苦皮藤根化學(xué)成分及其提取物體外抗炎活性研究

胡家震，趙婷婷，何席呈，唐娟，馬彬焰，胡成剛

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽(yáng)，550025）

0 引言

苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim.）又名吊干麻、苦樹(shù)皮，是一種多年生藤狀灌木，為衛(wèi)矛科Celastraceae 南蛇藤屬Celastrus L.植物［1］，其根或根皮入藥，具有祛風(fēng)除濕、活血通經(jīng)、解毒殺蟲(chóng)的功效，民間常用于治療風(fēng)濕痹痛、骨折傷痛、閉經(jīng)、瘡瘍潰爛、頭癬、陰癢等疾?。?,3］?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)苦皮藤根主要含有倍半萜類、生物堿類、三萜類、二萜類和黃酮類等化學(xué)成分［4,5］，具有殺蟲(chóng)、昆蟲(chóng)拒食、抑制巨噬細(xì)胞活化、抗腫瘤、對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥抗性有修復(fù)作用、抗艾滋病病毒、抗氧化活性以及抗生育等活性［6,7］。本文采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、凝膠柱色譜、高效液相色譜（HPLC）等多種分離技術(shù)對(duì)苦皮藤根正丁醇部位進(jìn)行了分離純化，結(jié)合核磁共振波譜（NMR）以及質(zhì)譜（MS）等結(jié)構(gòu)鑒定手段確定了所得單體成分結(jié)構(gòu)，分離得到5 個(gè)化合物，分別鑒定為 (+)-4’-O-methylcatechin 5-O-β-Dglucopyranoside(1)、(-)-兒茶素(2)、表兒茶素(3)、3,4-dimethoxyphenyl-β-D-glucopyranoside(4)、3,4,5-trimethoxyphenyl-β-D-glucopyranoside(5)，其中化合物(1)(4)(5)是首次從苦皮藤中分離得到的，并利用 ELISA 法測(cè)定了苦皮藤的醇提物、二氯甲烷部位、正丁醇部位及分離得到的單體化合物對(duì)（RAW264.7）巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）的分泌表達(dá)［8,9］。體外抗炎結(jié)果顯示乙醇提取物、正丁醇萃取部位在50μg/mL 和20μg/mL 的給藥濃度下均能顯著降低LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞所釋放的TNF-α 的含量，化合物(1)(2)(3)(4)(5)均對(duì)巨噬細(xì)胞活化后 TNF-α 的表達(dá)有不同程度的抑制作用，提示正丁醇萃取部位可能是苦皮藤的主要抗炎部位，化合物(1)(2)(3)(4)(5)具有潛在的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance Neo-400 MHz 核磁共振波譜儀（TMS 為內(nèi)標(biāo)，德國(guó)Bruker 公司）；LC3000高效液相色譜儀（創(chuàng)新通恒）；JCS-31001C電子天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；RE-5298 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；250mm×10mm,5μm C18 柱（日本YMC 公司C18柱）；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GF254 薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）；柱層析硅膠（140～160 目，200～300 目，青島海洋化工有限公司）；正丁醇、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙醇分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）?？嗥ぬ偎幉慕?jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館胡成剛教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物苦皮藤的根，標(biāo)本保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館，標(biāo)本號(hào)為202008S10。

受試樣品：苦皮藤中分離得到的單體化合物(1)(2)(3)(4)(5)，以及乙醇提取物、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位，樣品均用 DMSO 溶解。對(duì)以上樣品共進(jìn)行2 次篩選，每次篩選每樣品每濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以M±SD 表示。

活化劑：脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，活化指數(shù)為15.70 ± 0.84.

