苦皮藤薄層鑒別方法優(yōu)化

邰通芝，趙婷婷，胡成剛，唐娟，馬彬焰，羅健菱

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽，550025）

0 引言

苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim.）又名吊干麻、老虎麻、苦樹皮等，是一種多年生藤狀灌木，為衛(wèi)矛科Celastraceae南蛇藤屬Celastrus L.植物［1］。貴州有11 種南蛇藤屬植物［2,3］，其分布廣泛，資源量大，藥用時常選擇根或根皮?？嗥ぬ僦泻性S多化學(xué)成分，有倍半萜、三萜、黃酮、生物堿、皂苷等［4-7］。其中，黃酮類成分多用于治療癌癥、腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等方面［8］。劉繡華等［10］從苦皮藤藥材中分離并鑒定得到黃烷酮類化合物，分別為兒茶素和表兒茶素。據(jù)文獻(xiàn)報道［11-13］，兒茶素有清除自由基、抑制血壓、改變腸道微生物的分布、抗菌等功能，表兒茶素具有抗氧化、抑菌、抗炎、提高免疫力等作用。因此，后續(xù)在評價苦皮藤質(zhì)量時，可將這兩種單體化合物作為指標(biāo)成分。

目前對苦皮藤的化學(xué)成分的研究主要集中在石油醚和二氯甲烷方面，尤其是萜類成分，而對正丁醇部位的化合物報道較少。本課題組前期實驗得出，苦皮藤藥材正丁醇部位具有良好的抗炎活性?；诖耍疚囊钥嗥ぬ僬〈疾课惶崛〉膬翰杷爻煞譃橹笜?biāo)，對11 批不同產(chǎn)地的苦皮藤藥材進行薄層色譜定性鑒別，以期為苗藥苦皮藤藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與儀器

JCS-31001C 電子天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；KQ-5200DA 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135 中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KL-UP-Ⅲ-20T 超純水系統(tǒng)（四川宜科純水設(shè)備有限公司）；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；硅膠H 板（青島海洋化工有限公司）規(guī)格：10×10cm；正丁醇、乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、苯、二甲亞砜等試劑均為分析純。

1.2 藥材

11 批苦皮藤藥材均為課題組采收，信息見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)胡成剛教授鑒定，系衛(wèi)矛科南蛇藤屬苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim.）。憑證標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館，見圖1。

表1 11 批苦皮藤樣品編號及產(chǎn)地信息

圖1 苦皮藤圖

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取苦皮藤粉末（過20 目篩）2.0g，置于具塞錐形瓶中，加入20mL 甲醇，超聲提取30min，過濾，濾液揮干，用10ml 水制成飽和溶液，依次用等量石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取正丁醇層揮干，甲醇溶解并定容至2 ml，備用。

2.2 對照藥材溶液的制備

精密稱取苦皮藤對照藥材2.0g，按“2.1”項下方法配對照藥材溶液，即得。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取兒茶素（為實驗室自制，經(jīng)檢驗純度大于98%）對照品1mg，置于10mL 量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，制成每1 mL含有0.1mg 的溶液，作為對照品溶液。

2.4 薄層色譜條件優(yōu)化

2.4.1 薄層板類型的優(yōu)化

本文考察了GF254 硅膠板，硅膠H 板，高效GF254 硅膠板三種不同薄層板，結(jié)果顯示GF254硅膠板、高效GF254 硅膠板上的斑點拖尾較嚴(yán)重，斑點分離度不高，顏色較暗且不清晰，而硅膠H 薄層板的斑點分離度較高，目標(biāo)物的斑點清晰，故選硅膠H 板作為展開板。

2.4.2 展開系統(tǒng)的優(yōu)化

本文考察了三種不同的展開系統(tǒng)。系統(tǒng)A：乙酸乙酯：甲酸：水（20：1：0.5）；系統(tǒng)B：苯：三氯甲烷：乙酸乙酯：正丁醇：甲酸（5：4：4：1：0.5）；系統(tǒng)C：三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：甲酸（4：8：1：1）。結(jié)果顯示系統(tǒng)B 展開的斑點較A、C 兩個系統(tǒng)的分離度更高，Rf值適中，故選定苯：三氯甲烷：乙酸乙酯：正丁醇：甲酸（5：4：4：1：0.5）作為展開系統(tǒng)。

2.4.3 點樣量的優(yōu)化

本文分別考察了5 種不同的點樣量：1μL、2μL、3μL、4μL、5μL。結(jié)果顯示供試品和對照品點樣量為2μL 時的斑點清晰，故選2μL 為最佳點樣量。

