轉(zhuǎn)膠蛋白沉默影響三陰性乳腺癌細胞凋亡和自噬的作用機制

楊家磊，唐 朝，廖芮婷，加曉芳，何 濤，楊文理

0 引 言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為全球第一大癌癥[1]。根據(jù)生物學(xué)行為、臨床病理特征和分子特征的表達不同，乳腺癌可分為多種亞型。其中，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一類雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體( progesterone receptor, PR)、和人表皮生長因子受體2( human epidermal growth factor receptor, HER-2)表達均為陰性的乳腺癌[2]。TNBC的惡性程度高、侵襲性強、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、死亡率高。因此，尋找三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，并闡明其可能的分子機制，對三陰性乳腺癌的防治具有重要意義。

轉(zhuǎn)膠蛋白(transgelin, TAGLN)是鈣調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一，由單一N-末端鈣蛋白同源結(jié)構(gòu)域(CH)和C-末端鈣調(diào)蛋白樣模序(CLIK)組成[3]。TAGLN在除骨骼肌、紅細胞和神經(jīng)元外的所有細胞和組織中都表達，在平滑肌細胞和成纖維細胞中含量最高。TAGLN與肌動蛋白結(jié)合參與細胞骨架相關(guān)的細胞增殖、分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等生命活動，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，TAGLN在不同類型的癌癥中的表達不同且作用是相互矛盾的，在乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌[5]、食管鱗癌[6]和前列腺癌[7]中表達降低，而在晚期結(jié)直腸癌[8]、肺癌[9]、胃癌[10]和胰腺癌[11]中表達增強。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，其中細胞凋亡及自噬在這一過程發(fā)揮著重要作用[12]。ERK1/2信號通路作為腫瘤研究中的經(jīng)典信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、凋亡和自噬等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[13]。

因此，本研究首先構(gòu)建TAGLN慢病毒干擾質(zhì)粒，用慢病毒感染三陰性乳腺癌細胞Hs578T，建立TAGLN敲低的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞系和對照Hs578TCtrl穩(wěn)定細胞系；然后，分析TAGLN對三陰性乳腺癌細胞凋亡、自噬的影響及作用機制，為三陰性乳腺癌的防治提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料三陰性乳腺癌細胞Hs578T、人胚腎HEK293T細胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、shRNA慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-puro為本實驗室保存?？贵w：TAGLN(Abcam,ab14106)購自成都萬道生物科技發(fā)展公司，GAPDH(CST, 5174S)、ERK1/2(CST, 4695S)、p-ERK1/2(CST, 4370S)、PARP(CST, 9532S)，Caspase3(CST, 9662S)，Cleaved-Caspase3(CST, 9664S)，LC3A/B(CST, 12741S)購自優(yōu)寧維生物科技有限公司，Bax(Proteintech, 50599-2-Ig)、Bcl-2(Proteintech, 12789-1-AP)、P62(Proteintech, 18420-1-AP)購自四川生工科技有限公司。DMEM(H)培養(yǎng)基(HyClone)、胎牛血清(FBS)(HyClone)購自成都金線科技有限公司，Western及IP細胞裂解液(凱基生物)購自成都豪乙科技有限公司，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa)購自成都微克生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)Hs578T、HEK293T細胞用含10%FBS的DMEM(H)培養(yǎng)基培養(yǎng)，TAGLN敲低的穩(wěn)定細胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2)及其對照穩(wěn)定細胞系(Hs578T Ctrl)在培養(yǎng)時另加1 μg/mL Puromycin，所有細胞常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.3靶向TAGLN基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

1.3.1 靶向TAGLN基因shRNA的設(shè)計、合成和退火以TAGLN的mRNA序列 ( NM_001001522.2)為目標(biāo)序列，根據(jù)shRNA設(shè)計原則，設(shè)計、合成2對靶向TAGLN的shRNA干擾序列見表1。靶向Luciferase的陰性對照質(zhì)粒(ctrl)為實驗室保存。將2對寡核苷酸單鏈片段分別溶于滅菌DEPC H2O，使其濃度為100 pmol/μL。將配對的寡核苷酸片段各取4 μL等量混合，加入8 μL10×M buffer(TaKaRa)，總體積16 μL。PCR儀上完成退火程序：96 ℃加熱4 min，70 ℃加熱10 min，緩慢冷卻至4 ℃，-20 ℃保存。

