幽門螺桿菌對左氧氟沙星、克拉霉素耐藥性及基因突變分析*

邰萍，尹思潔，何幫順，張振玉，林康，藺昕

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)檢驗科，b.消化內(nèi)科，南京 210006)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種革蘭陰性、微需氧的螺旋桿菌，能特異性地在胃上皮細(xì)胞表面黏液層定植，并成為多種胃部疾病(如慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤等)的重要致病因素[1-4]。最新數(shù)據(jù)顯示，Hp感染率高達(dá)50%～90%[5]。目前用于根治Hp的聯(lián)合用藥包括抑酸劑、抗菌藥物以及鉍劑[6]。然而，隨著藥物的廣泛應(yīng)用，Hp對抗菌藥物的耐藥性在逐年升高導(dǎo)致根除率不斷下降。因此，探討Hp對抗菌藥物的耐藥性、耐藥機制顯得尤為重要。

我國現(xiàn)階段在推薦用于Hp根治的6種抗菌藥物中，甲硝唑耐藥率最高，已不推薦使用；對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥亦處于較高水平；而阿莫西林、四環(huán)素和呋喃唑酮的耐藥率尚較低，用藥時無需先行藥物敏感試驗[7]，但考慮到四環(huán)素和呋喃唑酮不良反應(yīng)較大，提出個體化精準(zhǔn)治療，以期達(dá)到更好的根除率。Hp對喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星耐藥主要與由gyrA基因編碼的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining regions，QRDRs)突變引起的87Asn、91Asp氨基酸置換有關(guān)[8]；而對克拉霉素的耐藥多與23S rRNA V區(qū)上的點突變有關(guān)[9]。

本研究主要了解從門診患者體內(nèi)分離的Hp對左氧氟沙星和克拉霉素的耐藥性，并探究其耐藥基因型與耐藥表型的相關(guān)性，為臨床制定Hp個體化根除治療方案提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇在南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化內(nèi)科就診，有上腹痛、上腹脹、早飽、噯氣、反酸、惡心等癥狀的疑似胃炎患者，經(jīng)尿素呼氣試驗(urea breath test，UBT)或Hp病理組織學(xué)檢測為陽性，且Hp培養(yǎng)陽性的感染病例。病例臨床信息完整，且均在胃鏡室采集過胃組織活檢標(biāo)本，收集診療完成后的胃黏膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)內(nèi)鏡檢查證明有活動性出血者；(2)近2周內(nèi)服用過質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑以及近4周內(nèi)服用過抗菌藥物、鉍劑者；(3)患者同時服用非甾體抗炎藥或酗酒者；(4)妊娠或哺乳期；(5)存在影響本研究結(jié)果的嚴(yán)重疾病，如嚴(yán)重肝病、心臟病、呼吸系統(tǒng)疾病等；(6)采集、運輸、保存不符合要求的組織樣本；(7)耐藥性研究中Hp培養(yǎng)不成功的病例。針對左氧氟沙星和克拉霉素耐藥開展2個獨立的研究，收集病例如下。(1)2021年6—12月納入左氧氟沙星耐藥性研究292例，其中男性151例，女性141例；年齡19～75歲，≤40歲98例(33.56%)，>40歲194例(66.44%)；臨床診斷為食管炎、胃炎或十二指腸球炎，其中伴有潰瘍68例(23.29%)，伴有息肉11例(3.77%)。(2)2018年8月至2019年3月納入克拉霉素耐藥性研究350例，其中男性205例，女性145例；年齡18～80歲，≤40歲114例(32.57%)，>40歲236例(67.43%)；臨床診斷也均為食管炎、胃炎或十二指腸球炎，其中伴有潰瘍93例(26.57%)，伴有息肉27例(7.71%)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號：QX20210419-01)。所有研究對象知情同意。

1.2樣本保存和處理 將胃黏膜組織樣本置入含有2 mL無菌生理鹽水中制成菌懸液，3 h內(nèi)送至實驗室。所采集的新鮮樣本可立即測試或存儲待測，2～8 ℃不超過24 h，(-20±5) ℃不超過3個月，-70 ℃以下不超過24個月。

