基于高效液相色譜法研究五種不同中藥炮制工藝對(duì)白芍單帖糖苷類藥用成分含量的影響

鄒立君，胡巧玲2

（1.江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，江西撫州，344000；2.江西司法警官職業(yè)學(xué)院，江西南昌，330013）

0 引言

白芍（Cynanchum otophyllum Schneid）系蘿藦科鵝絨藤屬植物，多年生草質(zhì)藤本，根灰黑色圓柱狀。白芍生長(zhǎng)在山地疏林或者山坡灌木叢林中，在大理北部和云南地區(qū)分布較多，廣西、湖南、西藏及四川等省份也有分布。白芍的有效藥用成分為根部，中醫(yī)上具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽、斂陰止汗等功效。臨床上常見白芍炮制品主要包括炒白芍、生白芍、酒白芍、出白芍、土炒白芍、焦白芍等幾類。生白芍可以最大程度保留白芍醇溶性和水溶性浸出藥用成分，斂陰平肝功效佳，臨床上常用于治療肝陽上亢導(dǎo)致的頭暈?zāi)垦?、耳鳴等癥狀。酒白芍能降低白芍酸寒特性，臨床上往往用于治療脅肋疼痛、腹痛等癥狀。醋白芍能緩和白芍之藥性，降低白芍藥用過程中的毒性，臨床上可達(dá)斂血止血、疏肝解郁等功效［1］。炒白芍意在養(yǎng)血、養(yǎng)肝，臨床上常用于治療肝旺脾虛之癥。土炒白芍臨床上常用于干癢脾虛泄瀉或者瀉痢日久、喜按、喜溫之癥［2］。焦白芍養(yǎng)血柔肝，臨床上常用于胸腹脅肋疼痛、自汗盜汗、瀉痢腹痛等癥，可達(dá)緩解疼痛，斂陰收汗之效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，白芍藥用化學(xué)成分包括芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等單帖糖苷類系列化合物，因此中藥炮制生產(chǎn)過程中往往以此類藥用成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)。目前白芍的中藥炮制質(zhì)量控制主要通過高效液相色譜法進(jìn)行，該方法具有操作簡(jiǎn)易、分離度高、靈敏度佳、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本研究在高效液相色譜檢測(cè)基礎(chǔ)上，探討不同白芍炮制法下白芍藥用單帖糖苷類化合物含量的差異，旨在為從事白芍中藥炮制研究的研究者和從事白芍中藥炮制的企業(yè)提供參考性建議。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

安捷倫1260 高效液相色譜儀（江西某高校課題組實(shí)驗(yàn)設(shè)備）：①流速最大 5 mL/min 時(shí)壓力最高 60 MPa （600 bar， 8700 psi）；②流速最大5 mL/min 時(shí)壓力最高40 MPa ；③0.05 ～ 5.0 mL/min（可設(shè)定流速增量為 0.001 mL/min）；④小于等于 0.07% RSD 或 0.02 min SD，取較大值；⑤整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，一般 6.5 nm。

電子天平儀器（品牌：ZANWEI/贊維；型號(hào)：ZA 系列；最小顯示值0.01mg）。

超聲波清洗器（品牌：昆山舒美；型號(hào)：KQ2200E；容量：3L；超聲頻率：40KHz；超聲功率：100W；加熱功率：400W）。

中藥炮制器（自制，可人工翻轉(zhuǎn)，體積為5L，最高溫度為350℃）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品試劑

單帖糖苷類化合物：苯甲酰芍藥苷（CAS 號(hào)：38642-49-8；成都鈉鈳鋰生物科技有限公司；分析純；產(chǎn)品編碼：nkl-00608）；芍藥苷（CAS：號(hào)23180-57-6；成都鈉鈳鋰生物科技有限公司；分析純；產(chǎn)品編碼：nkl-00284）；氧化芍藥苷（CAS 號(hào)：39011-91-1；成都鈉鈳鋰生物科技有限公司；分析純；產(chǎn)品編碼：nkl-00334）；芍藥內(nèi)酯苷（CAS 號(hào)：39011-90-0；成都鈉鈳鋰生物科技有限公司；分析純；產(chǎn)品編碼：00285）。

