大米低聚肽的制備和結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化作用

劉文穎 馮曉文 程青麗 王卓然 谷瑞增

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；3.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

我國約有60%的人口以大米為主要糧食，其中2021年1月至4月我國累計進口大米192萬噸，同比增加155.2%，創(chuàng)我國階段性大米進口的歷史紀(jì)錄[1- 2]。大米蛋白主要是大米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也可從米糠和碎米中直接提取[3]。大米蛋白營養(yǎng)豐富，含人體必需的各種氨基酸，其氨基酸組成平衡、合理，接近“完全蛋白”，生物價高達77%，與蝦仁、牛肉等相似[4]。此外，與其他谷物蛋白質(zhì)相比，大米蛋白還具有低過敏性、不含抗?fàn)I養(yǎng)因子、消化率高、無色素干擾及味道柔和等特點[3- 4]。近年來，從動植物蛋白質(zhì)中獲取生物活性肽成為食品科學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點。通過采用溫和的酶法水解大米蛋白制備大米肽，可以提高大米蛋白附加值，實現(xiàn)對大米蛋白的精深加工與利用，并且有效改善其功能屬性，更易消化吸收[5- 6]。

人體過多的自由基會造成機體功能紊亂，導(dǎo)致多種疾病，如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、動脈硬化等。人工合成抗氧化劑如BHA(丁基羥基茴香醚)、BHT(2，6- 二叔丁基- 4- 甲基苯酚)、TBHQ(叔丁基對苯二酚)等雖然具有很強的抗氧化活性，但長期服用會對機體產(chǎn)生毒副作用。作為天然安全的生物抗氧化劑，抗氧化活性肽能夠減少自由基，抑制或消除氧化反應(yīng)，降低自動氧化速率和脂肪的過氧化物含量，保護細(xì)胞抵御自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，從而達到抗衰老的功能[7]。與化學(xué)抗氧化劑相比，動植物來源的抗氧化活性肽安全性高、無毒副作用，作為天然抗氧化劑在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有強大的競爭力，是研究人員探索最多的一種生物活性肽。目前已報道了烏雞、雞蛋、牛奶、大豆等多種蛋白來源活性肽的抗氧化作用，并且有研究表明抗氧化肽的活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[7- 9]。目前，關(guān)于大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的系統(tǒng)、全面研究還鮮見報道。

本研究以大米蛋白粉為原料，經(jīng)生物酶解、分離純化等步驟制得大米低聚肽，在對其基礎(chǔ)理化成分分析的基礎(chǔ)上，利用相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、掃描電鏡、紫外光譜和圓二色光譜分析進行結(jié)構(gòu)表征，然后通過羥基自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)和還原能力4種不同的體外抗氧化評價體系考察其體外抗氧化作用，旨在為大米低聚肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白粉，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；堿性蛋白酶(≥400 000 DU/g)、中性蛋白酶(≥1 600 AU/g)，購自杜邦丹尼斯克公司；FRAP測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、Trolox(水溶性維生素E)，均購自美國Sigma公司；其他分析純試劑，購自北京化工廠。

UV- 1780紫外可見分光光度計，日本SHIMADZU公司生產(chǎn)；Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，美國DYNEX公司生產(chǎn)；LC- 20A高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司生產(chǎn)；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司生產(chǎn)；A300全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司生產(chǎn)；QSY- Ⅱ型凱式定氮儀，北京強盛分析儀器制造中心生產(chǎn)；HH- 501型超級恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司生產(chǎn)；DHG- 9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸?？萍加邢薰旧a(chǎn)；LG10- 2.4A型高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米低聚肽的制備

稱取500 g大米蛋白粉，溶解于蒸餾水中，然后置于50 ℃水浴鍋中，調(diào)節(jié)pH值至8.5，之后加入堿性蛋白酶4.0 g，酶解2 h后，調(diào)節(jié)水解液pH值為6.0，然后加入中性蛋白酶4.2 g，繼續(xù)酶解2 h。期間用0.1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)水解液，使pH值保持不變。酶解結(jié)束后在100 ℃沸水浴條件下滅酶，冷卻至室溫后，6 000g離心10 min，取上清液，用孔徑為200 nm的陶瓷膜過濾，取濾過清液，然后用截留相對分子質(zhì)量為1 000的超濾膜超濾，得到相對分子質(zhì)量小于1 000的濾過液，之后將溶液濃縮并冷凍干燥，得到大米低聚肽粉[10]。