1.3主要儀器及試劑 A300 PCR儀(杭州朗基公司)，PowerPac系列電泳儀(美國伯樂公司)，3500dx Genetic Analyzer基因分析儀及配套測序反應(yīng)試劑(美國ABI公司)。左氧氟沙星藥敏條(鄭州安圖生物公司)，克拉霉素藥敏條(溫州康泰公司)，磁珠法核酸提取試劑(上海芯超公司)。

1.4方法 (1)培養(yǎng)成功后抗菌藥物(左氧氟沙星、克拉霉素)藥敏試驗：用接種環(huán)將胃黏膜組織連同菌懸液接種在哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，放入三氣培養(yǎng)箱(設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)為O2：5%，CO2：10%，溫度：37 ℃，下同)培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)二代培養(yǎng)后配制成1.0麥?zhǔn)蠞舛?3×108CFU/mL)的菌懸液，涂布在哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，分別將左氧氟沙星藥敏條(E試驗法)和克拉霉素藥敏條(E試驗法)貼于平板，培養(yǎng)3 d后判讀最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)值。質(zhì)控菌株為Hp標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637。依據(jù)歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)(Version8.0, 2018)進行藥敏結(jié)果判斷，左氧氟沙星MIC值>1 mg/L時為耐藥，克拉霉素MIC值>0.5 mg/L時為耐藥。(2)核酸測序試驗：將入組的菌懸液經(jīng)核酸提取(磁珠法)后送至上海吉凱醫(yī)學(xué)檢驗所完成基因測序。核酸提取液經(jīng)A300 PCR儀擴增，再經(jīng)電泳、純化后在3500dx Genetic Analyzer基因分析儀上完成雙向測序。PCR與測序共用引物序列設(shè)計如下：23S rRNA-F：5′-AATGGCGTAACGAGATGGGAG-3′，23S rRNA-R：5′-TCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3′，產(chǎn)物190 bp；gyrA-F(278 bp)：5′-ATTCCATGAGCGT

GATCATAGG-3′，gyrA-R：5′-GTTATCGCCATCAATA

GAGCCAAA-3′,產(chǎn)物278 bp。PCR擴增體系25 μL，包含緩沖液5 μL，dNTP 2 μL，雙向引物各0.6 μL，Hs Taq DNA聚合酶0.4 μL，ddH2O 11.4 μL，DNA模板5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸50 s，共40個循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。使用基因分析軟件GeneMapper v4.1(美國ABI公司)對檢測結(jié)果進行分析及解釋。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行。計數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間率的比較采用卡方檢驗，耐藥基因型和表型的一致性分析采用配對卡方檢驗(McNemar)和Kappa值來表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1耐藥率結(jié)果 入組左氧氟沙星耐藥性研究的292例病例中，體外藥敏試驗(表型)結(jié)果中耐藥120例(41.10%)，敏感172例(58.90%)；入組克拉霉素耐藥性研究的350例病例中，體外藥敏試驗(表型)結(jié)果中耐藥168例(48.00%)，敏感182例(52.00%)。

2.2耐藥率在不同人群中的分布情況 左氧氟沙星的耐藥率在男性中為35.10%(53/151)，女性中為47.52%(67/141)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.645，P=0.031)；耐藥率在年齡≤40歲病例中為24.49%(24/98)，>40歲病例中為49.48%(96/194)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.803，P<0.01)。

克拉霉素耐藥率在男性中為44.88%(92/205)，在女性中為52.41%(76/145)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.932，P=0.165)；耐藥率在年齡≤40歲的病例中為42.98%(49/114)，>40歲病例中為50.42%(119/236)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.705，P=0.192)。

2.3核酸測序試驗(基因型)結(jié)果 入組左氧氟沙星耐藥性研究的292例病例中，169例(57.88%)未發(fā)現(xiàn)突變，123例(42.12%)發(fā)現(xiàn)至少含有一種突變，其中117例(95.12%)檢測有單個突變(第87位的突變73例，第91位的突變44例)，gyrA突變率最高的為Asn87Lys(50.41%)；5例檢測出含有2個位點突變(4.07%)；1例檢出含有3個位點同時突變(0.81%)，見表1。

克拉霉素耐藥性研究的350例病例中，168例(48.00%)未檢出突變，182例(52.00%)檢出至少含有一種突變，其中173例(95.05%)含有單基因突變(A2143G突變171例，A2142C和A2142G各1例)，9例(4.95%)檢出含有2個位點突變(8例A2142G/A2143G，1例A2143G/A2142C)。