陽(yáng)性藥：扁塑藤素。

1.2 提取與分離

取干燥苦皮藤根粗粉5 kg，以75%乙醇80℃下回流提取3 次（40L/次），每次2h?；厥找掖?，濃縮得到753g 醇提物干浸膏，得膏率為15.06%。將干浸膏加純水溶解制成混懸液，根據(jù)極性大小依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶劑等比例反復(fù)萃取，濃縮，分別得到各萃取物浸膏64.9g、74.4g、226.4g。

取正丁醇萃取浸膏8g，采用MCI 柱色譜（甲醇-水v/v 0% → 45%）梯度洗脫后得分段Z1 至Z6，Z2 合并后Z3 經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫，洗脫劑（二氯甲烷-甲醇v/v 20:1 → 1:1），得到化合物1（15mg），Z4（2.5g）經(jīng)硅膠柱色譜洗脫，洗脫劑（二氯甲烷-甲醇-水v/v/v 10:1:0→ 2:1:0.2），得到化合物2（223mg），結(jié)合薄層色譜（TLC）檢測(cè)，合并極性相同組分后得到2 個(gè)組分（Z4-1、Z4-2）。Z4-1 上凝膠柱層析，得到Z4-1-1（15mg）后利用制備型HPLC（甲醇-水 = 27% → 73%）梯度洗脫，得到化合物4（6mg）、化合物5（6mg）。

1.3 體外抗炎活性評(píng)價(jià)

篩選模型：巨噬細(xì)胞（RAW264.7）活化抑制模型。

篩選方法：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）檢測(cè)巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）的分泌表達(dá)。

模型原理：首先對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激活化，使其分泌表達(dá)TNF-α。然后將各樣品加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)孔中一定時(shí)間后，加入多脂糖（LPS），培養(yǎng)一定時(shí)間，取細(xì)胞上清液測(cè)定TNF-α 的含量，以此來(lái)判斷樣品對(duì)細(xì)胞的活性抑制作用。

計(jì)算公式：活化抑制率 (%) = ［(LPS 組TNF-α 含量－樣品組TNF-α 含量)/LPS 組TNF-α 含量］×100。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定與解析

2.1.1 化合物(1)(+)-4’-O-methylcatechin 5-O-β-D-glucopyranoside

C22H26O11， 溶于吡啶、二甲亞砜溶劑，ESIMS m/z: 467.16 ［M+H］+，1H NMR (600 MHz，C5D5N) 5.08 (1H， d， J = 7.8 Hz， H-2)， 4.38 (1H，m， H-3)， 3.28 (1H， dd， J = 16.2， 8.4 Hz， H-4)，7.11 (1H， d， J = 2.4 Hz， H-6)， 6.72 (1H， d， J =2.4 Hz， H-8)， 7.56 (1H， d， J = 1.8 Hz， H-2’)，7.16 (1H， dd， J = 8.4， 1.8 Hz， H-6’ )， 6.91 (1H， d，J = 8.4 Hz， H-5’ )， 3.70 (3H， s， 3’-OCH3)， 5.66(1H， d， J = 7.2 Hz， H-1’’ ).13C NMR (150 MHz，C5D5N) 8.33 (C-2)， 68.2 (C-3)， 29.9 (C-4)， 158.3(C-5)， 97.3 (C-6)， 158.9 (C-7)， 98.3 (C-8)， 157.0(C-9)， 103.2 (C-10)， 134.1 (C-1’ )， 119.4 (C-2’ )，148.5 (C-3’ )， 148.8 (C-4’ )， 112.5 (C-5’ )， 116.3(C-6’ )， 56.3 (C-4’-OCH3)， 102.7 (C-1’’ )， 75.3(C-2’’ )， 79.0 (C-3’’ )， 71.4 (C-4’’ )， 79.0 (C-5’’ )，62.5 (C-6’’ ). 數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)［10］相符。

