液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定生活污水中8種芬太尼類化合物

周潔丹，孟辰穎

（廣東粵港澳大灣區(qū)國家納米科技創(chuàng)新研究院，廣州 510535）

20 世紀60 年代，比利時化學家Paul Janseen 采用N-苯乙基-4-哌啶酮為原料人工合成芬太尼，其鎮(zhèn)痛效果相當于嗎啡的50～100 倍，后被廣泛用于手術室或重癥監(jiān)護室的麻醉與鎮(zhèn)痛[1-2]。芬太尼類物質(zhì)具有藥效強、制作成本低、易合成且易獲得新型衍生物等特點，近年來作為新精神活性物質(zhì)的第三代毒品代表之一在全球特別是歐美發(fā)達國家中泛濫[3-4]。芬太尼類物質(zhì)會產(chǎn)生較強的呼吸抑制作用，致死率高，例如美國自2013 年以來，涉及合成阿片類藥物的致死率明顯上升，2018 年死亡人數(shù)超過31 000人，且主要為芬太尼類物質(zhì)[5]。鑒于當前的芬太尼類物質(zhì)濫用問題越來越突出，各國紛紛采取不同措施對芬太尼進行管控，我國從2019 年5 月1 日起將芬太尼類物質(zhì)列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》，進行整類列管。因此，建立一種芬太尼類物質(zhì)的有效監(jiān)測方法，真實客觀反映芬太尼類物質(zhì)的實際消費現(xiàn)狀，將有助于相關部門及時制定有效的預防及管控措施。

2005 年Zuccato 等［6］首次將污水流行病學方法應用于監(jiān)測可卡因的使用及當?shù)胤欠ㄋ幬锸褂泌厔荨Ｏ噍^于傳統(tǒng)的調(diào)查方法，污水流行病學具有實時性、適用范圍廣、成本低等特點，現(xiàn)該項技術已在全球推廣［7］。污水流行病學主要基于測定特定區(qū)域內(nèi)污水中的特定物質(zhì)及代謝物濃度，進而估計特定濫用藥物消費情況，并提供有關濫用藥物消費水平、時間趨勢和空間分布的信息［8］。目前已報道采用污水流行病學方法監(jiān)控毒品的濫用情況主要集中在甲基苯丙胺、氯胺酮、海洛因、搖頭丸等常規(guī)毒品［9-11］，較少涉及新精神活性物質(zhì)特別是芬太尼類物質(zhì)［12］。采用污水流行病學方法監(jiān)控污水中藥物濫用情況，其核心部分是建立污水樣品前處理及分析方法。污水中目標物濃度較低，通常在ng/L 級別，需要先對目標物進行富集再進行儀器分析。目前文獻報道用于芬太尼類物質(zhì)的儀器分析檢測技術主要有氣相色譜-質(zhì)譜法［13］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［14］，樣本類型大部分為血液、尿液等生物樣品，缺乏針對污水樣品中芬太尼類物質(zhì)的系統(tǒng)性方法探討。

筆者利用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術，對樣品處理條件和檢測方法進行探討驗證，建立一種適用于生活污水中8種芬太尼類物質(zhì)的定量分析方法，結(jié)合污水流行病學方法，可用于監(jiān)測評估該類藥物的實際濫用情況。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：TripleQuad 4500型，美國AB Sciex公司。

全自動固相萃取儀：Fotector plus 型，?？萍瘓F(廈門)股份有限公司。

渦旋振蕩器：CubicD 型，廣州四億科學儀器有限公司。

全自動氮吹儀：AutoEVA-60 型，?？萍瘓F(廈門)股份有限公司。

純水機：Elix Essential 3 & Milli-Q IQ 7000 型，美國Millipore公司。

固相萃取柱：Oasis PRiME HLB 型，60 mg，3 mL。

芬太尼標準溶液：芬太尼(1 000 mg/L)，丙烯酰芬太尼(100 mg/L)，戊酰芬太尼(100 mg/L)，異丁酰芬太尼(100 mg/L)，呋喃芬太尼(100 mg/L)，乙酰芬太尼(50 mg/L)，奧芬太尼(100 mg/L)，對4-氟丁酰芬太尼(100 mg/L)，芬太尼-D5(100 mg/L)，美國Cerilliant公司。

