基于JAK2/STAT3的龍膽苦苷通路調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞極化機(jī)制研究△

謝彥媛，邵穎穎，韓偉超，謝保城，何淑芬

廣東省東莞市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 東莞 523059

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）具有病情反復(fù)、難以痊愈的特點(diǎn)，是一種發(fā)病機(jī)制尚未明確的腸道炎癥性疾病。中醫(yī)認(rèn)為，UC 屬于“泄瀉”“久痢”范疇，常表現(xiàn)為濕熱蘊(yùn)結(jié)于大腸而出現(xiàn)大便稀薄，故常用清熱利濕中藥對(duì)癥治療[1]。已有研究表明，UC與腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌有密切的聯(lián)系。臨床研究表明，由于腸道中炎性環(huán)境的長(zhǎng)期存在，炎癥性腸?。╥nflammation bowel disease，IBD）惡化癌變腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌及患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[2-3]。目前，對(duì)于UC 的治療藥物主要包括免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和5-氨基水楊酸等[4]，但有限的治療效果及長(zhǎng)期服藥所導(dǎo)致的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響了患者的康復(fù)進(jìn)程。因此，尋找一種有效、不良反應(yīng)小的藥物尤為迫切。

巨噬細(xì)胞與UC 病程的發(fā)展密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有可塑性和異質(zhì)性，可極化為能夠分泌促炎因子的M1 型巨噬細(xì)胞和能夠分泌抗炎因子的M2 型巨噬細(xì)胞。在UC 發(fā)病早期，巨噬細(xì)胞被激活并向M1型巨噬細(xì)胞極化，通過(guò)分泌促炎因子和趨化因子，破壞結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，并且能夠募集大量中性粒細(xì)胞到炎癥發(fā)生位置，加劇炎癥的發(fā)展[5]。M2型巨噬細(xì)胞則能通過(guò)分泌抗炎因子，抑制單核-巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮和炎癥因子的水平，緩解局部環(huán)境炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。此外，M2型巨噬細(xì)胞能夠發(fā)揮吞噬和清除病原體的作用，抑制炎癥的進(jìn)一步加劇[6]。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化對(duì)于UC 的治療及預(yù)后具有重要的意義。

龍膽是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，為清肝膽濕熱、瀉下焦郁火常用中藥[7]。龍膽苦苷為龍膽的主要活性成分，屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍膽苦苷具有抗炎、抗腫瘤、健胃和降血壓等作用[8-9]。已有研究表明，龍膽苦苷在多種炎癥性疾病的治療中均發(fā)揮了積極的作用，如膿毒血癥和糖尿病腎炎[10-11]。趙文娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷能夠明顯改善2，4，6-三硝基苯磺酸-乙醇溶液誘導(dǎo)的UC 小鼠腸道的炎性環(huán)境，減少結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血水腫，改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷。綜上所述，龍膽苦苷抗UC 具有良好的療效?；诖?，本研究探討并分析龍膽苦苷對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，進(jìn)而對(duì)龍膽苦苷抗小鼠UC做初步機(jī)制闡述。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠60只，體質(zhì)量20～23 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0005，動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)別動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為45%～55%，每日光照12 h，動(dòng)物自由食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲用蒸餾水。

1.2 儀器

HP300 型組織脫水機(jī)（奧華科技有限公司）；ES30 型組織包埋機(jī)（華速科技有限公司）；CU600型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊有限公司）；Elx808型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（廣州吉源生物科技有限公司）；ZE5 型流式細(xì)胞儀、DYC-Mini1 型垂直電泳槽、E1101 型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 生物科技有限公司）；Nano Drop 2000c 型超微量分光光度計(jì)、CFX96 型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)賽默飛生物科技有限公司）；Tanon4600 型化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 試藥