1.2.2 基礎(chǔ)理化成分測定

參照相關(guān)國標(biāo)方法，即按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法測定蛋白質(zhì)含量，按GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的方法測定酸溶蛋白含量，按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的方法測定脂肪含量，按GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的方法測定水分含量，按GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》中的方法測定灰分含量。

1.2.3 大米低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 氨基酸組成測定

按照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中的方法，采用全自動氨基酸分析儀對大米低聚肽的水解氨基酸和游離氨基酸組成進行分析。測定大米低聚肽的水解氨基酸含量時，大米低聚肽的水解方法為：稱取0.1 g大米低聚肽樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液和3滴苯酚，然后充氮氣3 min，封口；放在110 ℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱內(nèi)，水解22 h后取出，冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶內(nèi)，用水定容至相應(yīng)刻度，振蕩混勻。準(zhǔn)確吸取0.2 mL濾液，使用氮吹儀吹干，加入1 mL稀釋液復(fù)溶，振蕩混勻后，吸取溶液通過0.22 μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至儀器進樣瓶，供測定使用。

1.2.3.2 相對分子質(zhì)量分布的測定

利用流動相配制質(zhì)量濃度為1 g/L的樣品溶液，經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進行凝膠過濾，通過紫外檢測器進行檢測，使用GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過膜后進樣，制作相對分子質(zhì)量校正曲線。4種肽標(biāo)準(zhǔn)品為：乙氨酸- 乙氨酸- 乙氨酸(相對分子質(zhì)量為189)、乙氨酸- 乙氨酸- 酪氨酸- 精氨酸(相對分子質(zhì)量為451)、桿菌酶(相對分子質(zhì)量為1 450)、細(xì)胞色素C(相對分子質(zhì)量為12 500)。色譜條件為：色譜柱，TSKgel G2000 SWXL型，300 mm×7.8 mm；流動相，體積比V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)為45：55：0.1；流速，0.5 mL/min；進樣體積，10 μL；檢測波長，220 nm；柱溫，30 ℃[11]。

1.2.3.3 掃描電鏡分析

將大米低聚肽干粉樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后進行氮吹處理。處理好的樣品放入掃描電鏡中抽真空，施加一定的電壓，調(diào)整束斑尺寸，待聚焦清晰后分別在500倍和1 000倍下獲取圖像，觀察它們的區(qū)別[12]。

1.2.3.4 紫外光譜掃描

將大米低聚肽配制成2.0 g/L的溶液，利用紫外可見分光光度計進行紫外光譜掃描，掃描波長為245～330 nm[11]。

1.2.3.5 圓二色光譜掃描

稱取大米低聚肽于超純水中，配制成1.0 g/L的溶液，進行圓二色光譜掃描。步長為0.2 nm，帶寬為2.0 nm，光譜范圍為190～250 nm，掃描速度為200 nm/min。從每個光譜中減去緩沖液的基線光譜，并使用Jasco軟件內(nèi)置的分析函數(shù)將得到的值轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率(θ)[12]。

1.2.4 大米低聚肽的體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 羥基自由基清除能力測定

采用水楊酸法[13]，依次加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、200 μL 5 mmol/L水楊酸乙醇溶液、200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，實驗組(吸光值為AX)以100 μL 5 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)；對照組(吸光值為A0)以等體積蒸餾水啟動反應(yīng)；空白對照組(吸光值為A1)以等體積蒸餾水代替樣品。渦旋振蕩，37 ℃反應(yīng)1 h后取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，在510 nm處測定吸光值。羥基自由基清除率(η，%)的計算如下：

(1)

將7.5 mL TPTZ(三吡啶基三嗪)稀釋液和750 μL TPTZ溶液充分混勻后加入750 μL檢測緩沖液，配制成FRAP工作液，于37 ℃孵育備用。在96孔板的檢測孔中加入180 μL FRAP工作液，空白對照孔中加入5 μL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL各種濃度(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL樣品溶液，輕輕混勻。37 ℃孵育5 min后于593 nm處測定吸光值，結(jié)果表示為mmol/L(以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)品計)[14]。