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司。

甲酸：色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

其它試劑均為分析純。

實驗用水為超純水，由Millipore純水機制備。

1.2 樣品預處理

污水樣品過濾后，移取50 mL 污水樣品，加入25 μL 的200 ng/mL 芬太尼-D5 標準溶液作為內(nèi)標，分別使用4 mL 甲醇和4 mL 純水對HLB 固相萃取小柱依次進行活化，將加入內(nèi)標的污水樣品通過HLB 固相萃取小柱，上樣流量控制為2 mL/min，然后用4 mL水淋洗HLB柱，再用4 mL甲酸-甲醇混合溶液(體積比2∶98)洗脫目標物，收集洗脫液，于50 ℃氮吹至近干，加入200 μL 甲醇溶解，渦旋混勻，濾膜過濾后上機分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：Kinetex Biphenyl 柱(100 mm×3.0 mm，2.6 μm，美國Phenomenex 公司)；流動相：A 為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～1.0 min 為5%B 相，1.0～8.0 min 為5%～95% B 相，8.0～10.0 min 為95% B 相，10.0～13.0 min為5%B相；流動相流量：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 源，正離子模式；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：206.8 kPa；離子化電壓：3 000 V；霧化氣壓力：275.8 kPa；輔助氣壓力：379.2 kPa；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測(MRM)；目標物的MRM參數(shù)見表1。

表1 8種芬太尼類物質(zhì)和芬太尼-D5的MRM質(zhì)譜參數(shù)與色譜保留時間

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)分析

在一級全掃描質(zhì)譜中8種芬太尼類物質(zhì)及芬太尼-D5主要生成［M+H］+準分子離子，目標物均含有叔胺結(jié)構(gòu)，其在溶液中易獲得質(zhì)子形成［M+H］+準分子離子峰。進一步對準分子離子［M+H］+進行產(chǎn)物離子掃描，8種芬太尼類物質(zhì)的主要碎片離子為m/z188 和m/z105。其中m/z 188 的碎片離子為準分子離子β-鍵斷裂后所形成；哌啶環(huán)進一步裂解形成m/z105碎片離子［15］；m/z188的碎片離子響應較強，故選取其作為多反應監(jiān)測（MRM）的定量離子，m/z105 碎片離子為定性離子；選取芬太尼-D5 的m/z105的碎片離子作為定量分析時的監(jiān)測離子。芬太尼的一級全掃描質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 芬太尼的質(zhì)譜圖

2.2 樣品處理條件

2.2.1 固相萃取小柱選擇及樣品pH的影響

由于污水中目標物濃度較低，故采用固相萃取方法對樣品作進一步富集。目前常用于污水中濫用藥物前處理的固相萃取小柱有MCX、HLB、C18、MAX 柱等。結(jié)合芬太尼的性質(zhì)，選取Oasis PRiME MCX 和HLB 兩種固相萃取柱對8 種芬太尼類物質(zhì)進行考察。

取50 mL 空白樣品，加入25 μL 100 ng/mL 含8種目標物的混合標準溶液和25 μL 200 ng/mL 的芬太尼-D5 內(nèi)標，以獲得50 ng/L 的加標樣品（含100 ng/L 的芬太尼-D5 內(nèi)標），分別采用HLB 和MCX 進行固相萃取，通過回收率考察富集效率，同時考察樣品在不同pH條件下，HLB柱對8種芬太尼類化合物的富集效果。使用MCX 柱進行固相萃取時，提前調(diào)節(jié)樣品pH值至小于2，淋洗液改為用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗SPE柱，選用4 mL 5%氨-甲醇溶液作為洗脫液，其它步驟與HLB 柱相同。表2 為不同固相萃取柱及樣品pH 值條件下化合物的富集效率。從表2可知，兩種固相萃取小柱均能富集到8種芬太尼，當樣品pH 2 和pH 7 時，8 種芬太尼類物質(zhì)在HLB 柱上的富集效果與MCX 柱無明顯區(qū)別，用HLB柱富集pH 11樣品時，8種芬太尼的回收率明顯下降（21.6%～60.7%）?？紤]HLB 固相萃取柱填料是親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮單體按一定比例組成的大孔共聚物，可吸附酸性、中性、堿性化合物，通用性更強，便于后續(xù)目標物拓展的特點，因此選擇HLB固相萃取柱對樣品進行凈化富集，過柱前確認樣品pH 值為7（大部分污水樣品pH接近7，通常情況下無需專門調(diào)節(jié)pH值）。

表2 不同固相萃取柱及樣品pH值條件下化合物的富集效率%

2.2.2 進樣流量的選擇

采用HLB柱作為固相萃取柱，分別選擇進樣流量為1、2 mL/min，考察8種目標物的萃取效率，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可見，兩種進樣流量條件下，8種芬太尼類物質(zhì)的提取回收率無顯著性差異，考慮較高的進樣速度能節(jié)省分析時間，提高工作效率，故選擇進樣流量為2 mL/min。