表1 左氧氟沙星核酸測序試驗(基因型)結(jié)果

2.4耐藥性在基因型和表型中的一致性結(jié)果 左氧氟沙星的耐藥基因型與表型結(jié)果的符合率為97.60%，率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(McNemar檢驗P=0.453)；一致性結(jié)果為Kappa=0.951(P<0.01)。

克拉霉素的耐藥基因型與表型結(jié)果的符合率為89.71%，率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(McNemar檢驗P=0.029)；但一致性檢驗顯示二者具有顯著的一致性(Kappa=0.795，P<0.01)。見表2。

表2 耐藥性在基因型和表型中的一致性分析

左氧氟沙星耐藥性常見的突變點發(fā)生在gyrA基因的第87位和第91位密碼子，比較這2個突變位點與耐藥表型的一致性，結(jié)果顯示一致性較好，且第87位突變(Kappa=0.951，P<0.01)的一致性略高于第91位(Kappa=0.943，P<0.01)。見表3。

表3 左氧氟沙星2個突變位與耐藥表型結(jié)果的一致性分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示，左氧氟沙星耐藥率為41.10%，且患者不同性別、年齡間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；基因型突變率42.12%，與表型有較好的一致性?？死顾啬退幝蕿?8.00%，患者不同性別、年齡間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；基因型突變率為52.00%，與表型一致性也較高。

有研究顯示，我國Hp感染率為44.2%，存在地區(qū)差異性，西北地區(qū)感染率最高(51.8%)，其次是東部(47.7%)、西南(46.6%)，其他4個地區(qū)(華北、東北、華中、華南)的患病率約為40%[5]，近10年來感染率有所下降，這可能與經(jīng)濟、環(huán)境的改變密切相關(guān)。與此同時，近年來由于抗菌藥物的大量使用，Hp對抗菌藥物的耐藥性在全世界范圍內(nèi)快速上升，這對治療效果有很大的影響，根除率大大降低[10]。由于地域耐藥率的差異，還需要局部監(jiān)測來為每個區(qū)域選擇合適的治療方案。在2018年4月至2019年4月期間，北京的一項研究中克拉霉素、左氧氟沙星的表型耐藥率為52.3%、38.5%，基因型耐藥率為50.9%、33.0%，其耐藥性在基因型和表型水平上具有較強的一致性[11]。有一些在全國范圍內(nèi)的研究結(jié)果也顯示了基因型和表型的一致性[12-13]。本研究中的一致性結(jié)果與其相符。

大量研究表明，Hp對克拉霉素的耐藥機制與23S rRNA V區(qū)上的點突變有關(guān)，引起多肽轉(zhuǎn)移酶環(huán)構(gòu)象的局限性破壞，改變了二級結(jié)構(gòu)，從而減少了克拉霉素與相應(yīng)的核糖體亞基的結(jié)合，產(chǎn)生了耐藥，主要由A2142C、A2142G、A2143G、A2143C、T2182C等幾個點突變引起的，其中前3個是最常見的突變。而Hp對氟喹諾酮類藥物的耐藥性取決于形成gyrA基因的QRDRs在編碼這些氨基酸的位置發(fā)生點突變，使其不能作用于細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制DNA復(fù)制過程，最常見的突變發(fā)生在gyrA基因的第87位和第91位密碼子。因此，如果能檢測這些突變點就可以基本了解耐藥基因型[14]，進而推測其耐藥表型指導(dǎo)臨床用藥。近年來，針對這一設(shè)想，有研究者采用更簡單、更易普及臨床的熒光定量PCR法檢測相關(guān)的耐藥基因，或者用等溫擴增技術(shù)來降低檢測門檻，更有用新型材料在保證特異性和敏感性的基礎(chǔ)上來簡化優(yōu)化實驗條件[15-17]。這都需要在全國范圍內(nèi)進行多中心的數(shù)據(jù)支持驗證。

綜上所述，現(xiàn)階段 Hp對左氧氟沙星、克拉霉素的耐藥率較高，且耐藥相關(guān)基因型與表型的一致性也都較好，所以在培養(yǎng)條件不夠、培養(yǎng)失敗或者要求時效性的情況下，臨床醫(yī)生可以考慮用耐藥相關(guān)基因型來預(yù)測表型，以制定Hp個體化根除的方案，增加治療的有效性。