多重PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)兒童呼吸道病原體方法的建立及應(yīng)用

馬菁菁，陶桂香，陳 倩*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，江蘇 南京 210029

［關(guān)鍵字］兒童；呼吸道病原體；多重PCR；毛細(xì)管電泳

急性呼吸道感染（acute respiratory infections，ARI）是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病，ARI 的發(fā)病率占兒童呼吸系統(tǒng)疾病首位［1-3］，據(jù)統(tǒng)計(jì)，5歲以下兒童每年發(fā)生的600 萬例死亡中有100 萬例是由ARI 引起的［4-5］，給兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和身體健康帶來了較大危害。許多病毒和細(xì)菌都能引起ARI，并且由于患者可能攜帶不止一種病原體，不同病毒之間以及病毒和細(xì)菌之間的臨床體征相互重疊，往往使得僅基于臨床表現(xiàn)的病因診斷變得困難，無法確定致病原因，導(dǎo)致抗生素治療無效，造成抗生素濫用以及醫(yī)源性交叉感染［6-7］，因此需要對(duì)呼吸道病原體進(jìn)行快速檢測(cè)，從而幫助診斷和準(zhǔn)確用藥。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)呼吸道病原體檢測(cè)的方法較多，主要包括傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法以及新興的分子生物學(xué)檢測(cè)方法［8-10］。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長(zhǎng)；免疫學(xué)方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染；單病原體的PCR 方法檢測(cè)通量較低。隨著病原體分子診斷技術(shù)的不斷提高，多重核酸擴(kuò)增檢測(cè)，已經(jīng)被逐漸運(yùn)用在臨床檢驗(yàn)過程中，它是一種速度快、靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，可以顯著減少檢測(cè)操作時(shí)間和成本，并且能夠快速得到結(jié)果［11］。此外，多重核酸擴(kuò)增檢測(cè)能夠提供多目標(biāo)產(chǎn)物的共擴(kuò)增，從而能夠?qū)粑兰膊』旌细腥镜念A(yù)后和復(fù)發(fā)提供重要信息。但是，目前通常使用的多重PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)病原體的種類有限：Zhang 等［12］的研究只能檢測(cè)大腸桿菌的各種亞型，不能檢測(cè)多種病原體；劉曉萌等［13］對(duì)肺炎常見病原菌的多重PCR 檢測(cè)，僅能檢測(cè)肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌3 種病原體。這一現(xiàn)狀導(dǎo)致在快速鑒別病原體方面存在較大困難，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床治療。

本研究以兒童常見呼吸道病原體：肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.Ae）、陰溝桿菌（Enterobacter cloacae，Ecl）、白色假絲酵母菌（Candida albicans，Cal）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Aba）作為診斷目標(biāo)，建立多重PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳法檢測(cè)體系，以提高兒童呼吸道感染診斷的效率。

1 材料和方法

1.1 材料

引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，磁珠法病毒總核酸提取試劑盒（西安天隆科技有限公司），毛細(xì)管電泳儀（Bioptic，江蘇光鼎生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)象

隨機(jī)收集南京市兒童醫(yī)院2020年11—12月266例兒童呼吸道病原體臨床檢測(cè)剩余樣本。

1.2.2 痰液處理及核酸提取

本研究創(chuàng)造性使用了一種高效核酸釋放劑，使得細(xì)菌的細(xì)胞壁以及病毒的核衣殼充分破裂，核酸更加充分地釋放出來。同時(shí)釋放的核酸尤其是一些病毒的核酸是RNA，RNA 非常不穩(wěn)定，通過加入RNA 酶抑制劑和RNA 保護(hù)劑等，最大程度防止RNA 的降解；又針對(duì)細(xì)菌核酸提取，在裂解液中加chelex-100 提高核酸純度。通過以上方式的優(yōu)化，在痰液樣本被充分液化的基礎(chǔ)上，樣本中的細(xì)菌或病毒被充分純化，同時(shí)將后續(xù)核酸的提取時(shí)間從傳統(tǒng)的柱膜法或磁珠法的30～60 min縮短到僅需約8 min，核酸釋放量也是傳統(tǒng)方法的兩倍左右。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增體系及條件建立