表 1 靶向干擾TAGLN的shRNA序列

1.3.2靶向TAGLN基因shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將退火后的寡核苷酸雙鏈片段和AgeⅠ/EcoRⅠ酶切、純化后的pLKO.1-puro shRNA表達質(zhì)粒按摩爾比3～10:1，取pLKO.1-puro質(zhì)粒 2 μL(55 ng)、退火寡核苷酸雙鏈片段1 μL、ddH2O 2 μL、TakaRa ligation kit 2.1 solution(Ⅰ) 5 μL，總體積共10 μL。16 ℃連接過夜；再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；涂板、37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并用AgeⅠ/EcoRⅠ酶切鑒定，體系為：質(zhì)粒DNA 1 μg, 10×H buffer 2 μL,EcoRⅠ(12 Unit/μL) 0.5 μL，NdeⅠ(12 Unit/μL) 0.5μL加ddH2O 補足20 μL，37 ℃孵育2 h。經(jīng)1g/L瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，陰性質(zhì)粒僅有75 bp插入條帶，陽性質(zhì)粒可見134 bp插入條帶，20%甘油保種。陽性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，分別將測序正確的克隆命名為sh1和sh2。

1.4確定Hs578T細胞的Puromycin最佳篩選濃度接種2×105個/(0.5 mL·孔)的Hs578T細胞至24孔板，當(dāng)細胞70%～80%融合時，分別加入不同濃度的嘌呤霉素濃度(0、0.5、1、2、4、6、8 μg/mL)；繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液，7 d后，選擇Hs578T細胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度(1 μg/mL)作為最佳篩選濃度。

1.5構(gòu)建TAGLN沉默的Hs578T穩(wěn)定細胞系大量提取測序正確的2種TAGLN shRNA質(zhì)粒(sh1和sh2)和陰性對照質(zhì)粒(ctrl)，待HEK293T細胞融合到70%～80%時進行慢病毒包裝。根據(jù)Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝試劑盒(GeneCopoeia)說明書，分別制備質(zhì)粒DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，更換細胞培養(yǎng)基為無血清無雙抗的DMEM(H)；將復(fù)合物分別滴加入細胞培養(yǎng)基中，8 h后更換新鮮全培養(yǎng)基；再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別收集24 h和48 h的細胞培養(yǎng)基(含病毒顆粒)，0.45 μm的無菌濾器過濾去除細胞碎片，獲得慢病毒懸液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。待Hs578T細胞融合到70%～80%時，換液，加8 μg/mL的Polybrene，用慢病毒懸液進行感染。24 h后，用 1 μg/mL 的Puromycin對細胞進行篩選，2～4周后獲得TAGLN敲低的穩(wěn)定細胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2以及對照穩(wěn)定的細胞系(Hs578T Ctlr)。

1.6qRT-PCR和Western blot用Trizol分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，并根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser說明書，去除基因組DNA后進行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR引物見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；qPCR體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ12.5 μL、PCR Forward Primer(10 mΜ) 1.0 μL、PCR Reverse Primer(10Μm)1.0 μL、RT反應(yīng)液(cDNA溶液)2 μL、滅菌水、8.5 μL，總體積25 μL；qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30sec→95 ℃ 5sec→60 ℃30～60sec，后面兩個步驟重復(fù)40個循環(huán)，采用2-△△CT法進行定量分析。

