miR-519d-3p 調(diào)控TLR4 抑制脂多糖所致THP-1 源性巨噬細(xì)胞炎癥的機(jī)制研究

周垂楊 柯樂斌 高仁賢

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺部受到急性刺激后引發(fā)的嚴(yán)重肺部損傷疾病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的低氧血癥和多器官功能衰竭，在重癥監(jiān)護(hù)病房患者中造成較高的死亡率和不良的預(yù)后。盡管機(jī)械通氣和對(duì)癥治療取得了進(jìn)步，但針對(duì)ALI 患者仍沒有具體有效的治療策略[1]。ALI 過(guò)程中肺部的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和上皮細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致肺部急性損傷的關(guān)鍵因素[2]。巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子，誘導(dǎo)局部產(chǎn)生炎癥風(fēng)暴，同時(shí)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，探究其中的分子機(jī)制將有利于進(jìn)一步了解和治療ALI[3]。MicroRNA（miRNA）是由20～25 個(gè)核苷酸組成的單鏈短非編碼RNA，其主要的功能是通過(guò)與靶基因3’UTR 序列結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA 發(fā)生降解，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄后蛋白的翻譯過(guò)程。研究表明，miRNA 在調(diào)節(jié)敗血癥誘導(dǎo)的炎癥，氧化應(yīng)激和ALI 中發(fā)揮著重要的作用[4]。此前研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤miR-519d-3p 表達(dá)下調(diào)，主要功能為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和缺氧應(yīng)激[5]，而對(duì)于炎癥反應(yīng)研究較少。本研究利用LPS 構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型，探究miR-519d-3p 在ALI 病理?yè)p傷過(guò)程中對(duì)巨噬細(xì)胞的活化所引發(fā)炎癥的作用及分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株 人髓系白血病單核細(xì)胞株（THP-1）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院（目錄號(hào)BNCC342033）。培養(yǎng)條件：RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%熱滅活胎牛血清和1%雙抗）。

1.2試 劑 脂多糖（LPS）（批號(hào)46683）、佛波酯（Phorbol ester，PMA）（批號(hào)54878）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號(hào)95465）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號(hào)51483）、白介素-6（interleukin6，IL-6）等炎癥因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。Trizol，熒光定量PCR 試劑購(gòu)自日本Takara 公司；一步法miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司（批號(hào)Q1014L）；Lipofectamine 2000 購(gòu)自Life Technologies（批號(hào)11668030）?？贵wp-p65（批號(hào)a165648）；T-p65（批 號(hào)355648）；p-IκBα（批 號(hào)19812）；T-IκBα（批 號(hào)498414）；p-RIP3（批 號(hào)a29104）；受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1，批號(hào)a18498）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)19842）為內(nèi)參蛋白，購(gòu)自杭州戴格生物技術(shù)有限公司。el-miR-519d-3p 及antago-NC、miR-519d-3p mimic 及mimic-NC，siNC 及siTLR4均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成提供。PCR 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成提供。引物序列：miR-519d-3p：F：5′-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3′，R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1THP-1 細(xì)胞誘導(dǎo)及LPS 炎癥模型建立 THP-1細(xì)胞用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，并以3×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)基中添加100ng/mL 佛波酯（PMA，用DMSO 溶解）作用48h，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。每孔中加入200ng/mL LPS 刺激構(gòu)建炎癥模型，對(duì)照組添加磷酸鹽緩沖液（PBS），于處理后12h 后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.2熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)THP-1 細(xì)胞miR-519d-3p 表達(dá) 將上述LPS 處理后的細(xì)胞利用Trizol 提取總RNA，并利用一步法miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)為cDNA，后續(xù)利用TB Green 進(jìn)行熒光定量PCR，以U6 為內(nèi)參，檢測(cè)miR-519d-3p 表達(dá)水平，以2-△△Ct 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 THP-1 細(xì)胞經(jīng)PMA 誘導(dǎo)48h 貼壁后，按Lipofectamine 2000 說(shuō)明書轉(zhuǎn)染antago-miR-519d -3p 及antago -NC、miR -519d -3p mimic 及mimic-NC，轉(zhuǎn)染方法如下：取2 個(gè)1.5mL 離心管分別加入500μL opti-MEN 培養(yǎng)基，兩管中分別加入1μg的質(zhì)粒或2μL Lipofectamine 2000 室溫靜置20min，之后加入到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6h 后換液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用LPS 刺激12h，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。siTLR4 的轉(zhuǎn)染同上。

2.4巨噬細(xì)胞炎癥水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。具體方法按說(shuō)明書操作。

