。本研究為回顧性分析，無(wú)法采用最新版本分級(jí)，是本研究的不足之處。

既往研究表明JMJD6與肺癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12-13]。抑制JMJD6可抑制惡性腫瘤的增殖與侵襲[14]；且抑制JMJD6可提高腫瘤動(dòng)物模型的生存時(shí)間[15]。較多證據(jù)提示JMJD6有可能成為惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[16-17]。也有研究提示JMJD6與膠質(zhì)瘤的形成有關(guān)[4]，且可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖與侵襲[11]，由于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、放化療耐藥、增殖、侵襲等行為的重要原因之一。因此，抑制JMJD6可能起抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用，從而抑制膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)、增殖生長(zhǎng)、侵襲等惡性行為。因此，JMJD6除了可預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性程度及增殖指數(shù)外，暗示其可能是個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，這值得下一步深入研究。

Ki67是一種存在于細(xì)胞核，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白。Ki67的表達(dá)反映細(xì)胞核增殖活性，自細(xì)胞進(jìn)入G1期開(kāi)始表達(dá)，在G2、M期表達(dá)最強(qiáng)，G0期不表達(dá)。目前，成為檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)的指標(biāo)。作為評(píng)價(jià)增殖細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)記物[18]，主要用于判斷腫瘤細(xì)胞的增殖活性，Ki67的陽(yáng)性率越高，說(shuō)明處于增殖周期的細(xì)胞比例越高，腫瘤生長(zhǎng)越快；一般來(lái)說(shuō)，Ki67的陽(yáng)性率越高，其預(yù)后越差[19]。

本研究結(jié)果表明，Ki67的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高而升高，在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈現(xiàn)不全相同，Ki67的表達(dá)水平與病理級(jí)別進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果也顯示兩者呈正相關(guān)。兩個(gè)研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果是一致的[18]，可以認(rèn)為，Ki67能夠作為膠質(zhì)瘤組織病理分級(jí)及預(yù)測(cè)預(yù)后的客觀指標(biāo)。

JMJD6與Ki67這兩個(gè)與增殖有關(guān)的標(biāo)記物，兩者的表達(dá)水平均隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高而升高，兩者與病理級(jí)別均呈顯著正相關(guān)。在進(jìn)一步對(duì)JMJD6與Ki67兩者的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析顯示兩者的表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明JMJD6和Ki67在促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性增殖方面可能存在相互作用關(guān)系或協(xié)同作用關(guān)系；再次提示兩者均可能是膠質(zhì)瘤病理分級(jí)和預(yù)測(cè)預(yù)后的客觀指標(biāo)。

本研究?jī)H探討JMJD6和Ki67在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及三者的相互相關(guān)性，但未闡明JMJD6和Ki67對(duì)膠質(zhì)瘤增殖情況的影響及JMJD6和Ki67對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系，這是本研究的不足之處，我們將在以后的研究中進(jìn)一步深入探討。