GeneXpert法與涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的比較研究

張海霞，張 覓，騰曉燕，劉冰雪，肖園園，黃 菁

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 南京 210003

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，由于耐藥菌株的產(chǎn)生和社會(huì)流動(dòng)人口的增多等生物學(xué)和社會(huì)學(xué)因素，結(jié)核病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO 報(bào)道，目前我國仍為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，2017 年估算發(fā)病91 萬（全球總發(fā)患者數(shù)排第2 位的國家），實(shí)際登記發(fā)病77.8萬，約13.2萬患者被遺漏，而我國登記的結(jié)核患者中有病原依據(jù)的僅為31%［1］。因此如何快速而準(zhǔn)確地為臨床提供病原學(xué)依據(jù)是結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)、診斷的最重要步驟之一，是結(jié)核病防治的重要前提［2］。目前，結(jié)核病的病原學(xué)診斷主要依靠分枝桿菌的涂片法、培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)等傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)。涂片法靈敏度低、培養(yǎng)法耗時(shí)長，且不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，不能滿足臨床診療的需求，迫切需要引進(jìn)新技術(shù)優(yōu)化結(jié)核病的診斷。2018年5月開始實(shí)行的肺結(jié)核診斷指南中將結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)陽性作為結(jié)核病確診依據(jù)［3］。GeneXpert 系統(tǒng)使用實(shí)時(shí)定量PCR 原理，整合并自動(dòng)進(jìn)行樣品純化、核酸擴(kuò)增、單一或復(fù)雜樣品中的目標(biāo)序列測(cè)定。GeneXpert系統(tǒng)使用一次性的Xpert檢測(cè)匣，檢測(cè)匣內(nèi)裝有PCR 反應(yīng)試劑，可獨(dú)立進(jìn)行PCR處理。該試劑盒采用自成一體的封閉設(shè)計(jì)，使得樣品之間的交叉污染減小到最低。GeneXpert 技術(shù)已在多個(gè)國家和地區(qū)應(yīng)用，并被世界衛(wèi)生組織推薦為結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性的檢測(cè)方法［4-5］。本研究利用GeneXpert 法對(duì)766 份不同類型的臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并用傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色鏡檢法進(jìn)行同步檢測(cè)，比較兩者對(duì)不同標(biāo)本類型檢測(cè)陽性率的差異性，其中460 份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GeneXpert 的陽性率明顯高于其他方法。

1 材料和方法

1.1 材料

標(biāo)本來自2018 年2—7 月于南京市第二醫(yī)院就診的結(jié)核及疑似結(jié)核患者766 例，男517 例，女249例，年齡7～92 歲。其中痰標(biāo)本473 例，灌洗液185例，胸腹水61例，其他標(biāo)本包括尿液、腦脊液、大便、膿液等47 例。分別對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行直接涂片抗酸染色鏡檢法檢測(cè)和GeneXpert檢測(cè)，其中有460例標(biāo)本同步進(jìn)行960 分枝桿菌快速培養(yǎng)，有106 例培養(yǎng)陽性的樣本進(jìn)行了初步菌種鑒定。

GeneXpert 檢測(cè)儀器及配套試劑（Cepheid 公司，美國），BACTECTMMGITTM960 分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑（BD公司，美國），分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基、抗酸染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），Olympus CX23顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 直接涂片抗酸染色鏡檢法

取標(biāo)本于玻片正面均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形薄膜，自然干燥后，置于染色架上，玻片間距保持10 mm 以上；加熱固定（5 s 內(nèi)將玻片來回過火焰4 次）；滴加石碳酸復(fù)紅溶液蓋滿玻片，加熱至出現(xiàn)蒸汽后，停止加熱，保持染色5 min，加熱時(shí)勿使染色液沸騰。流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染液，瀝干；滴加酸性酒精溶液蓋滿玻片，脫色1～2 min；如有必要，需流水沖去酸性酒精溶液后，再次脫色至無可視紅色為止；流水自玻片一端輕緩沖洗10～20 s，沖去酸性酒精溶液，瀝干；滴加亞基藍(lán)溶液染30～60 s；流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染液，瀝干，100 倍油鏡觀察，在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色。觀察結(jié)果按規(guī)程要求進(jìn)行報(bào)告［6］。