表 2 qPCR引物序列

按細胞總蛋白提取試劑盒(南京凱基)說明書，分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白，留取小部分進行BCA(碧云天)濃度測定；其余總蛋白按比例加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min變性，分裝、-80 ℃保存?zhèn)溆?；蛋白樣品進行12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA-0.1%TBST封閉1h；分別加封閉液稀釋的一抗TAGLN(1∶500)、GAPDH(CST，1∶1000)、ERK1/2(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶1000)、Bax(1∶500)、Bcl2(1∶500)、Caspase3(1∶1000)、Cleaved-Caspase3(1∶500)、LC3I/II(1∶1000)、P62(1∶500)4 ℃、過夜孵育；1×TBST漂洗5 min×3次，室溫孵育相應(yīng)的近紅外熒光二抗1 h，1×TBST漂洗5 min×3；Odessey近紅外成像系統(tǒng)進行圖像采集及灰度分析。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡分別收集TAGLN敲低的穩(wěn)定細胞系Hs578T sh1、Hs578T sh2及對照穩(wěn)定細胞系Hs578T Ctrl，各個細胞系分別分組：空白組(不加FITC-Annexin V、PI組)、FITC-Annexin V組(只加FITC-Annexin V)、PI組(只加PI組)、FITC-Annexin V+PI組(加FITC-Annexin V及PI)。按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(凱基生物)說明書，分別加入100 μL Binding Buffer重懸細胞；每組分別不加或加入5 μL FITC-Annexin V和(或)5 μL 50 μg/mL PI，室溫避光孵育15～25 min，再加入400 μL的Binding Buffer終止染色，避光、1 h內(nèi)完成流式細胞儀上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 TAGLN敲低Hs578T穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建及鑒定NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切結(jié)果顯示，獲得插入TAGLN shRNA序列的陽性質(zhì)粒，見圖1。測序結(jié)果顯示，成功建立了TAGLN慢病毒shRNA質(zhì)粒(sh1及sh2)，見圖2。包裝慢病毒并感染Hs578T細胞，經(jīng)1 μg/mL puromycin篩選2～4周后，獲得TAGLN敲低的穩(wěn)定細胞系(Hs578T sh1、Hs578T sh2)及對照細胞系(Hs578T Ctrl)。Western blot和qPCR結(jié)果顯示，與對照細胞Hs578T Ctrl相比，TAGLN敲低細胞Hs578T sh1、Hs578T sh2的TAGLN蛋白表達分別減少58%、21%(P<0.01)、mRNA表達分別降低32%、48%(P<0.01)，見圖3。提示TAGLN敲低的三陰性乳腺癌穩(wěn)定細胞系Hs578T sh1、Hs578T sh2及其對照穩(wěn)定細胞系Hs578T Ctrl構(gòu)建成功。

2.2敲低TAGLN促進Hs578T細胞的凋亡流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，敲低TAGLN的三陰性乳癌Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞較Hs578T Ctrl細胞的總凋亡率分別增加100.7%、74.4%(P<0.01)，早期凋亡率分別增加126.4%、85.7%(P<0.01)，晚期凋亡率分別增加49.2%、51.9%，見圖4，表3。Western blot結(jié)果顯示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞較Hs578T Ctrl細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表達均減少，促凋亡蛋白Bax表達均增多，Bax/Bcl-2的分別增加148%、115%，Cleaved-PARP蛋白分別增加41%、34%，Capase3蛋白分別增加26%、11%，Cleaved-Caspase3 蛋白增加27%、21%(P<0.01)，見圖5。表明敲低TAGLN促進了三陰性乳腺癌Hs578T細胞的凋亡。

2.3敲低TAGLN抑制Hs578T細胞的自噬通量Western blot結(jié)果顯示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞較對照Hs578T Ctrl細胞的LC3-Ⅱ蛋白表達減少，而P62蛋白表達升高(P<0.01)，說明敲低TAGLN抑制了三陰性乳腺癌Hs578T細胞的自噬通量。見圖6。

1、3、5: 分別是ctrl、 sh1、 sh2未進行酶切; 2、4、6: 分別是酶切后的ctrl、sh1、 sh2

a：TAGLN sh1質(zhì)粒的測序結(jié)果；b: TAGLN sh2質(zhì)粒的測序結(jié)果

*P<0.01、**P<0.001

圖 4 敲低TAGLN增加Hs578T細胞的凋亡率

表 3 Hs578T Ctrl、Hs578T sh1、Hs578T sh2細胞的凋亡率比較

*P<0.01、**P<0.001

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

2.4敲低TAGLN通過ERK1/2信號通路影響Hs578T細胞的凋亡和自噬Western blot結(jié)果顯示，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞較對照組Hs578T Ctrl細胞的ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達減少(P<0.01)，提示敲低TAGLN可能通過抑制ERK1/2的磷酸化水平，進而促進三陰性乳腺癌細胞的凋亡及抑制細胞的自噬通量。見圖7。