2.1.2 化合物(2) (-)-兒茶素

C15H14O6， 溶 于 甲 醇 溶 劑，ESI-MS m/z:291.09 ［M+H］+，1H NMR (600 MHz， CD3OD)，4.60 (1H， d， J = 7.8 Hz， H-2)， 4.10 (1H， m，H-3)， 2.87 (1H， dd， J = 16.2， 5.4 Hz， H-4)， 2.53(1H， dd， J = 16.8， 7.8 Hz， H-4)， 6.87 (1H， d， J= 1.8 Hz， H-2’ )， 6.80 (1H， d， J = 8.4 Hz， H-5’)， 6.75 (1H， dd， J = 8.4， 1.8 Hz， H-6’ ).13C NMR(150 MHz， CD3OD)， 82.8 (C-2)， 68.8 (C-3)， 28.5(C-4)， 157.5 (C-5)， 96.4 (C-6)， 157.7 (C-7)， 95.6(C-8)， 156.9 (C-9)， 100.9 (C-10)， 132.2 (C-1’ )，115.3 (C-2’ )， 147.2 (C-3’ )， 146.2 (C-4’ )， 116.2(C-5’ )， 120.1 (C-6’ ). 數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)［11］相符。

2.1.3 化合物(3) 表兒茶素

C15H14O6， 溶于甲醇溶劑， ESI-MS m/z: 291.09［M+H］+，1H NMR (600 MHz， CD3OD) δ 4.82(1H， s， H-2)， 2.74 (1H， dd， J = 16.8， 2.4 Hz，H-4)， 5.94 (1H， d， J = 2.4Hz， H-6)， 5.92 (1H， d，J = 2.4 Hz， H-8)， 6.76 (1H， d， J = 8.4 Hz， H-5’).13C NMR (150 MHz， CD3OD) δ 79.9 (C-2)， 67.5(C-3)， 29.3 (C-4)， 157.7 (C-5)， 96.4 (C-6)， 158.0(C-7)， 95.9 (C-8)， 157.4 (C-9)， 100.1 (C-10)，132.3 (C-1’ )， 115.3 (C-2’ )， 145.9 (C-3’ )， 145.8(C-4’ )， 115.9 (C-5’ )， 119.4 (C-6’ ). 數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)［12］相符。

2.1.4 化合物(4) 3，4-dimethoxyphenylβ-D-glucopyranoside

C14H20O8， 溶于甲醇溶劑， ESI-MS m/z: 317.12［M+H］+，1H NMR (400 MHz， CD3OD) δ 6.82 (1H，d， J = 2.4 Hz， H-2)， 3.81 (3H， s， 4-OCH3)， 3.78(3H， s， 3-OCH3)， 3.38 (1H， m， H-2’ )， 3.43 (1H，m， H-3’ )， 3.43 (1H， m， H-4’ )， 3.43 (1H， m，H-5’ )， 3.90 (1H， dd， J = 12.0， 1.6 Hz， H-6’ ).13C NMR (100 MHz， CD3OD) δ 154.0 (C-1)， 104.1 (C-2)， 151.1 (C-3)， 146.0 (C-4)， 113.9 (C-5)， 109.3 (C-6)， 56.4 (C-OCH3)， 57.1 (C-OCH3)， 103.5 (C-1’ )，75.0 (C-2’ )， 78.2 (C-3’ )， 71.6 (C-4’ )， 78.0 (C-5’ )，62.6 (C-6’ ). 數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)［13］相符。

2.1.5 化合物(5) 3，4，5-trimethoxyphenylβ-D-glucopyranoside

C15H22O9， 溶 于 甲 醇 溶 劑， ESI-MS m/z:347.13 ［M+H］+，1H NMR (600 MHz， CD3OD) δ 3.81 (6H， s， H-3， 5-OCH3)， 3.70 (3H， s， H-4-OCH3)， 4.81 (1H， d， J = 7.2Hz， H-1’ )， 3.33 (1H，m， H-2’ )， 3.44 (1H， m， H-3’ )， 3.44 (1H， m，H-4’ )， 3.44 (1H， m， H-5’ )， 3.92 (1H， dd， J =12.0， 2.4 Hz， H-6’ )， 3.66 (1H， dd， J = 12.0， 6.6 Hz， H-6’ ).13C NMR (150 MHz， CD3OD) δ 156.1部位能夠顯著抑制細(xì)胞分泌TNF-α；苦皮藤的二氯甲烷萃取部位與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在1.0×10-5mol/L 給藥組中，化合物(1)(2)(5)與模型組比較具有顯著差異；1.0×10-4mol/L 給藥組中化合物（3）與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1.0×10-6mol/L 給藥組中化合物(4)與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 小結(jié)