1.2.4.3 ORAC值測定

將25 μL樣品溶液和100 μL的Fluorescein(0.8 μmol/L)于96孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L偶氮類化合物AAPH啟動反應(yīng)，此為實驗組。分別用25 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(6.25、12.5、25、50、100、250、500 μmol/L)代替樣品作為陽性對照(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)、25 μL磷酸緩沖液(pH=7.4，75 mmol/L)代替樣品為空白對照，于37 ℃保溫20 min，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，每隔5 min測定一次，測定總時間為120 min；另外做不加AAPH的對照。根據(jù)樣品的熒光衰退曲線的保護面積和標(biāo)準(zhǔn)品的熒光衰退曲線的保護面積之比計算樣品的ORAC值，結(jié)果表示為μmol/g(以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品計)[15]。

1.2.4.4 還原能力測定

反應(yīng)體系為100 μL樣品溶液、100 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀，50 ℃水浴中保溫20 min后，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸。取100 μL反應(yīng)液，加入100 μL蒸餾水和20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，放置10 min后，于700 nm下測定吸光值[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3次，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

大米低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為95.75%±1.72%，脂肪含量為0.20%±0.02%，灰分含量為2.46%±0.13%，水分含量為5.17%±0.15%。酸溶蛋白質(zhì)含量為92.27%±1.08%，占總蛋白質(zhì)的96.39%±2.03%，游離氨基酸含量為3.16%±0.20%，經(jīng)計算，低聚肽含量為89.11%±0.94%。由此可見，大米低聚肽蛋白質(zhì)含量較高，其他成分含量很低，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

第二天晚上，見到爸爸進入洗澡間后，皮皮在門外耐心等待，見爸爸一直不開門，又開始哭鬧，皮皮媽力挺女兒，皮皮爸終于打開了門。女兒一看，大哭：“嗚……我不要你穿游泳褲洗澡，脫掉脫掉！嗚……”皮皮爸低頭，一言不發(fā)，滿臉通紅，憋了足足1分鐘后脫下游泳褲。女兒仔細(xì)觀察爸爸私處，然后用手摸摸，說道：“哦，原來是這樣的啊，早給我看不就完了嘛?！闭f完滿意地離開，從此不再騷擾爸爸洗澡了。

2.2 大米低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 大米低聚肽的氨基酸組成

大米低聚肽的氨基酸組成(以100 g大米低聚肽為基準(zhǔn))如表1所示。大米低聚肽中谷氨酸、天門冬氨酸和精氨酸含量較高，總含量為33.00 g，而色氨酸、胱氨酸和蛋氨酸含量較低，總含量僅為3.23 g。大米低聚肽含有8種必需氨基酸，總含量為24.98 g，占氨基酸總和的30.56%。第一限制性氨基酸賴氨酸含量為3.31 g，較為豐富，具有較高的營養(yǎng)價值。

表1 大米低聚肽的氨基酸組成

1)以100 g大米低聚肽為基準(zhǔn)。

大米低聚肽的抗氧化活性與其氨基酸組成特點有一定的相關(guān)性。研究表明，許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、色氨酸、丙氨酸等[17]。芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可作為抗氧化肽的活性位點，通過提供氫原子，使自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止[18]。大米低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸含量較高。疏水性氨基酸占氨基酸總和的33.24%，堿性氨基酸占16.10%，酸性氨基酸占31.01%，有報道證明，疏水性氨基酸及其殘基含量較多的肽呈現(xiàn)出較強的抗氧化作用[19- 20]。李佳南等[10]的研究表明，大米肽具有明顯的自由基淬滅能力和抑制亞油酸自然氧化的作用，氨基酸序列測定結(jié)果表明，其抗氧化作用與其氨基酸組成有關(guān)。