溶劑：乙腈（CAS 號(hào) 75-05-8；阿拉丁品牌；梯度色譜級(jí)≥99.9%）；磷酸（CAS 號(hào)7664-38-2；阿拉丁品牌；色譜級(jí)85%～90%）；甲醇（CAS 號(hào)67-56-1；阿拉丁品牌；色譜級(jí)≥99.9%）；超純水（自制）。

白芍飲片：網(wǎng)購，經(jīng)專家鑒定后確定為干燥的蘿藦科鵝絨藤屬植物芍藥根部。

1.3 白芍中藥炮制過程

酒白芍：稱取白芍藥片50g，加入黃酒10g，于容器內(nèi)慢慢攪拌，燜至酒干后轉(zhuǎn)置中藥炒制容器內(nèi)，文火加熱慢炒，至白芍藥片微黃后取出放涼即可。

醋白芍：稱取白芍藥片50g，加入米醋20g，與容器內(nèi)慢慢攪拌，燜至米醋被藥片吸干后轉(zhuǎn)置中藥炒制容器內(nèi)，文火加熱慢炒，至白芍藥片表面微黃后取出放涼即可。

炒白芍：稱取白藥藥片50g，置于中藥炒制容器內(nèi)，文火加熱慢炒，至白芍藥片表面微黃后取出放涼即可。

土炒白芍：稱取灶心土50g 置于中藥炒制容器內(nèi)，文火加熱慢炒，至灶心土微浮動(dòng)后慢慢加入已稱取的50g 白藥藥片，文火加熱慢炒，至白芍藥片表面附著灶心土粉末及色顯微黃時(shí)取出藥片，于藥片溫時(shí)篩除灶心土粉末，后放涼即可。

焦白芍：稱取50g 白藥藥片，置于中藥炒制容器內(nèi)，先武火快炒后改用文火慢炒，至白藥藥片表面呈黑褐色、內(nèi)呈深褐色后取出放涼即可。

1.4 溶液制備

1.4.1 對(duì)照品制備

準(zhǔn)確稱取對(duì)照品苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷四種藥品，分別加入5mL 容量瓶中，用0.1%（70%）磷酸水與30%乙腈混合溶液分別定容為0.5100mg/mL、0.5150mg/mL、0.5200mg/mL、0.5250mg/mL 的 對(duì)照品儲(chǔ)備液，再分別準(zhǔn)確稱取上述四種溶液進(jìn)行混合，即為混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 待測(cè)品制備

將生白芍和1.3 節(jié)中經(jīng)不同炮制方法炮制所得的白藥藥片進(jìn)行粉碎，過80 目（180μm）篩得6 種白芍藥粉。精準(zhǔn)稱取6 種白芍藥粉1.0g，分別加入100mL 具塞三角燒瓶中，緩慢向三角燒瓶中滴加75%甲醇溶液50mL 后稱重記數(shù)。三角燒瓶置于超聲波清洗器環(huán)境中超聲處理（300W）1h 后取出，放置至室溫后用75%甲醇溶液補(bǔ)足失重，用中性過濾紙進(jìn)行過濾后再用0.40μm 濾膜真空抽濾，抽濾液即為本研究所制待測(cè)樣品。

1.5 高效液相色譜檢測(cè)條件

Shimadzu GL InertSustain AQ-C 18 液相色譜柱（250 mmx4.6 mm，5μm），流動(dòng)相：0.1 %磷酸水（A）-乙睛（C）；梯度洗脫程序：0～5min（C 為10%～16%）；5～20min（C 為15%～16%）；20～35min（16%～20%）；35～45min（C 為16%～20%）；45～60min（C 為24%～48%）； 流速:1.0 mL/min；柱溫：35.0℃；進(jìn)樣量：10μL；氧化芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)258nm；芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證分析

2.1.1 線性關(guān)系驗(yàn)證

精準(zhǔn)稱取混合對(duì)照品溶液1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL， 分 別 加入10mL 容量瓶匯總，經(jīng)75%甲醇溶液定容至刻度，緩慢搖勻后，依照1.5 節(jié)高效液相色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣；以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)性工作曲線，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如下表所示。由表1 可知，現(xiàn)行范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，說明回歸方程線性關(guān)系良好，研究方法具有可行性。

