毛霉目病原真菌的實(shí)驗(yàn)室鑒定及體外抗真菌藥物敏感性分析

袁凱旋，葉靜如，祿夢(mèng)笛，陳卓曦，凌勇，黃愛偉，劉素玲，顧兵

(1.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州 510080；2.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 523808)

毛霉病(mucormycosis)是由毛霉目(Mucorales)病原真菌引起的侵襲性真菌感染，主要侵犯免疫受損患者，可引起局限性和播散性感染。近年來，隨著各種激素、抗菌藥物、化療藥物及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，毛霉病發(fā)病率整體呈上升趨勢(shì)，該病的全因死亡率為40%～80%[1]。毛霉病早期臨床表現(xiàn)與影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，臨床診斷困難，進(jìn)展迅速。因此，實(shí)現(xiàn)毛霉病的早期快速診斷尤為重要。然而，基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對(duì)毛霉目真菌進(jìn)行鑒定的要求較高，部分種屬形態(tài)特點(diǎn)高度相似，且為常見的環(huán)境污染真菌，需結(jié)合直接鏡檢標(biāo)本和組織病理切片進(jìn)行判斷，但鏡檢敏感性較低，病理切片對(duì)毛霉菌絲難以區(qū)分。再者，毛霉目對(duì)兩性霉素B存在較明顯的種間和種內(nèi)差異[2]，對(duì)泊沙康唑存在較明顯的種內(nèi)差異[3]，因此對(duì)于毛霉目真菌感染，不論何種菌屬都統(tǒng)一推薦兩性霉素B或泊沙康唑作為經(jīng)驗(yàn)治療首選藥物，可能會(huì)導(dǎo)致治療失敗。

國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)毛霉目真菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平和開展抗真菌體外藥敏試驗(yàn)?zāi)芰τ邢?，相關(guān)藥敏研究數(shù)據(jù)較少?；谝陨犀F(xiàn)狀，本研究以分子測(cè)序結(jié)果為參考，評(píng)估臨床標(biāo)本鏡檢、菌落形態(tài)學(xué)鑒定和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)對(duì)毛霉目真菌的鑒定能力，分析其對(duì)兩性霉素B、泊沙康唑的體外藥敏特點(diǎn)，為毛霉病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程提供思路，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種來源 回顧性分析2018年1月—2022年2月在廣東省人民醫(yī)院住院確診或臨床診斷為毛霉病的患者25例，所有患者培養(yǎng)結(jié)果均為陽性。陽性標(biāo)本包括創(chuàng)面分泌物(10例，40%)、肺泡灌洗液(8例，32%)、纖支鏡沖洗液(4例，16%)、肺穿刺組織(2例，8%)、糞便(1例，4%)。病例確診、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)遵循2021年歐洲醫(yī)學(xué)真菌學(xué)聯(lián)合會(huì)(European Confederation of Medical Mycology，ECMM)與真菌病研究小組教育與研究聯(lián)合會(huì)(Mycoses Study Group Education & Research Consortium, MSGERC)聯(lián)合發(fā)布的侵襲性真菌病指南[4]。

1.2主要儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)，Vitek MS質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)，UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國FORMA公司)；一次性靶板、基質(zhì)液、甲酸(法國生物梅里埃公司)，大腸埃希菌ATCC 8739(美國菌種保存中心)，乙腈(天津科密歐公司)，SDA平板(江門凱林貿(mào)易有限公司)，Ezup柱式真菌基因DNA抽提試劑盒、通用引物ITS1和ITS4、Taq PCR Master Mix(上海生工生物公司)，兩性霉素B(合肥博美生物公司)，泊沙康唑(廣州億源生物公司)。

1.3形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1直接鏡檢 25例標(biāo)本均采用革蘭染色法和10%氫氧化鉀(KOH)濕片法[5]鏡檢。對(duì)于肺泡灌洗液或纖支鏡沖洗液，取沉淀物涂片于載玻片上；對(duì)于創(chuàng)面分泌物或糞便，將運(yùn)送拭子涂抹于載玻片中間；對(duì)于組織標(biāo)本，以無菌剪刀剪碎，置于蓋玻片上。每份標(biāo)本制片2張，1張進(jìn)行革蘭染色，另外1張行10% KOH濕片法鏡檢。