龍膽苦苷（批號(hào)：20200703-2，純度≥98%）、硫酸葡聚糖（DSS，批號(hào)：H17061909）均購(gòu)于默克Sigma Aldrich公司；白細(xì)胞介素-12（IL-12）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200877）、IL-10 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200427）、IL-6 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200219）、IL-4 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200214）均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（批號(hào)：7913216）、CD206 抗體（批號(hào)：7246276）、酪氨酸激酶2（JAK2）抗體（批號(hào)：1372864）、p-JAK2 抗體（批號(hào)：2563073）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抗體（批號(hào)：4729976）、p-STAT3 抗體（批號(hào)：2944710）均購(gòu)于美國(guó)CST 公司；APC anti-mouse CD45 抗體（批號(hào)：4332602）、PerCP-Cy 5.5 anti-mouse F4/80 抗體（批號(hào)：9273801）、APC/Cy7 anti-mouse CD206 抗 體（批號(hào)：40037611）、PE anti-mouse iNOS 抗體（批號(hào)：9928710）均購(gòu)于美國(guó)BioLegend 公司；FITC anti-mouse CD11b 抗體（批號(hào)：4127642，Invitrogen公司）；磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號(hào)：8884，美國(guó)CST 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012S）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

BALB/c 雄性小鼠60 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組及龍膽苦苷低、中、高劑量（25、50、100 mg·kg-1）組，每組12只。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠每天給予蒸餾水自由飲用，其余組小鼠每天給予2.5% DSS 溶液自由飲用，制備UC模型，以造模小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的稀便、便血和體質(zhì)量明顯下降為造模成功。造模的同時(shí)，龍膽苦苷低、中、高劑量組小鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，對(duì)照組與模型組同時(shí)灌胃給予等體積蒸餾水，持續(xù)7 d。每天記錄小鼠的體質(zhì)量變化、稀便和血便程度，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，按公式（1）作疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分記錄，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Chen 等[13]的研究，見(jiàn)表1。

表1 UC模型小鼠DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 血液和臟器樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行乙醚麻醉，眼眶取血，4 ℃、3500×g離心15 min 得血清，血清保存于-80 ℃冰箱中備用。小鼠脫頸椎處死后解剖，以回盲部下端為起始，以肛門(mén)端為結(jié)束，小心剝離結(jié)腸，將結(jié)腸平鋪舒展，沿腸系膜方向（縱向）剖開(kāi)使腸腔暴露，剔除內(nèi)容物，使用電子游標(biāo)卡尺對(duì)回盲部至肛門(mén)的結(jié)腸進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量并拍照記錄，對(duì)靠近肛門(mén)段的結(jié)腸進(jìn)行厚度測(cè)量。

2.3 炎癥因子測(cè)定

取小鼠結(jié)腸組織約0.4 g加入到含有磷酸鹽緩沖液（PBS）500 μL 的離心管中，勻漿，將所得勻漿液3500×g離心10 min 得上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)小鼠血清和結(jié)腸上清液中IL-10、IL-4、IL-6和IL-12水平。

2.4 相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定

將結(jié)腸組織加裂解液于冰上裂解30 min 提取細(xì)胞總蛋白，12 000 r·min-1（離心半徑6.3 cm）離心15 min，取上清液，采用BCA 試劑盒測(cè)定結(jié)腸組織蛋白質(zhì)量濃度；經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗（p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、iNOS、CD206 和GAPDH）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日加入相應(yīng)二抗，孵育1 h，隨后顯色曝光，拍照并保存相應(yīng)蛋白條帶，使用Image J軟件分析蛋白和磷酸化蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值校準(zhǔn)。