我們利用相同的嵌合引物來設(shè)計(jì)特異引物，首先確定基本的PCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行單重PCR，篩選出最佳基因特異性引物濃度。按照上述引物濃度以及PCR促進(jìn)劑濃度［四甲基氯化銨（TMAC）、甜菜堿、BSA、四甲基亞砜（TMSO）、海藻糖等］，進(jìn)行了多重?cái)U(kuò)增體系的摸索，最終建立起一個(gè)7重?cái)U(kuò)增體系，分別包括肺炎支原體、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、陰溝桿菌、白色假絲酵母菌、鮑曼不動(dòng)桿菌。其引物設(shè)計(jì)如表1所示。擴(kuò)增體系為50 μL：ddH2O 34.5 μL，10×Taq buffer 5 μL，dNTP Mix1μL，Primer Pool 4.0 μL，模 板5 μL，Taq 酶0.5 μL。單重PCR擴(kuò)增條件方案：95 ℃5 min；95 ℃15 s、55～60 ℃40 s、72 ℃30 s（10個(gè)循環(huán)）；95 ℃15 s、55～60 ℃30 s、72 ℃30 s（20 個(gè)循環(huán)）；72 ℃5 min。多重PCR 擴(kuò)增條件方案：95 ℃5 min；95 ℃15 s、58 ℃40 s、72 ℃30 s（10 個(gè)循環(huán)）；95 ℃15 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s（20個(gè)循環(huán)）；72 ℃5 min。

表1 本文所使用引物

1.2.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

取1 μL 擴(kuò)增后核酸樣本，使用毛細(xì)管電泳儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 臨床樣本檢測(cè)

采用上述建立方法檢測(cè)266例臨床檢測(cè)剩余樣本。

2 結(jié)果

2.1 7 種呼吸道病原體單重PCR 產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析

對(duì)7 種呼吸道病原體：MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba 分別進(jìn)行單重PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后均檢測(cè)到相應(yīng)片段，無明顯的感染雜峰出現(xiàn)，引物設(shè)計(jì)合理（圖1）。

圖1 7種呼吸道病原體單重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 7 種呼吸道病原體多重PCR 擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析

對(duì)7 種呼吸道病原體逐步進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，調(diào)整擴(kuò)增程序以及引物濃度，至無非特異性擴(kuò)增條帶，最終建立一個(gè)7種呼吸道病原體多重PCR擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳的檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，均檢測(cè)到對(duì)應(yīng)片段，無明顯雜峰出現(xiàn)（圖2）。

圖2 7種呼吸道病原體多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)266例兒童呼吸道病原體痰液樣本，進(jìn)行7重PCR擴(kuò)增并結(jié)合毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果顯示37例陽性，其中：8例肺炎支原體陽性（陽性率為3.0%），2例白色假絲酵母陽性（陽性率為0.8%），10 例金黃色葡萄球菌陽性（陽性率為3.8%），8 例肺炎克雷伯菌陽性（陽性率為3.0%），2例銅綠假單胞菌陽性（陽性率為0.8%），1 例陰溝桿菌復(fù)合群陽性（陽性率為0.4%），3例鮑曼不動(dòng)桿菌陽性（陽性率為1.1%）。該檢測(cè)結(jié)果同痰培養(yǎng)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（因肺炎支原體較難培養(yǎng)，故與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果作對(duì)比）比較，敏感性提高，多檢測(cè)3例（表2）。

表2 兩種檢測(cè)方法陽性對(duì)比 （n）

2.4 多重PCR 與單重PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)的比較

在266 例兒童呼吸道病原體痰液標(biāo)本中，隨機(jī)選擇100 例，分別進(jìn)行7 種病原體的單重PCR 擴(kuò)增并結(jié)合毛細(xì)管電泳和多重PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析，結(jié)果一致（表3）。

表3 多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳與單重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法對(duì)比 （n）

3 討論

引起兒童ARI 的病原體種類較多，涉及多種病毒和細(xì)菌，且臨床癥狀表現(xiàn)相似，因此臨床醫(yī)生很難根據(jù)臨床癥狀做出準(zhǔn)確的病因診斷，如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出患者所感染的呼吸道病原體一直是臨床診斷面臨的難點(diǎn)［14］。本研究建立了7種呼吸道病原體PCR擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳分析的技術(shù)。

這種檢測(cè)方法可以一次性檢測(cè)并區(qū)分多種呼吸道感染的病原體。本研究選取各種呼吸道感染病原體的保守序列進(jìn)行PCR分析，在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)注意不同病原體產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異化，以便于毛細(xì)管電泳的直觀判斷分析。陽性參考品經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，條帶長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度基本一致，未出現(xiàn)明顯非特異性檢測(cè)峰；利用此方法檢測(cè)了2020年11—12 月隨機(jī)收集的266 例兒童呼吸道病原體痰液樣本，各病原體的檢出率高于痰培養(yǎng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，且檢測(cè)時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于細(xì)菌培養(yǎng)，能夠滿足臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的需求。除此之外，本研究在266 例上述標(biāo)本中，隨機(jī)選取100例標(biāo)本，進(jìn)行7種病原體單重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)，該結(jié)果與多重PCR結(jié)果完全一致，進(jìn)一步佐證了多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)的可靠性。

多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)，在發(fā)揮毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)的前提下，最大程度降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率［15］，未來該技術(shù)值得在臨床大范圍推廣和應(yīng)用。