1.3.2形態(tài)鑒定 將菌株復(fù)蘇于SDA平板，于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，采用透明膠帶法[5]觀察菌絲及孢子形態(tài)特征。根據(jù)菌落和鏡下特點(diǎn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4菌株復(fù)核 根據(jù)Ezup柱式真菌DNA抽提試劑盒說明書提取DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應(yīng)總體積為50 μL，包括Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板5 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物公司完成測(cè)序，測(cè)序儀型號(hào)為ABI 3730XL。使用Chromas 2軟件分析結(jié)果，并使用ContigExpress軟件將兩端序列進(jìn)行拼接和手動(dòng)矯正后，在NCBI和MYCOBANK數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對(duì)，種、屬信息鑒定原則參照文獻(xiàn)[6]。

1.5質(zhì)譜鑒定 磁珠研磨法：在法國生物梅里埃公司提供的方案上予以改良，使用潮濕的拭子收集孢子和菌絲，將其懸于含900 μL 70%乙醇的預(yù)裝提取管中滅活10 min，置于垂直震蕩器研磨15 min后將菌懸液轉(zhuǎn)移至2 mL無菌EP管中，(10 000～14 000)×g離心2 min，棄上清液，待乙醇完全揮發(fā)后加入40 μL新鮮配制的70%甲酸渦旋震蕩混勻，加入40 μL乙腈渦旋震蕩混勻，(10 000～14 000)×g離心2 min。取1 μL上清液點(diǎn)靶2次，干燥后覆以1 μL基質(zhì)液，待其形成結(jié)晶后進(jìn)行檢測(cè)。采用IVD數(shù)據(jù)庫(v3.2)和RUO數(shù)據(jù)庫(v4.17)進(jìn)行判斷，其中IVD數(shù)據(jù)庫包含真菌221種，RUO數(shù)據(jù)庫包含真菌518種。每株菌株重復(fù)檢測(cè)2次，若第一次無鑒定結(jié)果，則按照上述流程二次檢測(cè)，若仍無結(jié)果，則認(rèn)為鑒定失敗。

1.6微量肉湯稀釋法 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2文件[7]操作。將25株受試菌接種于SDA上，置28 ℃培養(yǎng)3～5 d后用8.5 g/L生理鹽水收集孢子，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度為(0.2～2.5)×105CFU/mL，使用RPMI-1640肉湯1∶50稀釋，最終使孢子濃度為(0.4～5)×104CFU/mL，分別吸取100 μL孢子懸液與藥液加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板，最后1孔作為生長對(duì)照孔，加入100 μL孢子懸液和100 μL RPMI-1640肉湯，置37 ℃培養(yǎng)21～26 h后記錄其最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，計(jì)算能抑制50%菌株生長所需的MIC(MIC50)、抑制90%菌株生長所需的MIC(MIC90)、MIC的幾何均數(shù)(geometric mean，GM)和MIC范圍。當(dāng)孔內(nèi)出現(xiàn)100%生長抑制時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為泊沙康唑與兩性霉素B的MIC。質(zhì)控菌株為煙曲霉ATCC MYA 3626。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，率的比較行χ2檢驗(yàn)。不同種抗真菌藥物的MIC比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同屬毛霉目真菌的MIC值比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)本直接鏡檢結(jié)果 KOH濕片法鏡檢陽性率為76%(19/25)，革蘭染色法陽性率僅為32%(8/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.742，P=0.002)。

2.2形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 13株正確鑒定為根霉屬，鑒別特點(diǎn)為：菌落生長速度快，絨毛樣，孢子囊與假根對(duì)生，可見囊軸和囊托(圖1A、B)；3株正確鑒定為橫梗霉屬，鑒定特點(diǎn)為：初期白色絨毛樣菌落，生長速度快，孢子囊多呈梨形，囊軸錐形，有漏斗狀囊托和囊領(lǐng)(圖1C、D)；3株正確鑒定為小克銀漢霉屬，鑒別特點(diǎn)為：菌落白色，生長速度快，球形或梨形孢囊可長出小型孢囊，形成膨大的齒狀(圖1E、F)；1株正確鑒定為毛霉屬，鑒定特點(diǎn)為：菌落白色，生長速度快，孢囊?？梢姺种Γ瑹o假根，無囊托(圖1G、H)；3株橫梗霉因鏡下結(jié)構(gòu)相似性高，錯(cuò)誤鑒定為傘枝橫梗霉；1株微小根毛霉(圖1I、J)和1株不規(guī)則毛霉(圖1K、L)無法通過形態(tài)學(xué)鑒定。68%(17/25)的菌株可形態(tài)學(xué)鑒定到屬水平。

注：A～B，根霉屬；C～D，橫梗霉屬；E～F，小克銀漢霉屬；G～H，毛霉屬；I～J，微小根毛霉；K～L，不規(guī)則毛霉。圖1 毛霉目真菌在SDA培養(yǎng)24 h的菌落與鏡下特點(diǎn)(400×)