2.5 巨噬細(xì)胞亞群的測(cè)定

截取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所得結(jié)腸1 cm，在預(yù)冷的PBS中，充分研磨后過(guò)200 目濾膜到PBS 中，均勻吹打得結(jié)腸單細(xì)胞懸液。將制備的結(jié)腸單細(xì)胞懸液以1×106個(gè)收集于流式管中，加入CD45 抗體0.5 μL、CD11b 抗體1 μL、F4/80 抗體0.5 μL 和CD206 抗體1 μL，混勻，37 ℃避光孵育25 min。待表面抗體孵育完成后，使用冷的PBS 洗滌細(xì)胞1 次。洗滌后每份流式管加入配置好的流式破膜固定液1 mL 并脈沖渦旋，室溫孵育60 min。每份流式管添加透化液2 mL，室溫條件下800 r·min-1離心5 min（離心半徑6.3 cm），棄上清。每份流式樣品重懸后添加iNOS（PE，3.5 μL）抗體，室溫避光孵育30 min。每份流式管添加透化液2 mL，室溫條件800 r·min-1離心5 min（離心半徑6.3 cm），棄上清，PBS 洗滌1 次。最后將樣品重懸于PBS 300 μL 中，使用流式細(xì)胞儀分析樣品。其中CD45 和CD11b 抗體為中性粒細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物，F(xiàn)4/80為巨噬細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物，iNOS 為M1 型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物，CD206為M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后DAI評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠DAI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量（25、50、100 mg·kg-1）均能顯著下調(diào)小鼠DAI 評(píng)分（P＜0.01），作用呈劑量依賴(lài)性。此外，模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)第五、六、七天均有1 只小鼠因潰瘍嚴(yán)重而死亡，龍膽苦苷低劑量組有1 只小鼠在實(shí)驗(yàn)第七天因潰瘍嚴(yán)重而發(fā)生死亡，2 組小鼠病死率分別為25.0%、8.3%。動(dòng)物死亡后的DAI 評(píng)分、血清和臟器數(shù)據(jù)不納入后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。龍膽苦苷各劑量均能一定程度降低結(jié)腸炎小鼠病死率，見(jiàn)圖1。

圖1 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響（, n=9～12）

3.2 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠結(jié)腸病變的影響

從結(jié)腸病變的結(jié)果可觀察到，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短，且發(fā)生腫脹。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結(jié)腸縮短和腫脹均有一定程度的緩解，見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，DSS能夠誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短（P＜0.01），且厚度顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結(jié)腸縮短和結(jié)腸厚度增加的病理變化均發(fā)生顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），且改善作用呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖3。由此可見(jiàn)，龍膽苦苷能顯著改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸損傷。

圖2 各組小鼠結(jié)腸形態(tài)

圖3 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠結(jié)腸的影響（, n=9～12）

3.3 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠腸道炎性環(huán)境的影響

結(jié)腸中炎性因子的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸中抗炎因子IL-10和IL-4表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，龍膽苦苷各質(zhì)量濃度組小鼠結(jié)腸中抗炎因子IL-10和IL-4表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸中促炎因子IL-6 和IL-12 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結(jié)腸中促炎因子IL-6 和IL-12 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。此外，血清中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平變化與結(jié)腸組織中的趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖4?；诖丝傻?，龍膽苦苷能夠緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎性環(huán)境，恢復(fù)結(jié)腸抗炎/促炎平衡，并且此作用具有劑量依賴(lài)性。

圖4 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠腸道炎性環(huán)境的影響（, n=9～12）

3.4 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠巨噬細(xì)胞極化的影響

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠iNOS+巨噬細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01），同時(shí)CD206+型巨噬細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量均能夠顯著降低小鼠結(jié)腸中iNOS+型巨噬細(xì)胞比例（P＜0.01），且明顯上調(diào)CD206+型巨噬細(xì)胞比例（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖5。此外，蛋白免疫印跡法（Western blot）的結(jié)果說(shuō)明，龍膽苦苷各劑量均能提高CD206 的表達(dá)而降低iNOS 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，龍膽苦苷可調(diào)控結(jié)腸巨噬細(xì)胞極化，并使巨噬細(xì)胞向具有抗炎作用的M2 型巨噬細(xì)胞的趨勢(shì)極化。