圖2 不同進樣速度時8種芬太尼類物質(zhì)的回收率

2.2.3 洗脫液的選擇

分別選取4 mL甲醇、6 mL甲醇、4 mL甲酸-甲醇混合液（2∶98）為洗脫液進行對比試驗，考察不同洗脫條件下8種分析物的回收率，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，當甲醇體積增加為6 mL 后，回收率并沒有提高反而下降，原因可能是氮吹時間延長導致目標物損失。當加入4 mL甲酸-甲醇混合液（2∶98）時，回收率有所提高，故選擇4 mL 甲酸-甲醇混合液（2∶98）作為洗脫液。

圖3 不同洗脫液條件下8種芬太尼類物質(zhì)的回收率

2.2.4 復溶液的選擇

分別選用200 μL 甲醇-水溶液（1∶1）、甲醇-水溶液（7∶3）、甲醇作為復溶液，考察不同復溶液對目標物復溶能力，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，采用甲醇進行復溶時，8 種目標化合物整體回收率水平較其它兩種溶劑高，故選取200 μL甲醇作為樣品濃縮后的復溶溶劑。

圖4 不同復溶液下8種芬太尼類物質(zhì)的回收率

2.3 基質(zhì)效應

分別在2 ng/L和50 ng/L兩個添加濃度水平下，進行以下兩組實驗：以甲醇為溶劑的標準物質(zhì)溶液（含內(nèi)標）（組1）；樣品基質(zhì)中添加對應濃度標準溶液（含內(nèi)標）（組2）；絕對基質(zhì)效應=A2/A1×100%，內(nèi)標校正后的基質(zhì)效應=R2/R1×100%，其中A為目標物的峰面積，R為目標物與內(nèi)標的峰面積比。表3為8種芬太尼類物質(zhì)的基質(zhì)效應。由表3 可見，絕對基質(zhì)效應為39.8%～59.2%，說明存在明顯的基質(zhì)抑制效應。采用芬太尼-D5 進行校正后，基質(zhì)效應為70.8%～107.4%，說明芬太尼-D5可有效補償基質(zhì)效應，因此選用芬太尼-D5作為內(nèi)標，用于后續(xù)定量分析以提高準確性。

表3 8種芬太尼類物質(zhì)的基質(zhì)效應

2.4 線性范圍與檢出限

采用甲醇配制質(zhì)量濃度為1～200 ng/L 的系列混合標準工作溶液，以目標物定量離子與內(nèi)標物（芬太尼-D5）的色譜峰面積比（y）為縱坐標、目標物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，建立標準工作曲線。分別以信噪比不小于3和10確定方法的檢出限和定量限。表4為8種芬太尼類物質(zhì)的線性方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限。由表4 可知，8 種目標化合物在1～200 ng/L 線性范圍內(nèi)的相關系數(shù)為0.999 4～0.999 8，均大于0.995，表明目標物與芬太尼-D5的色譜峰面積比與目標物質(zhì)量濃度線性關系良好，8 種芬太尼類物質(zhì)的檢出限均能達到0.3 ng/L。

表4 8種芬太尼類物質(zhì)的線性方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 加標回收試驗

取空白水樣，添加含8 種目標物的混合標準溶液，添加質(zhì)量濃度水平分別為5、50、200 ng/L，按照1.2 方法使用HLB 柱進行樣品預處理后上機分析，以內(nèi)標法定量，平行測定6次，計算測定值的相對標準偏差以評估精密度，計算回收率以評估方法的準確度，試驗數(shù)據(jù)見表5。由表5可知，8種目標物測定結(jié)果的相對標準偏差為2.7%～12.6%，3個加標水平下平均回收率為73.8%～109.7%，滿足分析要求。

表5 加標回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

使用HLB柱作為固相萃取柱對生活污水中8種芬太尼類物質(zhì)進行富集凈化，采用甲酸-甲醇混合液（體積比2∶98）對目標物進行洗脫，氮吹復溶后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，內(nèi)標法進行定量分析，并在優(yōu)化后的條件下對基質(zhì)效應、線性范圍、準確度及精密度等方法技術參數(shù)進行系統(tǒng)驗證，結(jié)果表明所建立的方法具有較低的檢出限、較高的回收率及良好的精密度，適用于生活污水中芬太尼類物質(zhì)的定量檢測。