1.2.2 GeneXpert法

痰標(biāo)本：取1 mL 痰標(biāo)本放置到旋蓋錐形管中，加入2 mL 樣本處理液，使用渦旋儀震蕩10 s，室溫靜置10 min；再次使用渦旋儀震蕩10 s，室溫靜置5 min，直至痰液充分液化，取2 mL完全液化的樣本緩慢加入檢測(cè)匣的加樣孔中，使用GeneXpert 儀器進(jìn)行檢測(cè)。

灌洗液：將灌洗液（多于5 mL）轉(zhuǎn)移至錐形離心管中，3 000g離心15 min，棄上清，加入2 mL樣本處理液并渦旋震蕩，重懸沉淀物，充分混勻，將2 mL經(jīng)過處理的樣本加入試劑匣，GeneXpert進(jìn)行檢測(cè)。

胸腹水：將EDTA 抗凝管收集的胸腹水轉(zhuǎn)移至錐形離心管中，3 000g離心15 min，棄上清，加入2 mL樣本處理液并渦旋震蕩，重懸沉淀物，充分混勻，將2 mL 經(jīng)過處理的樣本加入試劑匣，GeneXpert 進(jìn)行檢測(cè)。

GeneXpert 檢測(cè)結(jié)果通過GeneXpert System 測(cè)量熒光信號(hào)和內(nèi)設(shè)的算法來判定，由系統(tǒng)直接報(bào)告結(jié)果，并在“預(yù)覽結(jié)果”窗口顯示。較低的CT值代表了較高的DNA模板起始濃度；較高的CT值代表了較低的DNA模板起始濃度。

1.2.3 960分枝桿菌快速培養(yǎng)

痰液、灌洗液：標(biāo)本使用《大眾健康真菌生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)室Ⅲ級(jí)指南》中推薦的NALC-NaOH 方法進(jìn)行處理。

體液：用無菌方法采集的標(biāo)本，即使不經(jīng)過凈化處理也不會(huì)有其他細(xì)菌被接種到培養(yǎng)管中。若預(yù)計(jì)標(biāo)本中包含其他雜菌，則標(biāo)本必須經(jīng)過凈化處理。

糞便：挑取1 g 糞便放入5 mL 無菌生理鹽水中制備成懸濁液，將懸濁液放在渦旋器上渦旋震蕩5 s，再使用《大眾健康真菌生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)室Ⅲ級(jí)指南》中推薦的NALC-NaOH方法處理標(biāo)本。

標(biāo)本處理15～20 min 后，加pH 值為6.8 的磷酸鹽緩沖溶液將經(jīng)過處理的標(biāo)本混合液稀釋至50 mL。以3 000g離心15 min 后棄上清，然后使用磷酸鹽緩沖溶液1～3 mL 復(fù)溶沉淀物制成懸液，在BBLTMMGITTM分枝桿菌7 mL 培養(yǎng)管中加入0.5 mL懸液，并將1 滴（0.1 mL）懸液加入到分枝桿菌固體培養(yǎng)基上。將BBLTMMGITTM分枝桿菌培養(yǎng)管放入BACTECTMMGITTM960分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)儀器，培養(yǎng)管在儀器推薦的42 d 培養(yǎng)周期內(nèi)將被自動(dòng)檢測(cè)。將陽性培養(yǎng)管從儀器中取出，使用快速酸涂片染色法進(jìn)行復(fù)核，觀察涂片和培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.4 分枝桿菌絕對(duì)濃度法藥物敏感性試驗(yàn)和菌種初步鑒別試驗(yàn)

取培養(yǎng)陽性的分枝桿菌，調(diào)整至規(guī)定濃度，根據(jù)需要接種到相應(yīng)型號(hào)的羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)28 d，如對(duì)照培養(yǎng)基上分枝桿菌生長良好，則根據(jù)對(duì)硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）2種鑒別培養(yǎng)基上分枝桿菌生長情況按規(guī)定報(bào)告初步鑒別試驗(yàn)結(jié)果。如果2種鑒別培養(yǎng)基上均無分枝桿菌生長報(bào)告為牛結(jié)核分枝桿菌，如果2 種鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長報(bào)告為非結(jié)核分枝桿菌，如果PNB 培養(yǎng)基上無分枝桿菌生長而TCH 培養(yǎng)基有分枝桿菌生長報(bào)告為人型結(jié)核分枝桿菌。本文對(duì)藥敏結(jié)果不做討論。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和構(gòu)成比或率（%）進(jìn)行描述，兩種檢測(cè)方法比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 766例標(biāo)本GeneXpert與涂片法檢測(cè)結(jié)果比較