圖5 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠巨噬細(xì)胞極化的影響（, n=4）

圖6 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠巨噬細(xì)胞iNOS和CD206蛋白表達(dá)的影響（, n=4）

3.5 龍膽苦苷對(duì)JAK2/STAT3通路磷酸化的影響

結(jié)果顯示，龍膽苦苷對(duì)JAK2 和STAT3 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯的影響，但能明顯下調(diào)p-JAK2 蛋白（P＜0.05）及p-STAT3（P＜0.05）蛋白的表達(dá)水平（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷可能通過(guò)下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化表達(dá)影響巨噬細(xì)胞極化。

圖7 龍膽苦苷對(duì)UC小鼠巨噬細(xì)胞JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化的影響（, n=4）

4 討論

龍膽苦苷是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴中藥材龍膽的重要活性成分之一[7]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)DSS 誘導(dǎo)的UC小鼠給予龍膽苦苷干預(yù)，能夠明顯改善小鼠結(jié)腸損傷，減輕腸道炎癥，并且作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)JAK2/STAT3 通路的磷酸化表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)腸道中M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量，下調(diào)M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向從而改善腸道炎性環(huán)境有關(guān)。

UC的中醫(yī)證候包括大腸濕熱、脾虛濕蘊(yùn)、寒熱錯(cuò)雜、脾腎陽(yáng)虛、肝郁脾虛、熱毒熾盛和陰血虧虛。因此治療UC 應(yīng)以清熱利濕、溫陽(yáng)化濕為主[1]。龍膽性寒，味苦，清下焦郁火的功效尤為顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，龍膽具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛的作用[14]。UC 屬于炎癥性腸病的范疇。病理研究顯示UC 患者腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)受損，從而影響免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道微環(huán)境受破壞，發(fā)生腸黏膜局部潰瘍。在本研究中，DSS 能夠誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)稀便、血便的癥狀，并且對(duì)結(jié)腸進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)DSS能夠縮短結(jié)腸長(zhǎng)度，并使結(jié)腸厚度增加。利用疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)價(jià)UC模型小鼠造模成功。同時(shí)，小鼠腸道屏障結(jié)構(gòu)受損，腸道中抗炎因子IL-4和IL-10表達(dá)水平下降，促炎因子IL-6和IL-12表達(dá)上調(diào)，反映了UC 的發(fā)生。對(duì)UC 模型小鼠給予不同劑量的龍膽苦苷之后，其狀態(tài)發(fā)生明顯改變，稀便、血便癥狀減輕，DAI評(píng)分出現(xiàn)明顯的下降。與此同時(shí)，龍膽苦苷能夠下調(diào)UC小鼠腸道的促炎因子表達(dá)，并且上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，緩解結(jié)腸縮短以及結(jié)腸厚度增加。值得留意的是，龍膽苦苷改善DAI、緩解腸道受損及腸道炎癥的程度與給藥劑量呈正比。綜上，龍膽苦苷治療UC具有顯著的療效，可明顯改善稀便、血便，并且能夠緩解結(jié)腸損傷，改善腸道炎性環(huán)境。

