復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取工藝及抑菌活性研究

萬芳,楊洋,彭佩

（荊楚理工學(xué)院，湖北荊門，448000）

0 引言

復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油以蒼術(shù)、艾葉、降香、白術(shù)、白芷、石菖蒲等富含揮發(fā)油成分的中藥材為原料提取制得，可用于制備一種中藥香薰液。中藥煙熏是我國(guó)傳統(tǒng)的防疫手段之一，可用于醫(yī)院等人員密集場(chǎng)所的空氣消毒，還可緩解患者焦慮和疼痛等癥狀［1,2］。選用蒼術(shù)、艾葉等制成的香薰油對(duì)金黃色葡萄球菌等有明顯的體外抑菌作用，能有效保護(hù)小鼠上呼吸道黏膜及黏膜免疫功能，且對(duì)呼吸道黏膜無刺激作用［3,4］。目前，揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、輔助萃取法等，水蒸氣蒸餾法是目前實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)上應(yīng)用最普遍的方法，其技術(shù)成熟，操作方式簡(jiǎn)單［5,6］。本研究用水蒸氣蒸餾法從中藥復(fù)方中提取揮發(fā)油，通過單因素實(shí)驗(yàn)分析不同加水量、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間下復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率，并采用正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高揮發(fā)油提取率，并對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行初步研究，為其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材

蒼術(shù)（四川天利合藥業(yè)有限公司）；艾葉（江西國(guó)都中藥飲片有限公司）；石菖蒲（四川博仁藥業(yè)有限責(zé)任公司）；白術(shù)（甘肅省國(guó)草藥業(yè)有限公司）；白芷（甘肅省國(guó)草藥業(yè)有限公司）；降香（甘肅省國(guó)草藥業(yè)有限公司）；川芎（湖北藥昇中藥科技有限公司）；薄荷（湖北藥昇中藥科技有限公司）；佩蘭（江西國(guó)都中藥飲片有限公司）；山奈（玉林市升鼎聚原生中草藥有限公司）。

1.2 試劑

無水硫酸鈉為分析純，鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.3 菌種和培養(yǎng)基

大腸埃希菌、金色葡萄球菌：LB 培養(yǎng)基；白色念珠菌：SDA 培養(yǎng)基。（以上菌種由荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供）

1.4 儀器

CS-2000 型高速多功能粉碎機(jī)，武義海納電器有限公司；FA2204 電子分析天平，寧波市鄞州華豐電子儀器廠；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，邦西儀器科技有限公司；揮發(fā)油提取器；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；THZ-100 恒溫培養(yǎng)床，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取方法

稱取處方量藥材，粉粹后過60 目篩，裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水浸泡，用揮發(fā)油提取器在105 ℃條件下加熱回流，收集的揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉吸收多余水分后稱重，按下式計(jì)算復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率：

2.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)［7-9］，以加水量、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間為因素，考察其對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響。

2.2.1 加水量

通過水蒸氣蒸餾法從中藥復(fù)方中提取揮發(fā)油時(shí)，揮發(fā)油通過水介質(zhì)滲出并隨蒸氣餾出，故應(yīng)當(dāng)選擇適應(yīng)的加水量。固定浸泡時(shí)間為30 min，加熱回流時(shí)間為4.5 h，分別測(cè)定加水量為6 倍、8倍、10 倍、12 倍、14 倍時(shí)的揮發(fā)油提取率。由圖1 可知，隨著加水量的增加，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率明顯增加，當(dāng)加水量為10 倍時(shí)，揮發(fā)油提取率為0.619%，繼續(xù)增加水的用量，提取率緩慢下降。這可能因?yàn)榧铀枯^少時(shí)，產(chǎn)生蒸汽量少，揮發(fā)油未充分隨水逸出，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率較低；加水量較多時(shí)，雖然揮發(fā)油逸出增加，但生成蒸汽過多，部分蒸汽沒有充分冷凝回流而從冷凝管上端逸出，揮發(fā)油損失較多，提取率反而下降。

圖1 加水量對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響

2.2.2 浸泡時(shí)間

浸泡能使水分進(jìn)入細(xì)胞溶解胞內(nèi)化合物，使胞內(nèi)滲透壓高于胞外，在壓差作用下，內(nèi)容物向胞外擴(kuò)散并溶于水。經(jīng)充分浸泡后再加熱提取有效成分可提高提取率，減少煎煮時(shí)間，節(jié)省能源消耗，提高經(jīng)濟(jì)效益［10］。因此，本研究稱取處方量藥材，粉粹后裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入10 倍量蒸餾水，分別浸泡0min、10min、20min、30min、40 min，加熱回流4.5 h，考察不同浸泡時(shí)間下的復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率。由圖2可見，不浸泡直接提取時(shí)，提取率較低；浸泡后提取率隨著浸泡時(shí)間的增加而緩慢增加，浸泡30 min 時(shí)，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率最高，而后略有下降，故確定浸泡時(shí)間為30 min。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)提取復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)間