*P<0.01、**P<0.001

3 討 論

TAGLN是一種細胞骨架相關(guān)蛋白，該基因及其蛋白質(zhì)序列具有種屬間的高度同源性及進化保守性。TAGLN主要通過穩(wěn)定肌動蛋白絲，參與細胞骨架的重塑，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在不同類型腫瘤中的生物學(xué)功能又不盡相同甚至相反的。既往研究報道TAGLN基因的缺失對腫瘤早期進展很重要，可作為乳腺癌和結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)記物之一；可促進乳腺癌血管正?；⒁种蒲艹鲅亢湍[瘤轉(zhuǎn)移；過表達TAGLN抑制人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的體外遷移和侵襲；TAGLN啟動子甲基化下調(diào)其表達并與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存率呈負相關(guān)[4，14-16]。本研究通過慢病毒shRNA沉默TAGLN，建立TAGLN敲低的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞系和對照Hs578T Ctrl穩(wěn)定細胞系，探討敲低TAGLN是否影響三陰性乳腺癌Hs578T細胞凋亡及自噬。

細胞凋亡是由多種基因調(diào)控的細胞程序性死亡，主要有線粒體途徑、死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及顆粒酶B途徑[17]。在線粒體途徑中，Bcl-2家族是最為重要的調(diào)節(jié)因子之一，包含促凋亡因子(Bax, Bad, Bid)和抗凋亡因子(Bcl-2, Bcl-W, Mcl-1)兩類。Bcl-2和Bax形成異源二聚體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，通過細胞色素C的釋放調(diào)節(jié)細胞凋亡，Caspase-3在凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游發(fā)揮重要作用，通過降解細胞內(nèi)相應(yīng)底物誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[18]。本研究中流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照Hs578T Ctrl穩(wěn)定細胞系相比，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞系的凋亡率增加，Bcl-2表達下調(diào)，Bax、Cleaved-PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3表達上調(diào)，提示敲低TAGLN通過激活Caspase3從而促進了三陰性乳腺癌細胞Hs578T的凋亡。

自噬是一種保守的分解代謝過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、物質(zhì)循環(huán)再利用等方面發(fā)揮重要作用[19]。自噬發(fā)生過程中涉及一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與，在機體營養(yǎng)不充足時，mTOR失活、MAPK活化催化ULK1復(fù)合物的形成，從而引發(fā)自噬[20]。自噬發(fā)生后，LC3-Ⅰ在共價連接酶ATG3的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟そY(jié)合形式的LC3-Ⅱ，參與自噬小體的結(jié)合；P62是一種泛素結(jié)合的蛋白，在自噬發(fā)生時P62可與LC3-Ⅱ蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，然后在自噬溶酶體中降解[21-22]。本研究中，TAGLN敲低Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞系中LC3-Ⅱ的表達減少，P62表達增加，表明敲低TAGLN通過減少LC3-Ⅱ而抑制了Hs578T細胞的自噬通量。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞生長、分化和程序性死亡等一系列生物學(xué)過程。在哺乳動物細胞中，與ERK1/2相關(guān)的細胞內(nèi)信號途徑被認為是經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；ERK1/2參與多種生物學(xué)調(diào)節(jié)過程，包括細胞周期、遷移、凋亡及自噬等。研究表明ERK1/2通過下調(diào)Bcl-2、MMP-9等蛋白，上調(diào)Bax、Bad等蛋白促進細胞凋亡，而TAGLN過表達導(dǎo)致RAS和ERK1/2的激活增加，其下調(diào)也導(dǎo)致激活的RAS和ERK1/2減少[23-24]。在HeLa細胞中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑VK3誘導(dǎo)細胞自噬，激活ERK1/2，ERK1/2抑制劑U0126可以阻斷該過程LC3-Ⅱ的表達，說明ERK1/2參與細胞自噬的形成[25]。在本研究中，敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2穩(wěn)定細胞系的ERK1/2、p-ERK1/2明顯下調(diào)，說明TAGLN以依賴ERK1/2途徑促進三陰性乳腺癌細胞Hs578T的凋亡及抑制自噬通量。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了TAGLN低表達及對照的三陰性乳腺癌Hs578T穩(wěn)定細胞系，TAGLN沉默促進三陰性乳腺癌細胞凋亡并抑制自噬通量，說明TAGLN在三陰性乳腺癌Hs578T細胞中扮演癌基因的角色，可能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為深入研究TAGLN作為三陰性乳腺癌防治的潛在分子靶點提供了實驗依據(jù)。