巨噬細(xì)胞是參與體液免疫和細(xì)胞免疫的一種重要的免疫細(xì)胞，極具可塑性和異質(zhì)性。當(dāng)機(jī)體局部環(huán)境受刺激時(shí)，成熟的巨噬細(xì)胞可進(jìn)行極化以適應(yīng)環(huán)境的變化[15]。根據(jù)極化后不同的細(xì)胞表明標(biāo)記物及不同的細(xì)胞功能，可將極化后的巨噬細(xì)胞分為由干擾素-γ和脂多糖介導(dǎo)分化的M1 經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞和由白細(xì)胞介素和糖皮質(zhì)激素等激活的M2 替代活化型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生大量促炎因子參與初始炎癥反應(yīng)，如IL-6和IL-12，并發(fā)揮吞噬、清除入侵微生物和抑制腫瘤發(fā)生免疫逃逸的功能。M2 型巨噬細(xì)胞則可分泌大量抗炎因子如IL-10 和IL-4，并能促進(jìn)血管生成，加速傷口愈合[6,16-17]。由于M1 和M2 型巨噬細(xì)胞作為2 種對(duì)炎癥有著不同影響的巨噬細(xì)胞亞群，因此巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在多種炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用，巨噬細(xì)胞極化也被認(rèn)為是調(diào)控炎癥發(fā)展進(jìn)程中的重要手段[18-19]，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化可運(yùn)用于多種炎癥性疾病以及炎癥導(dǎo)致的癌變研究中[20-25]。本研究中，UC 小鼠稀便、血便嚴(yán)重，結(jié)腸長(zhǎng)度和厚度的改變以及促炎因子的增加表明結(jié)腸發(fā)生嚴(yán)重的病理變化，伴有大量的促炎因子浸潤(rùn)，提示腸道中巨噬細(xì)胞極化方向更趨向于M1 型巨噬細(xì)胞，造成促炎/抗炎平衡破壞。對(duì)UC 小鼠給予龍膽苦苷之后，M2 型巨噬細(xì)胞比例上調(diào)且CD206 蛋白表達(dá)水平上升，提示腸道中巨噬細(xì)胞極化趨勢(shì)傾向于向M2 型巨噬細(xì)胞極化。龍膽苦苷恢復(fù)腸道中抗炎/促炎平衡，同時(shí)修復(fù)腸道損傷，改善小鼠稀便血便。結(jié)果提示龍膽苦苷對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的治療作用可能通過(guò)調(diào)控腸道中巨噬細(xì)胞的極化實(shí)現(xiàn)的。除此之外，炎癥因子和巨噬細(xì)胞基因差異性表達(dá)的結(jié)果顯示龍膽苦苷對(duì)炎癥的緩解和對(duì)巨噬細(xì)胞的極化具有劑量依賴(lài)性，即隨著龍膽苦苷劑量上調(diào)，作用越顯著。本研究結(jié)果顯示，龍膽苦苷高劑量（100 mg·kg-1）治療效果最好，提示龍膽苦苷劑量大于100 mg·kg-1或許能發(fā)揮更明顯的治療UC效果。

巨噬細(xì)胞的極化和功能調(diào)節(jié)是多種因素共同作用下完成的，涉及多種信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[26]。其中，最常見(jiàn)的為JAK2/STAT3 通路，JAK2是一種蛋白酪氨酸激酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中并調(diào)節(jié)下游STATs基因表達(dá)，其中可直接影響STAT3 的磷酸化水平，從而影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[27]。已有研究表明，JAK2/STAT3通路可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞的極化，生成和分泌大量促炎因子，其潛在的機(jī)制可能與核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路相關(guān)[25]。在本研究中，龍膽苦苷各劑量對(duì)JAK2 及STAT3 蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯影響，但能顯著下調(diào)蛋白磷酸化水平，提示通路的表達(dá)受到龍膽苦苷的抑制，進(jìn)而減緩巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化的趨勢(shì)。與巨噬細(xì)胞極化的檢測(cè)相一致，龍膽苦苷100 mg·kg-1對(duì)JAK2/STAT3通路磷酸化水平抑制最明顯，進(jìn)一步證實(shí)高劑量龍膽苦苷可更有效地調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化趨勢(shì)。

綜上所述，龍膽苦苷通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路的磷酸化水平，促使巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞極化，從而下調(diào)腸道促炎因子的分泌，上調(diào)抗炎因子水平，緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷以及腸道炎癥，抑制UC 的發(fā)展。然而本研究對(duì)于龍膽苦苷調(diào)控巨噬細(xì)胞極化治療潰瘍性UC 只作初步探討，進(jìn)一步探討龍膽苦苷治療UC 的機(jī)制，仍然需要進(jìn)行體外細(xì)胞和在體動(dòng)物的正向和反向驗(yàn)證。