稱取處方量藥材，粉粹后裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入10 倍量蒸餾水，浸泡30min，分別回流1.5h、3h、4.5h、6h，計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見圖3。當(dāng)提取時(shí)間增加時(shí)，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率也逐漸升高，當(dāng)回流時(shí)間從1.5h 增加至3h 時(shí)，提取率明顯增加，但之后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率增長(zhǎng)變緩。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)［11］。選取加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）和提取時(shí)間（C）三因素為正交試驗(yàn)中的考察因素，每個(gè)單因素設(shè)計(jì)三個(gè)水平。稱取處方量藥材，根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)表，按2.1 所述的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1、表2。

表1 復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

續(xù)表

表2 復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)方差分析表

由表1 可知，各因素對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響程度為提取時(shí)間＞加水量＞浸泡時(shí)間，根據(jù)方差分析可知，因素A 和因素C 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即加水量和提取時(shí)間對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率有顯著影響，浸泡時(shí)間B 對(duì)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率影響較?。≒＞0.05）。綜合上述分析結(jié)果，最佳工藝組合為A1B2C3，即加10 倍水，浸泡時(shí)間30min，提取時(shí)間6h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方稱取蒼術(shù)、艾葉、白芷等藥材，選取最佳工藝的條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的平均提取率為0.654%，RSD 值為0.662%，表明該工藝條件較穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，揮發(fā)油提取率相對(duì)較高。

表3 最優(yōu)提取工藝（A1B2C3）下的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5 復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油體外抑菌活性試驗(yàn)

2.5.1 菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌活化，接種于LB 培養(yǎng)基，將白色念珠菌活化，接種在SDA 培養(yǎng)基中，在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h。取各供試菌的菌懸液，用無菌蒸餾水稀釋至合適倍數(shù)，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度，使菌液濃度為1×107-5×107CFU/mL［12］。

2.5.2 對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響

參照文獻(xiàn)［13,14］的方法，用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的吸光度（OD)，根據(jù)吸光度的數(shù)值判斷菌液濃度。在菌懸液中加入復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油制成揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的培養(yǎng)基；在菌懸液中加入阿莫西林或酮康唑使其濃度為50 μg/mL，作為陽性對(duì)照組；以菌懸液為陰性對(duì)照組。將以上培養(yǎng)基置于37 ℃、130 r/min 的搖床中培養(yǎng)12 h，每小時(shí)取樣1 次，于600 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制供試菌體的生長(zhǎng)曲線［15］。

從圖4、圖5 可見，大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌陰性對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線在培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后吸光度會(huì)顯著增加，8～9 h 后吸光度趨于平穩(wěn)；而在揮發(fā)油或阿莫西林的作用下，大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線非常平緩，12 h 反應(yīng)結(jié)束時(shí)與其初始狀態(tài)下的吸光度基本一致，即菌懸液中加入復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油后大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌無明顯增殖，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用。

圖6 所示為復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響，陰性對(duì)照組的含菌量在3 h 后逐漸增加，用復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油處理后的樣品溶液含菌量也呈增加趨勢(shì)，但其吸光度值低于陰性對(duì)照組，而經(jīng)酮康唑處理的陽性對(duì)照組生長(zhǎng)曲線較平緩，說明復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌有一定的抑制作用，但其作用較弱。

圖6 復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響

3 結(jié)論

預(yù)實(shí)驗(yàn)中初步考察了提取溫度（100 ℃、105 ℃、110 ℃）對(duì)揮發(fā)油提取率的影響，溫度升高，揮發(fā)油提取率略有升高，綜合考慮到操作的經(jīng)濟(jì)性，選擇提取溫度為105 ℃，但未作進(jìn)一步考察。

提取工藝研究以復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率為參考指標(biāo)，首先采用單因素試驗(yàn)考察加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)水蒸氣蒸餾法中復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的提取工藝參數(shù)，確定最優(yōu)工藝條件為加10 倍量的水，浸泡30 min，回流提取6 h，在此條件下，復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油提取率平均值為0.654%。根據(jù)生長(zhǎng)曲線結(jié)果可知3 種供試菌的生長(zhǎng)曲線經(jīng)復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油處理后均有改變，且處理后大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的吸光度值基本不變，說明復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油可以抑制3 種供試菌的生長(zhǎng)繁殖，且對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的影響明顯優(yōu)于白色念珠菌。該研究結(jié)果可為復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，為復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油的臨床應(yīng)用等研究提供參考，但復(fù)方蒼術(shù)揮發(fā)油成分復(fù)雜、水溶性差、易氧化，其成分分析、活性及制劑等還有待進(jìn)一步研究。