2.3菌株復(fù)核結(jié)果 分子測(cè)序可將所有菌株準(zhǔn)確鑒定到種水平，鑒定率為100%，其中，少根根霉9株(36%)，灰色小克銀漢霉3株(12%)，傘枝橫梗霉3株(12%)，小孢根霉3株(12%)，Lichtheimiaornata2株(8%)，微小根毛霉、總狀橫梗霉、卷枝毛霉、不規(guī)則毛霉和Lichtheimiahyalospora各1株。見表1。

2.4質(zhì)譜鑒定結(jié)果 使用IVD數(shù)據(jù)庫總鑒定率為56%(14/25)，2株(8%)少根根霉無鑒定結(jié)果，9株(36%)因不在IVD數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致無法鑒定，剔除數(shù)據(jù)庫缺少的菌株，鑒定率為87.5%(14/16)；使用RUO數(shù)據(jù)庫總鑒定率為44%(11/25)，5株(20%)出現(xiàn)鑒定錯(cuò)誤，2株(8%)無鑒定結(jié)果，5株(20%)因不在IVD數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致無法鑒定。剔除數(shù)據(jù)庫缺少的菌株，鑒定率為55%(11/20)。聯(lián)合IVD和RUO數(shù)據(jù)庫時(shí)，總鑒定率為64%(16/25)，比使用單一數(shù)據(jù)庫有所提高。見表1。

表1 25株毛霉目真菌的分子測(cè)序與質(zhì)譜鑒定結(jié)果[n(%)]

2.5藥敏結(jié)果 煙曲霉ATCC MYA 3626的MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi)。25株受試菌兩性霉素B的MIC值范圍為0.125～32 μg/mL，84%(21/25)的菌株MIC≤2 μg/mL，兩性霉素B MIC50為1 μg/mL，MIC90為8 μg/mL，其中4株少根根霉表現(xiàn)出較高的MIC值(2株MIC>32 μg/mL，另2株MIC為8 μg/mL)。泊沙康唑MIC值范圍為0.062 5～8 μg/mL，MIC50為2 μg/mL，MIC90為4 μg/mL，68%(17/25)的菌株MIC≤2 μg/mL，與兩性霉素B相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.754，P=0.185)；28%(7/25)菌株MIC值為4 μg/mL，主要見于橫梗霉屬，1株少根根霉MIC值為8 μg/mL。對(duì)于泊沙康唑，12株根霉屬的MIC50為0.5 μg/mL，MIC90為4 μg/mL；7株橫梗霉屬M(fèi)IC50和MIC90均為4 μg/mL；2株毛霉屬M(fèi)IC值≤1μg/mL；3株灰色小克銀漢霉，1株MIC為4 μg/mL；1株微小根毛霉MIC為2 μg/mL。對(duì)于兩性霉素B，根霉屬的MIC50為2 μg/mL，MIC90為8 μg/mL；橫梗霉屬M(fèi)IC50為1μg/mL，MIC90為2 μg/mL；2株毛霉屬M(fèi)IC值≤0.5μg/mL；3株灰色小克銀漢霉MIC≤2 μg/mL；1株微小根毛霉MIC為2 μg/mL?？傮w上，兩性霉素B對(duì)大部分毛霉目真菌的MIC值較低，但對(duì)少根根霉卻表現(xiàn)出較高M(jìn)IC值。泊沙康唑?qū)γ鼓空婢腗IC值較分散，有表現(xiàn)出較低MIC值，同樣也有部分菌種對(duì)泊沙康唑表現(xiàn)出較高的MIC值。見表2。

3 討論

毛霉菌早期診斷是影響治療成功的重要因素[2-3]。然而，以常規(guī)方法對(duì)毛霉目中的菌種進(jìn)行鑒定，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件和人員均要求較高。革蘭染色法是常規(guī)進(jìn)行真菌鏡檢的方法，但毛霉菌絲不易著色，與背景顏色不易區(qū)分，易出現(xiàn)漏檢的情況。KOH濕片法操作簡(jiǎn)單，可呈現(xiàn)菌絲未染色的原生態(tài)特點(diǎn)，不易與背景雜質(zhì)相混淆。當(dāng)鏡檢見菌絲扭曲或絲帶狀折疊、無分隔或偶爾有分隔、分枝不規(guī)則、通常呈直角分枝時(shí)，可初步判斷為陽性結(jié)果，建議涂片結(jié)果報(bào)告為查見真菌菌絲，寬大無隔或少分隔、直角分枝，疑似毛霉目真菌，以早期提示臨床[8]。本研究KOH濕片法對(duì)于毛霉菌絲的檢出率明顯優(yōu)于革蘭染色法，建議在日常工作中可將兩種方法配合使用，提高鏡檢陽性率。然而，直接鏡檢仍存在漏檢和敏感性低的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開展更為敏感的染色方法，如熒光染色和六銨銀染色等。