2.5蛋白免疫印跡測(cè)TLR4、p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平 將處理好的細(xì)胞用RIPA 裂解液裂解提取全蛋白，進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western blot），經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，之后利用5%牛奶封閉，4℃孵育一抗過(guò)夜，次日TBS-T 洗去未結(jié)合的一抗，加入二抗室溫孵育1h，在PVDF 膜上滴加超敏反應(yīng)底物進(jìn)行曝光，利用掃膜儀進(jìn)行成像分析，檢測(cè)Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、磷酸化核因子κB 蛋白（phospho nuclear factor kappa-B，p-NF-κB/p-p65）、總核因子κB 蛋白（total nuclear factor kappa-B，T-NF-κB/T-p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白（phospho inhibitor of NF-κB，p-IκBα）、總NF-κB 抑制蛋白（total inhibitor of NF-κB，T-IκBα）蛋白水平。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1miR-519d-3p 在LPS 誘導(dǎo)的THP-1 源巨噬細(xì)胞表達(dá) 與對(duì)照組（1.00±0.25）比較，LPS 組（1.85±0.10）細(xì)胞內(nèi)miR-519d-3p 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.2過(guò)表達(dá)miR-519d-3p 拮抗劑可抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上清液炎癥因子釋放 與antago-NC 組比較，LPS+antago-NC 組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型成功。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antagomiR-519d-3p 組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)量（）

表1 各組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)量（）

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與antago-NC 組比較，aP＜0.05；與LPS+antago-NC 組比較，bP＜0.05

3.3miR-519d-3p 拮抗劑抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p-p65、p-IκBα 活化 與antago-NC 組比較，LPS+antago-NC 組p-p65、p-IκBα 蛋白活化水平明顯升高，而T-p65、T-IκBα 無(wú)明顯變化。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antago-miR-519d-3p 組細(xì)胞中pp65、p-IκBα 蛋白活化水平明顯降低。見圖1。

圖1 各組巨噬細(xì)胞p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平

3.4miR-519d-3p 調(diào)控TRL4 表達(dá) 與antago-NC比較，LPS+antago-NC 組TLR4 蛋白水平明顯升高。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antagomiR-519d-3p組細(xì)胞TLR4 蛋白水平明顯降低。見圖2。

圖2 各組巨噬細(xì)胞TLR4 表達(dá)情況

3.5敲降TRL4 抑制巨噬細(xì)胞p-p65、p-IκBα 活化 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-519d-3p 通過(guò)TLR4 調(diào)控下游p-p65、p-IκBα 活化，我們?cè)诰奘杉?xì)胞中敲低TLR4，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-519d-3p mimic，經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后，檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與LPS+siScr+mimic-NC組比較，LPS+siTLR4+mimic-NC 組pp65、p-IκBα 活化水平明顯降低，而LPS+siScr+miR-519d-3p mimic 組p-p65、p-IκBα 活化水平明顯升高。與LPS+siScr+miR-519d-3p mimic 組比較，LPS+siTLR4+miR-519d-3p mimic 組p-p65、p-IκBα 活化水平明顯降低。見圖3。

圖3 各組巨噬細(xì)胞TLR4、p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平

4 討論

ALI 中巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子的過(guò)度釋放以及富含蛋白質(zhì)的液體的溢出，加劇局部組織損傷破壞。巨噬細(xì)胞活化方式分為M1 促炎型和M2 抑炎型，在炎癥過(guò)程中，M1 和M2 參與調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答及各種炎癥反應(yīng)。炎癥早期，巨噬細(xì)胞主要極化為M1 型起到清除病原微生物的作用，而隨著炎癥發(fā)展，后期則以M2 型為主，發(fā)揮抑炎作用，促進(jìn)損傷修復(fù)[6]。LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為M1型是研究炎癥的經(jīng)典細(xì)胞模型，因此，在本研究中，我們利用LPS 刺激的THP-1 源性巨噬細(xì)胞炎癥模型，研究miR-519d-3p 在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ALI 炎癥中的作用和機(jī)制。

近年研究表明，miRNA 可以用作疾病的生物標(biāo)志物和治療方法，在癌癥、過(guò)敏性疾病[7]、心血管疾病[8]、糖尿病[9]等疾病中均有應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-519d-3p在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）等信號(hào)通路的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、遷移、侵襲[10-13]。此外miR-519d-3p 梗死心肌組織表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）相互作用，加劇缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[14]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在ALI中起重要作用，miRNA 的表達(dá)與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，且基于其在血液、組織等樣本中表達(dá)穩(wěn)定，miRNA 有望成為ALI 新的生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，細(xì)胞miR-519d-3p 表達(dá)明顯上調(diào)，提示miR-519d-3p 可能在ALI 中發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞在LPS 刺激作用下，TLR4 受體表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)TLR4 信號(hào)激活后可最終導(dǎo)致下游NFκB 信號(hào)異?；罨?，p-p65、p-IκBα 磷酸化水平增加，促進(jìn)分泌大量TNF-α、IL-6、IL-1β[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞抑制miR-519d-3p 可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4 受體表達(dá)上調(diào)，降低的p-p65、p-IκBα 活化水平，減少促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的分泌。表明miR-519d-3p 可能通過(guò)抑制TLR4 的表達(dá)而降低巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-519d-3p 在ALI 中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-519d-3p 可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，該調(diào)控可能通過(guò)抑制TLR4 表達(dá)水平完成。提示miR-519d-3p 可能作為ALI 診斷治療過(guò)程的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。