2.4.4 展距的優(yōu)化

本文分別考察了展距為6cm、7cm、8cm 對實驗的影響。結(jié)果顯示，展距對薄層斑點的分離度影響不大，故選擇展距為8cm 進行展開。

2.4.5 顯色劑的優(yōu)化

本文考察了三種不同的顯色劑，分別為1%AlCl3溶液、10%硫酸溶液、5%磷鉬酸溶液。結(jié)果表明：顯色劑為5%磷鉬酸溶液的薄層板在顯色后斑點很多且分離清晰，顯色劑1%AlCl3溶液和10%硫酸溶液顏色雖然清晰，但是斑點分離度不好，故最終確定顯色劑為5%磷鉬酸溶液。

2.5 薄層鑒別方法與結(jié)果

稱取11 批不同產(chǎn)地苦皮藤藥材粉末約2.0g，按“2.1”項，制備供試品溶液，以規(guī)格10×10cm的硅膠H 板作為薄層板，點樣量為2μL，以苯：三氯甲烷：乙酸乙酯：正丁醇：甲酸（5：4：4：1：0.5）為展開劑，展開8cm 取出，晾干。噴以5%磷鉬酸溶液顯色，日光下檢視。11 份供試品色譜與對照藥材和對照品色譜相比較，在相同比移值（Rf= 0.34）位置上均顯示有相同顏色的斑點。斑點顏色的深淺，表明11 批不同產(chǎn)地苦皮藤正丁醇部位的兒茶素含量存在差異。見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地苦皮藤藥材正丁醇部位的薄層色譜圖

3 討論

基于所篩選的薄層色譜鑒別方法，對其進行專屬性、穩(wěn)定性、耐用性考察，確保方法的可靠性。

3.1 專屬性考察

精密稱取7 份樣品，按照“2.5”項下的方法進行實驗。結(jié)果顯示7 份藥材與兒茶素對照品的位置一致，表明該方法重復(fù)性好。見圖3。

圖3 苦皮藤藥材正丁醇部位專屬性考察的薄層色譜圖

3.2 穩(wěn)定性考察

取苦皮藤藥材供試品溶液，分別放置0h、4h、8h、16h、24h、48h、72h 后 點 樣， 展 開，取出，熱風(fēng)吹干，然后在日光下檢視，結(jié)果顯示樣品溶液放置72h 內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見圖4。

圖4 苦皮藤藥材正丁醇部位穩(wěn)定性考察的薄層色譜圖

3.3 耐用性考察

3.3.1 不同廠家薄層板考察

本文分別考察了購自青島永海硅膠有限公司、青島譜科分離材料有限公司、青島海洋化工有限公司、青島海洋化工廠分廠的硅膠H 板，按照“2.5”項下的方法進行苦皮藤樣品的薄層色譜鑒別。根據(jù)結(jié)果顯示：購自青島海洋化工廠分廠的硅膠H 板較其它廠家薄層板斑點分離效果好，故優(yōu)選青島海洋化工廠分廠的硅膠H板。結(jié)果見圖5。

圖5 不同廠家薄層板的苦皮藤藥材正丁醇部位的薄層色譜圖

3.3.2 不同展開溫度的考察

取供試品溶液和對照品溶液，按照“2.5”項下的方法，分別在室溫（20℃）及4℃（冰箱）條件下進行展開，取出，熱風(fēng)吹干，然后在可見光下檢視。結(jié)果顯示在室溫（20℃）下的薄層色譜圖比在4℃（冰箱）條件下的好，所以選擇在室溫下展開。結(jié)果見圖6。

圖6 不同展開溫度的苦皮藤藥材正丁醇部位的薄層色譜圖

3.3.3 飽和時間的考察

分別吸取供試品溶液和對照品溶液，按照“2.5”項下的方法，分別飽和0min，10min，20min，30min 后，展開，取出，熱風(fēng)吹干，在254nm 下檢視，然后再顯色，日光下檢視。結(jié)果顯示，飽和20min 的斑點分離度較好，因此選擇飽和20min，再進行跑板。結(jié)果見圖7。

圖7 不同飽和時間的苦皮藤藥材正丁醇部位的薄層色譜圖

4 結(jié)論

本研究采用薄層色譜法對苦皮藤正丁醇部位的黃烷醇類代表化合物兒茶素進行定性檢測，篩選出了較優(yōu)的薄層展開條件。苦皮藤正丁醇部位薄層色譜的差別主要體現(xiàn)在其兒茶素成分的含量上，含量越高斑點顏色越深，含量相對較低則亮度較暗。研究得出，貴州省貴陽市白云區(qū)下水村和貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)產(chǎn)的苦皮藤正丁醇部位兒茶素含量較高，其余9 個產(chǎn)地的兒茶素含量相對較低。

基于此，后續(xù)可以考慮將兒茶素作為苦皮藤藥材抗炎作用的檢測指標(biāo)。本研究方法具有簡便快速、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于苦皮藤藥材的簡單定性鑒別，為苦皮藤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升與建立提供了參考依據(jù)。