小克銀漢霉屬和共頭霉屬可通過鏡下形態(tài)識(shí)別，根霉屬可根據(jù)假根、分枝的有無而鑒定。然而，對(duì)于根毛霉屬、橫梗霉屬或毛霉屬，基于形態(tài)特征進(jìn)行鑒定較困難。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，有3株毛霉因具有圓形的孢子囊而不像橫梗霉屬梨形的孢子囊，形態(tài)學(xué)錯(cuò)誤鑒定為根毛霉。然而正如本研究所發(fā)現(xiàn)，臨床上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)不典型或少見的毛霉菌株，3株橫梗霉因鏡下相似度高而錯(cuò)誤鑒定為傘枝橫梗霉，1株微小根毛霉因未發(fā)現(xiàn)假根而無法鑒定，1株不規(guī)則毛霉因產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)不典型和筆者經(jīng)驗(yàn)不足而無法鑒定。因此，亟需提升自身形態(tài)學(xué)鑒定能力并持續(xù)進(jìn)行同質(zhì)化培訓(xùn)，以提高實(shí)驗(yàn)室整體的鑒定水平。

MALDI-TOF MS可實(shí)現(xiàn)部分菌株的準(zhǔn)確鑒定。de Carolis等[10]用MALDI-TOF MS對(duì)包括毛霉在內(nèi)的103株菌株進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果可將96.8%的菌株實(shí)現(xiàn)種水平的鑒定，其中包括傘枝橫梗霉、總狀橫梗霉、微小根毛霉和卷枝毛霉。本研究中單用IVD數(shù)據(jù)庫鑒定率為56%，使用RUO數(shù)據(jù)庫鑒定率為44%，2個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合可提高至64%。質(zhì)譜對(duì)毛霉目真菌鑒定效果一般，2個(gè)數(shù)據(jù)庫在圖譜處理、比對(duì)方法和菌種種類的不同是導(dǎo)致鑒定差異的可能原因。由于質(zhì)譜本身的局限性，復(fù)合群中各個(gè)種呈現(xiàn)同一水平的相似性，其在種鑒定方面尚有一定難度，例如少根根霉復(fù)合群和小孢根霉復(fù)合群。再者，數(shù)據(jù)庫的拓展是提高鑒定率的方法之一。Shao等[11]利用Bruker自建庫在種和屬水平上分別鑒定出90株(81.1%)和111株(100%)毛霉目真菌。因此，實(shí)驗(yàn)室需不斷更新和拓展數(shù)據(jù)庫，優(yōu)化絲狀真菌質(zhì)譜鑒定流程。

對(duì)于表型和質(zhì)譜無法鑒定的毛霉菌株，分子測(cè)序是其鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，主要方法是利用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)真菌間接轉(zhuǎn)錄區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[12]，亦可聯(lián)合多對(duì)引物以提高毛霉鑒定能力。本研究中，分子測(cè)序可將25株毛霉準(zhǔn)確鑒定到種或變種水平，發(fā)現(xiàn)分離率最高為少根根霉，準(zhǔn)確率為100%，可見分子測(cè)序方法能夠有效地鑒別毛霉目真菌，彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和質(zhì)譜鑒定的不足。在日常工作中，對(duì)于形態(tài)學(xué)鑒定困難的毛霉目真菌，可使用質(zhì)譜對(duì)其初步鑒定，對(duì)于質(zhì)譜無法鑒定的菌株，可使用分子方法對(duì)其最終鑒定。但是，部分毛霉難以培養(yǎng)，對(duì)于高?；颊?，建議對(duì)其肺泡灌洗液或組織等行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，從而提高毛霉病的診斷能力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)血清中的毛霉DNA，比組織學(xué)和/或培養(yǎng)平均早8 d(最多24 d)，比影像學(xué)結(jié)果早3 d[13]。盡管分子方法正在完善，但形態(tài)學(xué)鑒定仍是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的方法，因此毛霉病的診斷仍具挑戰(zhàn)性。

因此，為提高毛霉病實(shí)驗(yàn)室診斷能力，亟需將傳統(tǒng)鏡檢、培養(yǎng)、質(zhì)譜技術(shù)和分子測(cè)序相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)毛霉目真菌種水平的鑒定，并積極開展體外抗真菌藥敏試驗(yàn)，從而為臨床早期治療提供參考依據(jù)。