表1 白芍藥用成分單帖糖苷類化合物對(duì)照品回歸方程

2.1.2 精密度試驗(yàn)驗(yàn)證

依照1.5 節(jié)高效液相色譜檢測(cè)條件對(duì)統(tǒng)一濃度對(duì)照樣品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣10 次，每次進(jìn)樣量控制為10μL，記錄峰面積檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，四種白芍單帖糖苷面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.48%、0.35%、0.75%、0.55%，成峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.8%，表明本研究所采用的高效液相色譜檢測(cè)方法及檢測(cè)條件精密度良好，可滿足本研究需求。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證

精準(zhǔn)稱取10 份1.0g 白芍藥粉，依照1.4 節(jié)方法制備10 份平行樣，再按照1.5 節(jié)高效液相色譜檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算白芍藥粉中四種單帖糖苷類化合物含量，結(jié)果如下表。由下表2 可知，四種單帖糖苷類化合物成分含量檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜1.50%，表明本研究方法具有較高重復(fù)性，可滿足本研究需求。

表2 實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證

精準(zhǔn)稱取1.0g 白芍藥粉，依照1.4 節(jié)制備待測(cè)溶液，再按照1.5 節(jié)色譜條件，分別在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h 時(shí) 進(jìn) 行 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，四種單帖糖苷類化合物面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.28%、1.68%、1.59%、1.97%，均小于3.00%，表明待測(cè)樣品溶液在72h 內(nèi)基本穩(wěn)定，可滿足本研究要求。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取10 份已知含量的炒白芍藥粉，分別加入樣品含量相當(dāng)?shù)? 種對(duì)照品溶液，依照1.4 節(jié)提取和制備溶液，再按照1.5 節(jié)高效液相色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)計(jì)算結(jié)果如下表所示。由表3 可知，四種單帖糖苷類化合物平均加樣回收率分別為99.78%、96.84%、94.50%、99.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.21%、4.55%、3.07%、1.17%，平均加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在《藥典》相關(guān)規(guī)定的可接受范圍內(nèi)，即滿足本研究需求。

表3 平均加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

按照1.5 節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)條件對(duì)不同炮制法所得白芍炮制品進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，對(duì)照品和待測(cè)品在高效液相色譜譜圖中均有有芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷色譜特征峰出現(xiàn)，說明生白芍和不同炮制法所得白芍炮制品中均有含量較為豐富的芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷；而焦白芍和土炒白芍高效液相色譜圖中氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷特征峰不明顯，表明兩種藥用成分含量較少，即經(jīng)土炒和焦炒后，白芍中的氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷均有較大損失。生白芍和不同炮制法所得白芍炮制品單帖糖苷類化合物含量檢測(cè)結(jié)果如表4 所示。

由表4 可知，不同中藥炮制法所得白芍炮制品單帖糖苷類化合物成分含量有明顯的差異。酒白芍、醋白芍及炒白芍中單帖糖苷類化合物含量與生白芍相比相差不大，表明該三種中藥炮制法對(duì)芍藥中藥用單帖糖苷類化合物的影響不大。而土炒白芍和焦白芍中4 中單帖糖苷類化合物含量相比生白芍都有不同程度減少：土炒白芍中芍藥內(nèi)酯苷減少27.21%，苯甲酰芍藥苷減少69.44%，氧化芍藥苷減少69.38%，芍藥苷減少72.75%；焦白芍中芍藥內(nèi)酯苷減少42.38%，苯甲酰芍藥苷減少87.42%，氧化芍藥苷減少85.63%，芍藥苷減少89.88%。