766 例標(biāo)本分別使用直接涂片抗酸染色鏡檢法和GeneXpert 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，其中涂片法和GeneXpert 法均為陽性的有157 例，涂片法陽性GeneXpert 陰性的有27 例，涂片陰性GeneXpert 陽性的有150 例，兩種方法均為陰性的有432 例（表1）。計(jì)算得出涂片法的陽性率為24.0%，GeneXpert法的陽性率為40.1%，兩者比較，χ2=85.47，P＜0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GeneXpert 法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的總體陽性率高于涂片法。涂片法和GeneXpert 聯(lián)合檢測(cè)766 例標(biāo)本，合并陽性率為43.6%，高于兩種方法單獨(dú)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的檢出率。

表1 766例標(biāo)本GeneXpert與涂片檢測(cè)結(jié)果比較（n）

2.2 不同標(biāo)本類型GeneXpert與涂片法檢測(cè)結(jié)果比較

473 例痰液的涂片陽性率為29.4%，GeneXpert陽性率39.1%，χ2=24.60，P＜0.01；185例灌洗液涂片陽性率為21.1%，GeneXpert 陽性率為53.0%，χ2=47.68，P＜0.01；61 例胸腹水涂片陽性率為3.3%，GeneXpert 陽性率為19.7%，χ2=8.10，P＜0.01；47 例其他標(biāo)本類型（包括尿液、腦脊液、糞便、膿液等）的涂片陽性率為8.5%，GeneXpert 陽性率為25.5%，χ2=6.13，P＜0.05；各種標(biāo)本類型使用兩種檢測(cè)方法得出的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 不同類型標(biāo)本GeneXpert與涂片檢測(cè)結(jié)果的比較

2.3 460例標(biāo)本GeneXpert與涂片法、培養(yǎng)法的結(jié)果比較

460 例標(biāo)本同步進(jìn)行3 種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，涂片法的陽性率為28.5%（131/460），GeneXpert的陽性率為47.0%（216/460），培養(yǎng)法的陽性率為35.4%（163/460）。涂片法與GeneXpert 比較，χ2=55.15，P＜0.01；GeneXpert 與培養(yǎng)法比較，χ2=21.12，P＜0.01；培養(yǎng)法與涂片法比較，χ2=13.12，P＜0.01；3種方法之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且涂片法與GeneXpert 之間的差異高于GeneXpert 與培養(yǎng)法和培養(yǎng)法與涂片法之間的差異。

對(duì)上述培養(yǎng)陽性的106 例樣本進(jìn)一步用分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行菌種初步鑒定試驗(yàn)，得出25 例為非結(jié)核分枝桿菌，81 例為結(jié)核分枝桿菌。25 例非結(jié)核的GeneXpert 和涂片結(jié)果分別是：GeneXpert 陽性2 例，陰性23 例；涂片陽性15例，陰性10 例。81 例結(jié)核的GeneXpert 和涂片結(jié)果分別是：GeneXpert 陽性77 例，陰性4 例；涂片陽性58 例，陰性23 例。由此可得GeneXpert 法的靈敏度和特異度分別為95.1%（77/81）、92.0%（23/25），涂片法的靈敏度和特異度分別為71.6%（58/81）、40.0%（10/25）。