2.2.2 大米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布

由圖1可知，相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgMW=-0.212 630 9t+6.889 731，R2=0.996 566 9，其中MW為重均相對分子質(zhì)量，t為洗脫時間。相對分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖見圖2，經(jīng)計算得到大米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布，如表2所示。大米低聚肽為小分子肽段混合物，相對分子質(zhì)量分布主要集中在1 000以下，其占比高達91.84%。其中，相對分子質(zhì)量在150～1 000的小肽占85.66%，而1 000～2 000、2 000～3 000、3 000～5 000、>5 000的多肽占比分別為7.06%、0.91%、0.18%、0.01%，說明大米低聚肽的主要成分為1 000以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性與相對分子質(zhì)量大小有關(guān)。Dong等[21]使用截留相對分子質(zhì)量 5 000、3 000、1 000的超濾膜將牡蠣肽分離純化為不同組分，并考察了其抗氧化活性，結(jié)果表明相對分子質(zhì)量小于1 000的肽組分表現(xiàn)出最強的抗氧化活性。這與其他研究人員的研究結(jié)果一致，即低分子肽具有更強的抗氧化活性[22- 23]。本試驗中，大米低聚肽相對分子質(zhì)量小于 1 000 的小肽占90%以上，同時小肽還能產(chǎn)生離子化的氨基和羧基，可提供電子或氫原子抑制氧化反應(yīng)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[24]。

表2 大米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布

圖1 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 大米低聚肽相對分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.2 Gel filter chromatogram of relative molecular weight distribution of rice oligopeptides

2.2.3 掃描電鏡結(jié)果與分析

大米低聚肽的掃描電鏡圖見圖3。由圖可以看出，在500倍和1 000倍放大倍數(shù)下，大米低聚肽為明顯的球體顆粒狀，表面有不規(guī)則的褶皺和小的

(a)放大500倍

氣孔，這可能是由于酶解過程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，從而使粒徑變小，表面暴露出了更多的疏水性基團[25]。

2.2.4 紫外光譜分析

圖4 大米低聚肽的紫外光譜圖

2.2.5 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜檢測大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)，譜圖上的峰位和峰形顯示，大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存(見圖5)，大米低聚肽在198 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有負(fù)吸收，二級結(jié)構(gòu)主要為β- 折疊。利用CDNN軟件分析得到大米低聚肽各二級結(jié)構(gòu)的含量：α- 螺旋含量為6.0%±0.3%，平行式β- 折疊的為3.3%±0.2%，反平行式β- 折疊的為40.2%±1.9%，β- 轉(zhuǎn)角的為19.5%±1.0%，無規(guī)則卷曲的為32.1%±2.5%。與蛋白質(zhì)相比，肽的結(jié)構(gòu)較為簡單，主要具有肽鏈一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)[27]。大米低聚肽中緊密且沒有空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)即α- 螺旋結(jié)構(gòu)含量較少，β- 折疊及無規(guī)則卷曲含量較多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性變大[28]。這可能是由于酶解使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)無序結(jié)構(gòu)含量相對較高，β- 折疊和無規(guī)則卷曲增加，使得隱藏在內(nèi)部的疏水性位點更多地顯露出來，從而發(fā)揮特定的功能作用[29]，這可能也是大米低聚肽表現(xiàn)出一定抗氧化能力的原因所在。

圖5 大米低聚肽的圓二色光譜圖

2.3 大米低聚肽的體外抗氧化作用

2.3.1 大米低聚肽的羥基自由基清除能力

大米低聚肽和陽性對照Vc的羥基自由基清除能力如圖6所示。在質(zhì)量濃度0～25 g/L范圍內(nèi)，大米低聚肽對羥基自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為25 g/L時，清除率為83.35%±2.53%，可見其對羥基自由基有很強的清除作用，半抑制濃度(IC50值)約為11.1 g/L。這表明大米蛋白被酶解成低聚肽后，能夠暴露更多的活性基團或位點，作為供氫體還原自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，呈現(xiàn)出抗氧化能力[21]。Vc對羥基自由基的清除率先迅速增加，然后趨于平緩，IC50值約為0.07 g/L。大米低聚肽的羥基自由基清除能力弱于強抗氧化劑Vc，但是作為一種天然的功能活性物質(zhì)，其安全性高，且無潛在毒副作用。趙佳佳[30]考察了大米肽的抗氧化能力，結(jié)果表明，大米肽的羥基自由基清除能力也與質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，其IC50值為12.01 g/L，稍弱于本研究中大米低聚肽的清除能力。