表4 不同中藥炮制對(duì)白芍單帖糖苷類化合物含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

中藥原材料往往具有一定副作用或毒性，需經(jīng)炮制后方可入藥，這是中醫(yī)學(xué)中中藥用藥最為明顯特點(diǎn)之一。根據(jù)中醫(yī)藥理論，中藥炮制是根據(jù)辨證論治原理和藥物自身性質(zhì)，是通過調(diào)劑、制劑等不同要求而對(duì)中藥材進(jìn)行炮制制藥的技術(shù)。多數(shù)人認(rèn)為，與西藥相比，中藥副作用小，因此在臨床運(yùn)用中醫(yī)藥物治療時(shí)常不按照服藥要求進(jìn)行服藥，對(duì)中藥劑量也未給予足夠重視。一般而言，中藥比西藥安全，毒副作用也較西藥更不明顯，但正所謂“是藥三分毒”，中藥的副作用同樣存在，用藥時(shí)需要相關(guān)配伍來消除毒性，才能保證足夠安全［3-5］。此外，中藥服藥方式不對(duì)，同樣會(huì)引起明顯的臨床不適，輕則帶來痛苦，重則危及生命安全。臨床研究證明，不少藥材具有一定毒性，如直接服用生草烏、生川烏、天南星、馬錢子等藥材往往會(huì)導(dǎo)致患者身體不適，甚至危害生命。有毒中藥須經(jīng)科學(xué)的炮制工藝加工降低毒性后，繼而用于中醫(yī)臨床治療。未經(jīng)科學(xué)的炮制加工，或炮制工藝不當(dāng)則將導(dǎo)致藥材質(zhì)量無法保證，還極有可能導(dǎo)致患者中毒，這不但會(huì)延誤患者治療，還將直接威脅患者生命安全。

中藥材藥用成分復(fù)雜，中醫(yī)臨床治療從患者病情和體質(zhì)出發(fā)用藥，針對(duì)不同患者病情和體質(zhì)選擇與之相對(duì)應(yīng)的中藥配方，配方內(nèi)容包括藥材種類、用量、服用方法及周期等。鑒于藥材成分復(fù)雜，同一味藥材在不同方劑中作用不一樣，如何首烏中二苯乙烯苷化合物成分有抗衰老、提高免疫力、滋養(yǎng)肝臟和防止動(dòng)脈硬化等功效，總多糖成分可用于抗腫瘤，牛膝肽多糖可用于提高免疫活性等［6-8］。中藥方劑配置須考慮藥材有效藥用成分和配伍作用，通過不同藥物之間作用實(shí)現(xiàn)臨床治療效果。中藥藥用成分本質(zhì)是某種或某類化學(xué)物質(zhì)，其性質(zhì)受溫度、濕度、光照等多重因素影響，如高溫條件下某些藥用成分會(huì)分解消失［9］。中藥炮制是通過控制外界條件對(duì)藥材進(jìn)行加工，達(dá)到保留藥用成分或去除毒性成分之目的。用不同炮制方法制得的中藥炮制品，其藥效差異主要源于炮制過程中藥物藥用成分的變化。比較中藥經(jīng)不同炮制方法前后藥用成分變化對(duì)研究中藥學(xué)和中醫(yī)臨床學(xué)具有重要意義，目前已成為中藥學(xué)和中醫(yī)臨床學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。

本研究中，經(jīng)過5 種不同炮制工藝的白芍炮制品中芍藥苷含量均大于《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)芍藥苷含量1.2%的要求，表明土炒白芍、焦白芍、炒白芍、醋白芍和酒白芍均可用于臨床抗抑郁、心血管疾病、保肝、消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、腸道疾病等方面的中醫(yī)治療。不同炮制方法所得白芍炮制品單帖糖苷類化合物略有差異，經(jīng)米醋、酒浸處理及文火炮制的醋白芍和酒白芍能很好保留單萜糖苷類化合物藥用成分。土炒白芍炮制溫度高于醋白芍和酒白芍。隨著溫度的升高，白芍種單帖糖苷類化合物含量急劇下降，而武火炮制后的焦白芍的單帖糖苷類化合物于高溫條件下大量分解流失。綜上可知，本研究結(jié)果與該領(lǐng)域多數(shù)研究者的研究結(jié)果保持一致，即白芍種單帖糖苷類化合物在高溫條件下易流失。但本研究結(jié)果并不能說明焦白芍不具備藥用功效，不少研究表明，焦白芍具有“斂血止血”之功效。鑒于此，建議在芍藥炮制加工過程中，應(yīng)根據(jù)藥用成分需求控制好炮制溫度，保證所需藥用成分含量［10-12］。此外，本研究?jī)H限于觀察不同炮制法下白芍單帖糖苷類化合物含量變化，對(duì)土炒白芍、焦白芍止血功效成分尚不能確定，日后可作為基于本研究基礎(chǔ)上的進(jìn)一步研究方向。