苦皮藤是民間常用藥，具有抗腫瘤、抗艾(C-1)， 96.1 (C-2， 6)， 154.8 (C-3， 5)， 134.4 (C-4)，56.5 (C-3， 5-OCH3)， 61.2 (C-4-OCH3)， 103.2 (C-1’ )， 75.0 (C-2’ )， 78.4 (C-3’ )， 71.7 (C-4’ )， 78.1(C-5’ )， 62.7 (C-6’ ). 數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)［14］相符。

2.2 體外抗炎活性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖1 不同提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 含量的影響（###P＜0.001 v.s.正常組；**P＜0.01；*P＜0.05 v.s.模型組）

圖2 不同濃度化合物對(duì) LPS 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α 含量的影響（###P＜0.001 v.s.正常組；**P＜0.01；*P＜0.05 v.s.模型組）

對(duì)苦皮藤不同萃取部位和分離得到的化合物進(jìn)行體外抗炎活性篩選，可知，苦皮藤總提物、正丁醇萃取部位及5 個(gè)單體成分均對(duì)巨噬細(xì)胞活化后TNF-α 的表達(dá)有不同程度的抑制作用。如圖1 和2 所示，模型組和正常組比較有極顯著差異（P＜0.001），說(shuō)明模型組構(gòu)建成功，以及LPS 能夠誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞大量產(chǎn)生TNF-α；扁塑藤素與模型組比較具有顯著差異（P＜0.01）說(shuō)明扁塑藤素能夠明顯地抑制LPS誘 導(dǎo)RAW264.7 分 泌TNF-α。 在50μg/mL 和20μg/mL 給藥組中，苦皮藤的乙醇提取物和正丁醇萃取部位提取物與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明苦皮藤的總提物和正丁醇萃取滋病病毒、抗氧化、抗炎等多種藥理作用［10-14］，同時(shí)苦皮藤對(duì)于農(nóng)作物具有極高的應(yīng)用價(jià)值，利用其活性成分研制生物農(nóng)藥,獲得了良好的進(jìn)展［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有治療作用。本研究從苦皮藤根75%乙醇提取物正丁醇萃取部位中共分離、鑒定出了5 個(gè)化合物，包括2 個(gè)黃酮類化合物〔化合物（2）（3）〕、3 個(gè)苷類化合物〔化合物（1）（4）（5）〕。且化合物（1）（4）（5）均首次從該植物中分離得到。據(jù)已有研究報(bào)道，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等活性［17］，苷類化合物具有免疫調(diào)節(jié)活性［18］。本研究用ELISA 法測(cè)定了苦皮藤的醇提物、二氯甲烷萃取部位、正丁醇部位及分離得到的單體化合物對(duì)（RAW264.7）巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）的分泌表達(dá)?；钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇提取物、正丁醇萃取部位在50μg/mL 和20μg/mL 的給藥濃度下均能顯著降低LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞所釋放的TNF-α 的含量，其中二氯甲烷部位對(duì)巨噬細(xì)胞活化無(wú)抑制作用；化合物(1)(2)(3)(4)(5)均對(duì)巨噬細(xì)胞活化后 TNF-α 的表達(dá)有不同程度的抑制作用，其中在1.0×10-5mol/L 給藥濃度下，化合物(1)(2)(5)對(duì)巨噬細(xì)胞活化后TNF-α的表達(dá)有顯著的抑制作用，化合物(3)(4)對(duì)巨噬細(xì)胞活化后TNF-α 的表達(dá)有微弱的抑制作用，即正丁醇萃取部位可能是苦皮藤的主要抗炎部位，化合物(1)(2)(3)(4)(5)具有潛在的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了苦皮藤中黃酮及苷類，可能為苦皮藤主要抗炎活性成分，但其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的深入研究。