3 討論

檢查結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法主要有抗酸染色鏡檢法和培養(yǎng)法。鏡檢法雖簡(jiǎn)單、價(jià)廉，但其對(duì)標(biāo)本的采集和標(biāo)本含菌量的濃度要求比較高，標(biāo)本含菌量在5 000～10 000 條/mL 才可檢出陽性，故其靈敏度較低，并且無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。再者，人為因素會(huì)影響涂片鏡檢的質(zhì)量，容易造成漏診和誤診。培養(yǎng)法較抗酸染色鏡檢法靈敏度和特異度都高，是目前診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法之一，但其培養(yǎng)過程需1～2個(gè)月，不能滿足臨床快速診斷的需求，并且對(duì)標(biāo)本的前處理要求較高，存在一定的污染率［7］。新版的肺結(jié)核診斷指南中將結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)陽性作為病原學(xué)陽性的診斷依據(jù)［3］，因此許多分子生物學(xué)方法如GeneXpert、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、線性探針技術(shù)（HAIN）等在結(jié)核病的診斷中得到了應(yīng)用［8］。GeneXpert 用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥具有操作簡(jiǎn)單（僅需1 個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作）、快速（110 min 就能同時(shí)報(bào)告結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥的結(jié)果）和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［9-10］。

GeneXpert系統(tǒng)可檢測(cè)的樣本類型有痰液、胸腹水、肺泡灌洗液、腦脊液、胃液、手術(shù)組織、關(guān)節(jié)膿液、尿液、大便等。本文對(duì)766例不同標(biāo)本類型分別用涂片法和GeneXpert 法進(jìn)行檢測(cè)，檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率GeneXpert 法明顯高于涂片法。對(duì)其中460例標(biāo)本同步進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示GeneXpert法陽性率明顯高于培養(yǎng)法，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)法只能檢測(cè)出活菌，其對(duì)樣品的采集和前處理有較高的要求。分別對(duì)痰液、灌洗液、胸腹水及其他標(biāo)本類型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GeneXpert 法的陽性率均明顯高于涂片法，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌洗液、胸腹水相對(duì)于痰液，GeneXpert陽性率與涂片法陽性率的差異更大，這可能是由于本研究在對(duì)灌洗液、胸腹水進(jìn)行直接涂片時(shí)未離心，而進(jìn)行GeneXpert 檢測(cè)使用的是離心之后的標(biāo)本，未離心樣本中結(jié)核桿菌濃度低于離心后樣本?？傊?，檢測(cè)痰液、灌洗液、胸腹水及其他標(biāo)本類型中的結(jié)核桿菌，GeneXpert法比涂片法的敏感性更高。若將GeneXpert 法與涂片法聯(lián)合使用，能進(jìn)一步提高結(jié)核桿菌的檢出率，對(duì)于結(jié)核病的快速診斷和早期防控具有重要意義。

本文對(duì)106例培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行了初步的菌種鑒定，比較其GeneXpert 法與涂片法結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GeneXpert 法對(duì)于鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確度可達(dá)92%以上，與培養(yǎng)法菌種鑒定結(jié)果符合率很高。涂片陽性GeneXpert 陰性的27 例，其中包括20 例痰標(biāo)本和7 例灌洗液，經(jīng)分子生物學(xué)方法或培養(yǎng)法鑒定，其中17例痰液和5例灌洗液為非結(jié)核分枝桿菌，5例未經(jīng)鑒定。因?yàn)镚eneXpert系統(tǒng)只能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，而不能檢測(cè)非結(jié)核分枝桿菌，這就提示臨床醫(yī)生涂片陽性且GeneXpert 陰性的患者可能為非結(jié)核分枝桿菌感染，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行非結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)檢查，以便及時(shí)調(diào)整治療方案［11］。同時(shí)本研究也存在一定的局限性，首先，未對(duì)所有的研究標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核培養(yǎng)，僅有106 例培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行了初步菌種鑒定，無法全面反映GeneXpert法的準(zhǔn)確性；其次，本文中作為金標(biāo)準(zhǔn)的羅氏培養(yǎng)基初步菌種鑒定試驗(yàn)無法排除結(jié)核桿菌與非結(jié)核分枝桿菌混合感染的情況，因此當(dāng)初步菌種鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌且GeneXpert 法陽性時(shí)，無法判斷GeneXpert 法為假陽性，因此本文獲得的GeneXpert法特異度指標(biāo)可能存在誤差。

目前GeneXpert 技術(shù)在我國正處于推廣階段，但其昂貴的經(jīng)濟(jì)成本成為患者和醫(yī)務(wù)工作者不得不考慮的因素，也制約了該項(xiàng)技術(shù)的大力推廣，并且GeneXpert 無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌是否為活菌，所以還需分枝桿菌培養(yǎng)等方法進(jìn)行聯(lián)合診斷，以獲得更為全面的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。