(a)大米低聚肽

2.3.2 大米低聚肽的鐵離子還原能力

利用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。大米低聚肽和Vc的FRAP值見圖8。在質(zhì)量濃度10～30 g/L范圍內(nèi)，大米低聚肽的FRAP值與其質(zhì)量濃度呈明顯的正比關(guān)系，F(xiàn)RAP值隨質(zhì)量濃度的增加而增加。這表明大米低聚肽能夠通過氫原子轉(zhuǎn)移阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程而實現(xiàn)抗氧化作用[31]。Vc在較低的質(zhì)量濃度(0.015～0.08 g/L)下就能展示出較強的鐵離子還原能力。雖然大米低聚肽的FRAP值明顯低于Vc在各質(zhì)量濃度下的FRAP值(P<0.05)，但與其他抗氧化肽的FRAP值相近[14]。張文敏等[32]以亞麻籽粕為原料，通過不同蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽，結(jié)果表明，分子質(zhì)量較低的亞麻籽粕肽的FRAP值較高，這可能是由于其包含某些活性氨基酸序列，或者具有大量疏水區(qū)的肽段特定結(jié)構(gòu)，從而提高了抗氧化活性。

圖7 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

(a)大米低聚肽

(b)Vc

2.3.3 大米低聚肽的氧自由基吸收能力

Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的動態(tài)熒光衰減曲線見圖9，由此繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算大米低聚肽和Vc的ORAC值，分別為(498.88±18.29)、(976.42±33.42)μmol/g，可見大米低聚肽的氧自由基吸收能力約為Vc的50%。盡管大米低聚肽的氧自由基吸收能力不如Vc強，但大米低聚肽作為天然抗氧化物質(zhì)，已表現(xiàn)出較強的氧自由基吸收能力，具有很高的利用價值。推測可能由于大米蛋白酶解后，空間構(gòu)型、氨基酸組成和分子空間排列等發(fā)生變化，原先包埋于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的抗氧化性氨基酸斷裂成末端氨基酸或折疊肽段暴露出來，釋放出具有抗氧化活性的小肽，產(chǎn)生離子化的氨基或羧基等供氫體，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，達到清除或抑制自由基的目的[33]。

圖9 不同濃度Trolox的動態(tài)熒光衰減曲線Fig.9 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖10 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 大米低聚肽的還原能力

圖11給出了大米低聚肽和Vc的還原能力，由圖可見，大米低聚肽和Vc的吸光值均隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，吸光值越大，還原能力越強，抗氧化活性就越強。這表明大米低聚肽是良好的電子供體，具有一定的抗氧化能力。賈俊強等[34]通過中性蛋白酶酶解大米蛋白制備大米肽，并研究了其還原能力，與本研究結(jié)果相似，大米肽的還原能力與其質(zhì)量濃度成正比，質(zhì)量濃度為1.0 g/L時吸光值約為0.085。曹輝等[35]以大米蛋白為原料，利用木瓜蛋白酶進行酶解，制備出大米肽，考察其還原能力，結(jié)果表明在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時吸光值約為0.09。本研究中大米低聚肽的還原能力均高于上述實驗獲得的大米肽。由于大米低聚肽具有原料易得、成本低等優(yōu)點，因此作為天然安全的抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

(a)大米低聚肽

3 結(jié)語

通過二步法制備的大米低聚肽蛋白質(zhì)和肽含量較高，具有良好的羥基自由基清除能力、鐵離子還原能力、氧自由基吸收能力和還原能力，是一種有效的抗氧化活性肽。大米低聚肽富含亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等抗氧化性氨基酸，主要成分為相對分子質(zhì)量1 000以下的小肽。產(chǎn)物為明顯的球體顆粒狀，表面有不規(guī)則褶皺和氣孔，在270 nm波長處有最大吸收峰；二級結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，主要為β- 折疊。后續(xù)研究將通過離子色譜、反相高效液相色譜、凝膠色譜等方法分離純化大米低聚肽，鑒定高活性的抗氧化肽段，進一步明確大米低聚肽的抗氧化功能構(gòu)效關(guān)系和作用機理。